專利名稱：具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的毛頭鬼傘漆酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的毛頭鬼傘漆酶及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
毛頭鬼傘(Coprinus comatus)，又稱雞腿菇，其分類地位隸屬于擔(dān)子菌門、層菌綱、傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬。毛頭鬼傘是一種質(zhì)地脆而滑、口感鮮美的食用菌，在我國和歐洲國家都有食用的傳統(tǒng)。毛頭鬼傘具有高蛋白、低脂肪等優(yōu)良特性，兼具有食藥同源的作用。據(jù)分析，每IOOg干品中含粗蛋白25. 4g、脂肪3. 3g、總糖58. Sg、纖維7. 3g、灰分12. 5g， 含有20種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸全部具備，毛頭鬼傘還含有鉀、鈉、鈣、鎂、磷等元素和鐵、銅、錳、鋅、鉬、鈷等微量元素以及多種維生素、風(fēng)味物質(zhì)、生物堿等。毛頭鬼傘已被定為符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)要求的，集天然、營養(yǎng)、保健三種功能為一體的16種珍稀食用菌之一。據(jù)報道，毛頭鬼傘具有益胃、清神、治痔等中藥療效；從藥用功能上分析，毛頭鬼傘具有降低血糖、抗線蟲、降低血脂、調(diào)節(jié)免疫力等功效，但是國內(nèi)外對于其生物活性作用的研究還很不充分，從未見到該菌抑制HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性的報道，以及該菌蛋白質(zhì)具有抗腫瘤活性的研究。由于化學(xué)抗癌藥物的毒副作用較大，食藥用菌的抗腫瘤活性受到了廣泛的關(guān)注， 這類活性代謝產(chǎn)物主要以大分子化合物為主，目前研究報道較多的是食用菌多糖類物質(zhì)， 它們主要通過調(diào)節(jié)宿主的免疫功能、活化巨噬細(xì)胞、促進T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫因子等作用發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤的功效，而對腫瘤細(xì)胞直接的殺傷作用較小。2000年李師鵬、蘇蕾等人發(fā)現(xiàn)毛頭鬼傘粗多糖CcP以12. 5mg/kg的劑量腹腔注射可明顯抑制昆明種小鼠S-180實體瘤的活性，并延長腹水瘤小鼠的存活期。但是對于毛頭鬼傘生物活性酶體外直接殺傷癌癥細(xì)胞的研究未見報道。艾滋病是嚴(yán)重威脅人類健康的病毒性傳染病。艾滋病病毒HIV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科的慢病毒亞科。反轉(zhuǎn)錄是HIV病毒最重要的特征之一，過程就是在病毒體內(nèi)反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以病毒RNA為模板合成病毒DNA的過程。在反轉(zhuǎn)錄過程中，反轉(zhuǎn)錄酶起著重要作用，這也是研究抗艾滋病藥物的最佳靶點之一，目前正在研制的大部分藥物都是以HIV的反轉(zhuǎn)錄為靶點的。Mitsuya等首先發(fā)現(xiàn)脫氧胸苷類AZT具有顯著的抑制艾滋病病毒的作用，隨后研究又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)脫氧核苷、無環(huán)核苷、核苷類似物能有效的抑制HIV的復(fù)制，但這些抑制劑的耐藥問題日益突出，并且具有嚴(yán)重的毒副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的毛頭鬼傘漆酶及其制備方法。本發(fā)明所提供的毛頭鬼傘漆酶，按照包括以下步驟的方法制備1)破碎細(xì)胞；2) 收集蛋白粗提物；幻從步驟2)中收集的蛋白粗提物中分離純化漆酶。所述漆酶的分子量為64KD且N末端序列見序列表序列1。所述步驟2)中，采用離心的方式收集蛋白粗提物，所使用的離心力為 6010-15151g，如 12000g。從步驟2、收集的蛋白粗提物中分離純化漆酶包括如下a) d)四步a)將從步驟2、收集的蛋白粗提物進行陰離子交換柱層析，收集具有漆酶活性的洗脫峰；所述陰離子交換柱層析中所采用的陰離子交換基團是DEAE，所采用的洗脫程序包括如下三步洗脫第一步洗脫用pH6. 8-7. 5的磷酸緩沖溶液洗脫A ；第二步洗脫用pH6. 8-7. 5的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；第三步洗脫用pH6. 8-7. 5的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 2M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；所述磷酸緩沖溶液A的溶質(zhì)為 3. 5-4. 5mM NaH2PO4 和 5. 5-6. 5mM Nei2HPO4，溶劑為水；b)將從步驟a)獲得的洗脫峰進行陽離子交換柱層析，收集具有漆酶活性的洗脫峰；所述陽離子交換柱層析中所采用的陽離子交換基團是CM，所采用的洗脫程序包括如下三步洗脫第一步洗脫用pH6. 1-6. 8的磷酸緩沖溶液B洗脫；第二步洗脫用pH6. 1-6. 8的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；第三步洗脫用pH6. 1-6. 8的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 15M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；所述磷酸緩沖溶液B的溶質(zhì)為 5. 75-6. 75mM NaH2PO4 和 3. 2-4. 2mM Nei2HPO4，溶劑為水；c)將從步驟b)獲得的洗脫峰進行陰離子交換柱層析，收集具有漆酶活性的洗脫峰；所述陰離子交換柱層析中所采用的陰離子交換基團是Q ；所采用的洗脫程序為進行 NaCl線性洗脫，所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為3. 5-4. 5，溶質(zhì)為NaCl，溶劑為醋酸緩沖溶液；所述線性洗脫的時間是200分鐘，所述線性洗脫中NaCl的濃度在200分鐘內(nèi)由OM線性升至0. 15M ；所述醋酸緩沖溶液的溶質(zhì)為7. 7-8. 7mM醋酸和 1.3-2. 3mM醋酸鈉，溶劑為水；d)將從步驟C)獲得的洗脫峰進行凝膠過濾層析，得到具有漆酶活性的洗脫峰；所述凝膠過濾層析所用的層析介質(zhì)的分離范圍包括64KD，所用的層析柱的柱長度和柱內(nèi)徑比為 25 1 50 1。所述步驟a)陰離子交換柱層析的載體為Cellulose，所述步驟b)陽離子交換柱層析的載體為Cellulose，所述步驟c)陰離子交換柱層析的載體為kpharose，所述步驟d) 凝膠過濾層析的介質(zhì)為Superdex 75。所述步驟a)中第一步洗脫用PH7.0的所述磷酸緩沖溶液A洗脫；第二步洗脫用pH7. 0的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；第三步洗脫用 PH7. 0的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 2M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；所述磷酸緩沖溶液 A 的溶質(zhì)為 3. 9mM NaH2PO4 和 6. ImM Nei2HPO4，溶劑為水；所述步驟b)中第一步洗脫用pH6. 6的所述磷酸緩沖溶液B洗脫；第二步洗脫用pH6. 6的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；第三步洗脫用 PH6.6的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 15M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；所述磷酸緩沖溶液B的溶質(zhì)為6. 25mM NaH2PO4和3. 7mM Nei2HPO4，溶劑為水；所述步驟c)中所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為4. 0，所述醋酸緩沖溶液的溶質(zhì)為8. 2mM醋酸和1. SmM醋酸鈉，溶劑為水；所述步驟d)中所述得到具有漆酶活性的洗脫峰是用如下溶液洗脫得到的pH值為8. 5的0. 2M的NH4HCO3水溶液。所述步驟d)所用的層析柱的柱長度和柱內(nèi)徑比為30 1。本發(fā)明的另一個目的是提供一種毛頭鬼傘提取物，該提取物的分子量為64KD且N 末端序列見序列表序列1。所述的提取物在制備下述任一產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護范圍A)抑制癌癥細(xì)胞增殖的產(chǎn)品；B)改善癌癥患者健康狀況的產(chǎn)品；C)抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶活性的產(chǎn)品；D)改善艾滋病患者健康狀況的產(chǎn)品。依據(jù)本發(fā)明的制備方法所獲得的毛頭鬼傘漆酶對癌癥細(xì)胞增殖和HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性都有明顯的抑制作用，是一種新型的抗病毒抑制劑，在癌癥藥物和抗艾滋病新藥研究領(lǐng)域中具有重要價值。


圖1為DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱層析洗脫圖譜。圖2為CM-Cellulose弱陽離子交換柱層析洗脫圖譜。圖3為Q-kpharose強陰離子交換柱層析洗脫圖譜。圖4為FPLC-Superdex 75凝膠過濾層析洗脫圖譜。圖5為毛頭鬼傘漆酶SDS-PAGE電泳鑒定圖譜。標(biāo)準(zhǔn)分子量(購自GE Healthcare 公司)從上到下依次為磷酸化酶b(94KD)，牛血清白蛋白(67KD)，卵清蛋白(43KD)，碳酸酐酶(30KD)，大豆胰島素抑制劑(20KD)，乳白蛋白(14.4KD)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、毛頭鬼傘(Coprinus comatus)漆酶的分離純化與鑒定本發(fā)明的原材料是由從毛頭鬼傘(Coprinus comatus)(中國普通微生物保藏管理中心，編號CGMCC 5.615)子實體中分離出來的，利用PD培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g， 加水至1000ml)，在如下條件下發(fā)酵得到菌絲體將毛頭鬼傘菌種接種到綜合PDA (馬鈴薯 200g,葡萄糖20g，瓊脂20g，加水至1000ml)平板上進行活化，25°C恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后將其接種到PD培養(yǎng)基中，250C 160rpm搖瓶培養(yǎng)7天后，再轉(zhuǎn)接一次液體搖瓶培養(yǎng)7天后收集菌絲體，存于-20°C冰箱內(nèi)待用。1、提取與粗級分離用0. 15M的NaCl溶液懸浮毛頭鬼傘菌絲體，利用組織搗碎機進行組織破碎至菌絲體為糊狀，并于4°C放置12小時后，SOOOrpm(12000g)離心15min，收集上清溶液，得到菌絲粗提液；向菌絲粗提液中加入(NH4)2SO4至80%飽和度，于4°C條件下靜置4小時， SOOOrpm(12000g)離心15min，收集沉淀，得到蛋白粗提物，蒸餾水溶解沉淀蛋白粗提物并在蒸餾水中透析12-16小時。2、離子交換柱層析分離純化
層析柱利用相應(yīng)的緩沖溶液以^il/min的流速平衡8_10個柱體積后，利用pH計測定層析柱流出液的PH值以確定層析柱是否平衡好，透析后的蛋白粗樣品以1.5ml/min的流速勻速上樣，待樣品上完后，將流速調(diào)制2. 5ml/min(Q-Sepharose層析為lml/min)進行洗脫，各洗脫峰利用漆酶活性檢測方法確定是否為活性峰。DEAE-Cellulose層析柱洗脫時選用添加0、0. 1M、0. 2M和IM NaCl進行分步洗脫；CM-Cellulose層析柱洗脫時選用添加0、0. 1M、0. 15M和IM NaCl進行分步洗脫； Q-Sepharose層析柱洗脫時選用添加0_0. 15M NaCl進行線性洗脫。(I)DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱層析透析后的蛋白粗提物經(jīng)過pH7. O的磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為3. 9mM NaH2POjP 6. ImM Na2HPO4,溶劑為水)平衡后，經(jīng)DEAE-Cellulose (Sigma公司，D0909)弱陰離子交換柱層析。 該離子交換柱的柱體積為100ml。進行四步洗脫，流速2.5ml/min。第一步洗脫用pH7. O的磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為3. 9mM NaH2PO4和6. ImM Na2HPO4,溶劑為水)洗脫2. 58個柱體積； 第二步洗脫用PH7. O的如下溶液洗脫3. 29個柱體積溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為3. 9mM NaH2PO4和6. ImM Na2HPO4,溶劑為水)；第三步洗脫用pH7. O的如下溶液洗脫2. 13個柱體積溶質(zhì)是0. 2MNaCl，溶劑是磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為3. 9mM NaH2PO4和 6. ImM Na2HPO4,溶劑為水)；第四步洗脫用pH7. O的如下溶液洗脫2. 87個柱體積溶質(zhì)是 1. OM NaCl，溶劑是磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為3. 9mM NaH2PO4和6. ImM Na2HPO4,溶劑為水)。收集得到的洗脫峰進行漆酶活性檢測，結(jié)果表明第三步洗脫得到的第三洗脫峰 D3(圖1中洗脫體積為第588-721ml，即第5. 88-7. 21個柱體積)為目標(biāo)提取物的活性峰 (其漆酶活性為95. lU/mg)，將D3活性峰在蒸餾水中透析10-12小時。(2)CM-Cellulose弱陽離子交換柱層析D3組分經(jīng)過pH6. 6的磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為6. 25mM NaH2PO4和3. 7mM Na2HPO4, 溶劑為水)平衡后，經(jīng)CM-Cellulose (Sigma公司，C0805)弱陽離子交換柱層析。該離子交換柱的柱體積為50ml。進行四步洗脫，流速2.5ml/min。第一步洗脫用pH6. 6的磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為6. 25mM NaH2PO4和3. 7mM Na2HPO4,溶劑為水)洗脫7. 14個柱體積；第二步洗脫用PH6. 6的如下溶液洗脫4. 2個柱體積溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是磷酸緩沖溶液 (溶質(zhì)為6. 25mM NaH2PO4和3. 7mM Na2HPO4,溶劑為水)；第三步洗脫用pH6. 6的如下溶液洗脫2. 38個柱體積溶質(zhì)是0. 15M NaCl，溶劑是磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為6. 25mM NaH2PO4和 3. 7mM Na2HPO4，溶劑為水)；第四步洗脫用pH6. 6的如下溶液洗脫1. 68個柱體積溶質(zhì)是 1. OM NaCl，溶劑是磷酸緩沖溶液(溶質(zhì)為6. 25mM NaH2PO4和3. 7mM Nei2HPO4，溶劑為水)。收集得到的洗脫峰進行漆酶活性檢測，結(jié)果表明第三步洗脫得到的第三洗脫峰 D3C3(圖2中洗脫體積為第568-630ml，即第11. 34-12. 6個柱體積)為目標(biāo)提取物的活性峰(其漆酶活性為646. 8U/mg)，將D3C3活性峰在蒸餾水中透析10-12小時。(3) Q-Sepharose強陰離子交換柱層析D3C3組分經(jīng)過pH4. O的醋酸緩沖溶液(溶質(zhì)為8. 2mM醋酸和1. 8mM醋酸鈉，溶劑為水)平衡后，經(jīng)Q-kpharose(GE Healthcare公司，17-0510-10)強陰離子交換柱層析。 該離子交換柱的柱體積為10ml。進行200分鐘的NaCl線性洗脫，流速lml/min。該NaCl 線性洗脫溶液PH值為4. 0，溶質(zhì)為NaCl，溶劑為醋酸緩沖溶液(溶質(zhì)為8. 2mM醋酸和1. SmM 醋酸鈉，溶劑為水，NaCl的濃度在200分鐘內(nèi)由OM線性升至0. 15M。
收集得到的洗脫峰進行漆酶活性檢測，結(jié)果表明得到的第二洗脫峰D3C3Q2(圖3 中洗脫體積為第121-200ml，即第13-20個柱體積)為目標(biāo)提取物的活性峰(該活性峰的漆酶活性為721. lU/mg)，將D3C3Q2活性峰在蒸餾水中透析10-12小時。3、凝膠過濾層析D3C3Q2 組分經(jīng) FPLC-Superdex 75 (GE Healthcare 公司，17-5174-01)凝膠過濾層析，洗脫液為PH 8. 50. 2M NH4HCO3溶液，層析柱規(guī)格30cm(柱長)X Icm(內(nèi)徑)，上樣體積為0. anl，流速為0. 8ml/min。收集得到的洗脫峰進行漆酶活性檢測，結(jié)果表明得到的第一洗脫峰D3C3Q2SU1 (圖4中洗脫體積為第8. 8-11. 2ml,即第0. 37-0. 47個柱體積)為目標(biāo)提取物的活性峰(該活性峰的漆酶活性為790. 9U/mg)。上述漆酶活性均按照如下方法檢測收集洗脫峰，利用BCA蛋白定量試劑盒(北京博邁德科技公司，PP010;3)測定洗脫峰的蛋白含量，利用下述漆酶活性測定方法測定出洗脫峰的活性，通過計算得出每毫克蛋白中存在的酶活力單位數(shù)。漆酶活性測定方法以2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 (ABTS)為底物，將其配置成0. 34mg/ml的酸性溶液(pH值為2. 8)，10 μ 1樣品中加入190 μ 1 的上述底物，37°C反應(yīng)5分鐘后，在波長400nm處測定吸光值，以蒸餾水代替酶液進行反應(yīng)作為對照。酶活力單位定義為37°C時每分鐘每毫升反應(yīng)體系在400nm處產(chǎn)生1個吸光值所需要的酶量。4、超濾濃縮D3C3Q2SU1活性峰在蒸餾水中透析10_12小時，在4°C進行截留分子量為3KD的超濾濃縮后，于-80°C條件下至完全冰凍，將冰凍樣品凍干成粉備用，該干粉即為漆酶純品，也即本發(fā)明保護的毛頭鬼傘提取物。該漆酶純品的漆酶活性為790. 9U/mg(漆酶活性測定方法同上)。將該漆酶純品進行SDS-PAGE電泳鑒定，并結(jié)合凝膠過濾層析洗脫曲線確定該提取物的大小為64KD(見圖5)。5、氨基酸序列測定采用自動化EDMAN降解法對漆酶純品的N末端氨基酸序列進行測定，用Hewlett Packard 1000A配有HPLC系統(tǒng)的蛋白序列測定儀測定N末端序列，測得序列見序列表序列 1。實施例2、毛頭鬼傘(Coprinus comatus)漆酶的功能檢測1、體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能檢測1)精確稱取實施例1得到的漆酶純品，以無血清培養(yǎng)液配置成不同劑量溶液(見表1)，以檢測體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性；2)選取人肝癌細(xì)胞株H印G2 (ATCC公司，HB-8065)和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 (ATCC 公司，HTB-2》為檢測對象，培養(yǎng)H印G2和MCF-7至細(xì)胞進入對數(shù)生長期時，將細(xì)胞按照密度為8X IO3個/孔的比例接種到96孔板內(nèi)，并以含有血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)6小時，以使細(xì)胞全部貼壁；3)去掉血清培養(yǎng)液，用PBS(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，BF-0013)洗滌細(xì)胞，換入無血清培養(yǎng)液，并加入不同劑量的毛頭鬼傘漆酶溶液，共培養(yǎng)48小時；4)去除細(xì)胞培養(yǎng)液，利用MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況，計算抑制率。
抑制率(% ) = A540nm(漆酶處理的樣品))/八54011111(未處理的對照)X 100%
表1不同劑量毛頭鬼傘漆酶對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率
權(quán)利要求
1.毛頭鬼傘(Coprinuscomatus)提取物的制備方法，包括以下步驟1)破碎細(xì)胞；2)收集蛋白粗提物；3)從步驟幻收集的蛋白粗提物中分離純化漆酶，得到的漆酶即為毛頭鬼傘提取物，所述漆酶的分子量為64KD且N末端序列見序列表中序列1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述從步驟幻收集的蛋白粗提物中分離純化漆酶包括如下步驟a)將從步驟幻收集的蛋白粗提物進行陰離子交換柱層析，收集具有漆酶活性的洗脫峰；所述陰離子交換柱層析中所采用的陰離子交換基團是DEAE，所采用的洗脫程序包括如下三步洗脫第一步洗脫用PH6. 8-7. 5的磷酸緩沖溶液A洗脫；第二步洗脫用pH6. 8-7. 5的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；第三步洗脫用pH6. 8-7. 5的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 2M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；所述磷酸緩沖溶液A的溶質(zhì)為 3. 5-4. 5mM NaH2PO4 和 5. 5-6. 5mM Nei2HPO4，溶劑為水；b)將從步驟a)獲得的洗脫峰進行陽離子交換柱層析，收集具有漆酶活性的洗脫峰；所述陽離子交換柱層析中所采用的陽離子交換基團是CM，所采用的洗脫程序包括如下三步洗脫第一步洗脫用PH6. 1-6. 8的磷酸緩沖溶液B洗脫；第二步洗脫用pH6. 1-6. 8的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；第三步洗脫用pH6. 1-6. 8的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 15M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；所述磷酸緩沖溶液B的溶質(zhì)為 5. 75-6. 75mM NaH2PO4 和 3. 2-4. 2mM Nei2HPO4，溶劑為水；c)將從步驟b)獲得的洗脫峰進行陰離子交換柱層析，收集具有漆酶活性的洗脫峰；所述陰離子交換柱層析中所采用的陰離子交換基團是Q ；所采用的洗脫程序為進行NaCl線性洗脫，所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為3. 5-4. 5，溶質(zhì)為NaCl，溶劑為醋酸緩沖溶液；所述線性洗脫的時間是200分鐘，所述線性洗脫中NaCl的濃度在200分鐘內(nèi)由OM線性升至0. 15M ；所述醋酸緩沖溶液的溶質(zhì)為7. 7-8. 7mM醋酸和1. 3-2. 3mM醋酸鈉，溶劑為水；d)將從步驟c)獲得的洗脫峰進行凝膠過濾層析，得到具有漆酶活性的洗脫峰；所述凝膠過濾層析所用的層析介質(zhì)的分離范圍包括64KD，所用的層析柱的柱長度和柱內(nèi)徑比為 25 1 50 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟a)陰離子交換柱層析的載體為Cellulose，所述步驟b)陽離子交換柱層析的載體為Cellulose，所述步驟c)陰離子交換柱層析的載體為kpharose，所述步驟d)凝膠過濾層析的介質(zhì)為SuperdeX75。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述步驟a)中第一步洗脫用pH7. 0的所述磷酸緩沖溶液A洗脫；第二步洗脫用pH7. 0 的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；第三步洗脫用pH7. 0的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 2M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液A ；所述磷酸緩沖溶液A的溶質(zhì)為 3. 9mM NaH2PO4 和 6. ImM Nei2HPO4,溶劑為水；所述步驟b)中第一步洗脫用pH6. 6的所述磷酸緩沖溶液B洗脫；第二步洗脫用pH6. 6的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. IM NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；第三步洗脫用pH6. 6的如下溶液洗脫溶質(zhì)是0. 15M NaCl，溶劑是所述磷酸緩沖溶液B ；所述磷酸緩沖溶液B的溶質(zhì)為 6. 25mM NaH2PO4 和 3. 7mM Nei2HPO4，溶劑為水；所述步驟c)中所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為4. 0，所述醋酸緩沖溶液的溶質(zhì)為8. 2mM醋酸和1. SmM醋酸鈉，溶劑為水；所述步驟d)中所述得到具有漆酶活性的洗脫峰是用如下溶液洗脫得到的pH值為8. 5 的0. 2M的NH4HCO3水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的制備方法，其特征在于所述步驟d)所用的層析柱的柱長度和柱內(nèi)徑比為30 1。
6.由權(quán)利要求1-5中任一所述的制備方法得到的提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的提取物，其特征在于所述提取物的分子量為64KD且N末端序列見序列表序列1。
8.權(quán)利要求6或7所述的提取物在制備下述任一產(chǎn)品中的應(yīng)用A)抑制癌癥細(xì)胞增殖的產(chǎn)品；B)改善癌癥患者健康狀況的產(chǎn)品；C)抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶活性的產(chǎn)品；D)改善艾滋病患者健康狀況的產(chǎn)品。
9.含有權(quán)利要求6或7所述的提取物的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品為下述任一產(chǎn)品A)抑制癌癥細(xì)胞增殖的產(chǎn)品；B)改善癌癥患者健康狀況的產(chǎn)品；C)抑制HIV-I反轉(zhuǎn)錄酶活性的產(chǎn)品；D)改善艾滋病患者健康狀況的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的毛頭鬼傘(Coprinus comatus)漆酶及其制備方法。本發(fā)明所提供的毛頭鬼傘漆酶，按照包括以下步驟的方法制備1)破碎細(xì)胞；2)收集蛋白粗提物；3)從步驟2)中收集的蛋白粗提物中分離純化漆酶，得到的漆酶即為毛頭鬼傘提取物，所述漆酶的分子量為64KD且N末端序列見序列表序列1。依據(jù)本發(fā)明的制備方法所獲得的毛頭鬼傘提取物對癌癥細(xì)胞增殖和HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性都有明顯的抑制作用，在癌癥藥物和抗艾滋病新藥研究領(lǐng)域中具有重要價值。
文檔編號C12N9/02GK102268414SQ201110162219
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者劉宇, 王守現(xiàn), 王賀祥, 許峰, 趙爽 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 北京市農(nóng)林科學(xué)院