專利名稱：復(fù)合生物活性肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中活性肽的制備，具體是一種利用蚯蚓自身蛋白酶降解大豆豆粕以制取含有大豆活性肽、蚯蚓肽的復(fù)合生物活性肽的制備方法。
背景技術(shù)：
生物活性肽是一類存在于天然動、植物和微生物等生物體內(nèi)或動、植物蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶酶解而得，具有特殊生理活性的二肽、低分子肽或多肽類物質(zhì)的總稱。活性肽具有多種機體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，食用安全性極高，是當(dāng)前國際食品、飼料界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。目前，主要是通過酶解法以動、植物蛋白為底物來生產(chǎn)生物活性肽。不同蛋白酶對蛋白質(zhì)水解方式不同，獲取活性肽數(shù)量與活性有較大不同，因此酶的選擇是生產(chǎn)活性肽的關(guān)鍵。目前商業(yè)用酶主要是微生物酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復(fù)合酶)、 植物蛋白酶及少量的動物蛋白酶，如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、細菌蛋白酶和霉菌蛋白酶等。生產(chǎn)上制備活性肽時，往往選用一至兩種商品酶來水解蛋白，雖然可以獲得純度較高的活性肽，但是也存在一些不足其一，選用一兩種商品酶水解得到的活性肽結(jié)構(gòu)單一，生物功能簡單；其二，商品酶價格昂貴，用量大，且水解度不高，肽得率較低，提高了生產(chǎn)成本，降低了生產(chǎn)效率；其三，商品酶如果選用不對，還會使所得活性肽帶有明顯的苦味，在某種程度上限制了活性肽的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有生物活性肽制備工藝存在的上述問題，而提供一種以豆粕和蚯蚓為原材料，制備含有大豆肽和蚯蚓肽的復(fù)合生物活性肽的制備方法。本發(fā)明解決該技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是
一種復(fù)合生物活性肽的制備方法，包括大豆蛋白提取工序、蚯蚓酶液提取工序，還包括按下述步驟進行的復(fù)合生物活性肽制備工序
a.取大豆分離蛋白加入適量蒸餾水配成0.5 25%的大豆蛋白溶液；
b.取配置好的大豆蛋白溶液1 500ml于酶反應(yīng)器中，然后在40 100°C下熱處理 IOmin,冷卻至30 75°C后用Imol · F1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4. 0 11. 0;
c.加入蚯蚓酶液10 500ml，再加入蒸餾水10 800ml，確保反應(yīng)液總體積為50 1000ml，慢慢攪拌，進行水解，反應(yīng)過程中及時加入Imol · F1NaOH溶液使系統(tǒng)pH值穩(wěn)定在 2. 0 10. 0，酶解溫度保持在30 90°C ；
d.水解反應(yīng)0.5 12h后，將酶解液迅速加熱至90°C，保持10 min滅酶，冷卻，再以3000 20000 r · min—1離心5 15min，取上清液，冷凍干燥或噴霧干燥，得到含有大豆肽和蚯蚓肽的復(fù)合生物活性肽粉末，其水解度為38%，肽得率為62%。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述大豆蛋白提取工序按如下方法進行
將豆粕粉碎后置于容器中，按固液比1 :1 1 :12加入蒸餾水，30 70°C恒溫水浴， 邊攪拌邊加入Imol · F1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至3 10之間，繼續(xù)充分?jǐn)嚢? 120min，靜置30min ；500 10000 r · mirT1離心5 60 min，收集上清液，向上清液中逐滴加入 Imol · Γ1鹽酸溶液，邊加鹽酸邊攪拌，調(diào)pH值至2 10時，30 80°C恒溫水浴，靜置 10 60 min，再以500 10000 r · mirT1離心5 30 min,收集沉淀，噴霧干燥或者冷凍干燥備用，用微量凱氏定氮法測定分離蛋白粉末的蛋白質(zhì)含量。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述蚯蚓酶液提取工序按如下方法進行
將新鮮蚯蚓洗凈，讓其盡量吐出體內(nèi)的食物殘渣，稱取10 500g鮮蚯蚓，加入20 IOOOml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，勻漿后，4°C充分靜置，4°C條件下500 20000r ^irT1 離心1 30 min，取上清液即為蚯蚓酶液，4°C冷藏備用。所述蚯蚓酶液提取工序中，也可用干燥蚯蚓粉10 500g，加入10 IOOOml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液來代替新鮮蚯蚓。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于
蚯蚓蛋白酶是十幾種蛋白酶構(gòu)成的復(fù)合酶，用它來替代商品酶，使產(chǎn)物水解度和肽得率提高，大大降低了生產(chǎn)成本。得到的產(chǎn)物復(fù)合活性肽苦味小，且由多種大豆肽和蚯蚓肽構(gòu)成，生物功能廣泛，在醫(yī)療、保健、飼料等多個領(lǐng)域具備良好的開發(fā)前景。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例詳述本發(fā)明。實施例1:
將豆粕粉碎后置于容器中，加入蒸餾水(固液比1 2)，70°C恒溫水浴，邊攪拌邊加入 lmol ^r1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10之間，繼續(xù)充分?jǐn)嚢?0min，靜置30min。1500 r -min"1 離心10 min，收集上清液，向上清液中逐滴加入Imol 鹽酸溶液，邊加鹽酸邊攪拌，調(diào) PH值至3時，80°C恒溫水浴，靜置lOmin。再以1500 r · mirT1離心lOmin，收集沉淀， 噴霧干燥或者冷凍干燥備用，用微量凱氏定氮法測定分離蛋白粉末的蛋白質(zhì)含量。將新鮮蚯蚓洗凈，讓其盡量吐出體內(nèi)的食物殘渣。稱取IOOg鮮蚯蚓，加入500ml 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，勻漿后，4°C充分靜置，4°C條件下1500r · mirT1離心10 min, 取上清液即為蚯蚓酶液，4°C冷藏備用。取大豆分離蛋白加入適量蒸餾水配成1%的大豆蛋白溶液；取配置好的大豆蛋白溶液IOOml于酶反應(yīng)器中，然后在60°C下熱處理lOmin，冷卻至30°C后用Imol · F1NaOH 溶液調(diào)節(jié)PH值至5. 0，加入蚯蚓酶液100ml，再加入蒸餾水800ml，確保反應(yīng)液總體積為 IOOOml (底物濃度最終控制在10%，大豆蛋白溶液和蚯蚓酶液的體積比為1 :1)，慢慢攪拌， 進行水解。反應(yīng)過程中及時加入Imol · F1NaOH溶液使系統(tǒng)pH值穩(wěn)定在4. 0，酶解溫度保持在30°C。反應(yīng)Ih后，將酶解液迅速加熱至90°C，保持10 min滅酶，冷卻。再以11000 r -min-1離心5min，取上清液，冷凍干燥或噴霧干燥，得到含有大豆肽和蚯蚓肽的復(fù)合生物活性肽粉末。實施例2:
將豆粕粉碎后置于容器中，加入蒸餾水(固液比1 2)，70°C恒溫水浴，邊攪拌邊加入 lmol ^r1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10之間，繼續(xù)充分?jǐn)嚢?0min，靜置30min。1500 r -min"1 離心10 min，收集上清液，向上清液中逐滴加入Imol 鹽酸溶液，邊加鹽酸邊攪拌，調(diào) PH值至3時，80°C恒溫水浴，靜置lOmin。再以1500 r · mirT1離心lOmin，收集沉淀， 噴霧干燥或者冷凍干燥備用，用微量凱氏定氮法測定分離蛋白粉末的蛋白質(zhì)含量。
取干燥蚯蚓粉100g，加入800ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，勻漿后，4°C充分靜置，4°C條件下1500r · miiT1離心10 min，取上清液即為蚯蚓酶液，4°C冷藏備用。取大豆分離蛋白加入適量蒸餾水配成1%的大豆蛋白溶液；取配置好的大豆蛋白溶液50ml于酶反應(yīng)器中，然后在60°C下熱處理lOmin，冷卻至30°C后用Imol · F1NaOH 溶液調(diào)節(jié)PH值至5. 0，加入蚯蚓酶液100ml，再加入蒸餾水850ml，確保反應(yīng)液總體積為 1000ml (底物濃度最終控制在5%，大豆蛋白溶液和蚯蚓酶液的體積比為1 :2)，慢慢攪拌，進行水解。反應(yīng)過程中及時加入Imol · F1NaOH溶液使系統(tǒng)pH值穩(wěn)定在4. 0，酶解溫度保持在30°C。反應(yīng)Ih后，將酶解液迅速加熱至90°C，保持10 min滅酶，冷卻。再以11000 r -min-1離心5min，取上清液，冷凍干燥或噴霧干燥，得到含有大豆肽和蚯蚓肽的復(fù)合生物活性肽粉末。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合生物活性肽的制備方法，包括大豆蛋白提取工序、蚯蚓酶液提取工序，還包括按下述步驟進行的復(fù)合生物活性肽制備工序a.取大豆分離蛋白加入適量蒸餾水配成0.5 25%的大豆蛋白溶液；b.取配置好的大豆蛋白溶液1 500ml于酶反應(yīng)器中，然后在40 100°C下熱處理 IOmin,冷卻至30 75°C后用Imol · F1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4. 0 11. 0;c.加入蚯蚓酶液10 500ml，再加入蒸餾水10 800ml，確保反應(yīng)液總體積為50 1000ml，慢慢攪拌，進行水解，反應(yīng)過程中及時加入Imol · F1NaOH溶液使系統(tǒng)pH值穩(wěn)定在 2. 0 10. 0，酶解溫度保持在30 90°C ；d.水解反應(yīng)0.5 12h后，將酶解液迅速加熱至90°C，保持10 min滅酶，冷卻，再以3000 20000 r · min—1離心5 15min，取上清液，冷凍干燥或噴霧干燥，得到含有大豆肽和蚯蚓肽的復(fù)合生物活性肽粉末，其水解度為38%，肽得率為62%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合生物活性肽的制備方法，其特征在于，所述大豆蛋白提取工序按如下方法進行將豆粕粉碎后置于容器中，按固液比1 :1 1 :12加入蒸餾水，30 70°C恒溫水浴， 邊攪拌邊加入Imol · F1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至3 10之間，繼續(xù)充分?jǐn)嚢? 120min， 靜置30min ；500 10000 r · mirT1離心5 60 min,收集上清液，向上清液中逐滴加入 Imol · Γ1鹽酸溶液，邊加鹽酸邊攪拌，調(diào)pH值至2 10時，30 80°C恒溫水浴，靜置 10 60 min，再以500 10000 r · mirT1離心5 30 min,收集沉淀，噴霧干燥或者冷凍干燥備用，用微量凱氏定氮法測定分離蛋白粉末的蛋白質(zhì)含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合生物活性肽的制備方法，其特征在于，所述蚯蚓酶液提取工序按如下方法進行將新鮮蚯蚓洗凈，讓其盡量吐出體內(nèi)的食物殘渣，稱取10 500g鮮蚯蚓，加入20 IOOOml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，勻漿后，4°C充分靜置，4°C條件下500 20000r ^irT1 離心1 30 min，取上清液即為蚯蚓酶液，4°C冷藏備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的復(fù)合生物活性肽的制備方法，其特征在于，所述蚯蚓酶液提取工序中，用干燥蚯蚓粉10 500g，加入10 IOOOml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液來代替新鮮蚯蚓。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用蚯蚓自身蛋白酶降解大豆豆粕以制取含有大豆活性肽、蚯蚓肽的復(fù)合生物活性肽的制備方法。其步驟是取0.5～25%的大豆蛋白溶液于酶反應(yīng)器中，在40～100℃下熱處理10min,冷卻至30～75℃后用1mol·l-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0～11.0;加入蚯蚓酶液及蒸餾水，水解反應(yīng)pH值穩(wěn)定在2.0～10.0，酶解溫度在30～90℃；水解反應(yīng)0.5～12h后,將酶解液迅速加熱至90℃,保持10min滅酶冷卻,再以3000～20000r·min-1離心5～15min，取上清液，冷凍干燥或噴霧干燥得到復(fù)合生物活性肽粉末。本發(fā)明降低了生產(chǎn)成本，其產(chǎn)物復(fù)合生物活性肽功能廣泛。
文檔編號C12P21/06GK102251000SQ201110164110
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月18日
發(fā)明者李成會, 武煒 申請人:唐山師范學(xué)院