專利名稱：一種加壓素v1受體穩(wěn)定表達細胞系的建立及其在藥物篩選中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域和醫(yī)藥技術領域，具體涉及ー種加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系及其在藥物篩選中的應用。
背景技術：
充血性心カ衰竭(congestive heart failure, CHF)是指心肌收縮カ減弱而引起循環(huán)充血的疾病，表現為在心臟受到損害或超負荷工作的狀態(tài)下，心臟不能有效地輸出從體液循環(huán)回流的血液，導致心臟容量増加；同時腎臟功能發(fā)生障礙，水和納的排泄減弱，導致水腫和低鈉血癥，為CHF病人病情惡化的原因之一，嚴重影響病人的預后，使病人的死亡率增加60%。目前臨床上對CHF還沒有很好的治療藥物，現有藥物可通過增加心血收縮ヵ等來緩解重狀，延長生命。研究發(fā)現，體內加壓素的過量分泌是CHF病人并發(fā)低鈉血癥的病 理之一，從而降低加壓素的濃度或拮抗它對腎臟的作用成為治療充血性心力衰竭和低鈉血癥的研究方向。加壓素又稱為抗利尿激素(antidiuretic hormone, ADH),是腦垂體分泌的一種環(huán)肽類激素，在人體調節(jié)游離水的重吸收、體液的等滲濃度、血液容積、血壓、細胞收縮、細胞増殖和腎上腺皮質激素的分泌等方面扮演重要角色，它的這些生理作都是通過與加壓素受體結合而產生的。加壓素受體屬于G蛋白偶聯受體超家族(G-protein coupled protein,GPCR)，根據受體偶聯的第二信使的不同可分為3種亞型V1 (或Via)、V2和V3 (或Vlb)。其中Vl受體偶聯于磷酸肌醇信號傳導路徑，細胞內的Ca2+作為第二信使。Vl受體主要分布在血管平滑肌、肝細胞和血小板中，參與血管收縮、血小板聚集和肝糖元分解。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系的制備方法。本發(fā)明提供的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系的制備方法，包括以下步驟I)將加壓素Vl受體基因的編碼序列插入到真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體；2)將步驟I得到的重組表達載體導入宿主細胞中，篩選得到穩(wěn)定表達加壓素Vl受體的細胞系。上述真核表達載體具體可為pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。為了便于對表達的加壓素Vl受體進行細胞定位，可在真核表達載體上加入能于宿主中表達并產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。上述宿主細胞可為Hela細胞、MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞等。利用上述方法制備的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種篩選預防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物的細胞模型。
實驗證明，本發(fā)明的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞株對加壓素Vl受體阻斷劑和加壓素Vl受體抗體敏感，作用顯著。本發(fā)明的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系為深入探索加壓素Vl受體在血栓形成的作用提供實驗技術平臺，可用于篩選預防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物。


圖I為重組表達載體pTagLite-Snap-AVPRl的構建流程2為各穩(wěn)定表達加壓素Vl受體細胞系的加壓素Vl受體表達量實驗結果圖3為加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系對加壓素Vl受體抑制劑的敏感性分析實驗結果
具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進ー步說明，實施例僅為解釋性的，絕不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系的具體構建流程如圖I所示。實施例I.重組真核表達載體pTagLite-Snap-AVPRl的構建下述實驗過程中所用的DNA引物由上海生エ生物技術有限公司合成。根據加壓素Vl受體蛋白編碼框的cDNA序列，設計PCR引物如下正向引物5’-ACTGATATCATGCGTCTCTCCGCCGGTCCCGACG-3> (下劃線處為限制性內切酶的識別位點);反向引物5' -AACGAGCTCAGTTGAAACAGGAATGAATTTGATG-3 '(下劃線處為限制性內切酶的識別位點)。取人臍靜脈內皮細胞HUVEC并提取總RNA，將其反轉成cDNA，以該cDNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，用限制性內切酶EcoRV和Xho I對純化回收后的產物進行酶切，酶切產物再次進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，得到加壓素Vl受體蛋白編碼框的cDNA序列。同時，將真核表達載體pTagLite-Snap (購自Cisbio公司)也用EcoRV和Xho I進行雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收。用DNA連接酶連接上述擴增得到的加壓素Vl受體蛋白編碼框的cDNA序列和真核表達載體pTagLite-Snap酶切后的產物,連接產物轉化大腸桿菌(E. coli Top10)感受態(tài)細胞，并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單克隆進行PCR檢測。對PCR產物進行測序，以檢測陽性克隆中插入序列的正確。測序結果表明，插入的1254bp的加壓素Vl受:體蛋白編碼框的cDNA序列與GenBank AccessionNumber NM 000706. 3的自5'端第1975位-第3228位的序列一致。將得到的重組表達載體命名為pTagLite-Snap-AVPRl受體。實施例2.加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系的建立將上述步驟一得到的重組大腸桿菌利用Wizard Plus SV Minipreps (購自Promega)提取質粒,得到高純度的重組表達載體pTagLite-Snap-加壓素Vl受體,將重組表達載體 pTagLite-Snap-加壓素 Vl 受體利用 Lipofectamine 2000 (購自 Invitrogen)轉染HeLa細胞，繼續(xù)培養(yǎng)轉染后的HeLa細胞24小時以上。用G418(濃度為I μ g/ml)對重組HeLa細胞進行篩選，經多次篩選后，得到加壓素Vl受體的穩(wěn)定表達細胞系。將各株加壓素Vl受體穩(wěn)定表達的Hela細胞株保存于液氮中。選取四個加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞株，利用抗加壓素Vl受體的抗體(購自AbCam公司)進行蛋白免疫印跡實驗，結果如圖2所示。其中，A-D分別表示不同的ET2的穩(wěn)定表達細胞株的加壓素Vl受體表達量，Blank為轉入真核表達載體pTagLite-Snap的空白對照細胞，anti-Tubulin表示參照。結果表明，各加壓素Vl受體的穩(wěn)定表達細胞株均有不用程度的加壓素Vl受體表達。實施例3.加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞系對加壓素Vl受體抑制劑([d(CH2)5-Tyr2 (Me)] AVP)的敏感性分析·選用上述實施例2的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞、轉入真核表達載體pTagLite-Snap的細胞進行加壓素Vl受體抑制劑敏感性試驗。將加壓素Vl受體穩(wěn)定表達細胞、轉入真核表達載體PTagLite-Snap的細胞培養(yǎng)于DMEM+10 %胎牛血清的培養(yǎng)基里，將處于旺盛生長期的細胞(一般在傳代后20小時左右)經膜蛋白酶消化重懸后，進行細胞計數，以每孔IO3到IO4個細胞的量接種于96孔板中進行擴増，且每孔細胞數目均勻。24小時后，分別加入加壓素Vl受體抑制劑([d(CH2)5-Tyr2(Me)]AVP)。抑制劑([d(CH2)5-Tyr2 (Me)] AVP)的濃度分別為 10、20、30、40 和 50nM。而后按照 ET cell-basedAssay Kit(購自Cisbio)說明書進行HTRF (均相時間分辨熒光)實驗，在加入抑制劑后的細胞孔板中加入標記的ー抗和ニ抗，孵育30min后在sunrise酶標儀(TECAN公司產品)上于665和620nm波長處讀取吸光值，進行數據分析，具體結果如圖3所示。
權利要求
1.一種加壓素Vi穩(wěn)定表達細胞系的制備方法，包括以下步驟 1)將加壓素Vi的編碼基因插入真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體； 2)將步驟I得到的重組表達載體導入宿主細胞中，篩選得到穩(wěn)定表達加壓素Vl的細胞系O
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表達載體為pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為HeLa細胞、MDA-MB-231細胞或MCF-7細胞。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法制備的加壓素Vl穩(wěn)定表達細胞系。
5.根據權利要求4所述的加壓素Vl穩(wěn)定表達細胞系，其特征在于，所述加壓素Vl穩(wěn)定表達細胞系為SNAP-加壓素Vl穩(wěn)定表達的HeLa細胞系。
6.權利要求4-5中任一項所述的加壓素Vl穩(wěn)定表達細胞系在篩選預防和/或治療針對此靶點藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供的加壓素V1受體穩(wěn)定表達細胞系的制備方法，從而提供一種篩選預防和/或治療高血壓、缺血性心臟病的藥物的細胞模型。
文檔編號C12N5/10GK102827872SQ20111016143
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2011年6月16日
發(fā)明者譚初兵, 徐為人 申請人:天津藥物研究院