專利名稱：快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學臨床診斷領域，具體說是快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
在我國多種流行性傳染病的病原微生物，如艾滋病，病毒性肝炎，結核，梅毒等，對人類健康造成了巨大危害。臨床上主要應用免疫學和微生物學等方法對各種病原微生物進行檢測和診斷，由于其靈敏性低和周期長等限制，仍不能完全杜絕陽性病原體的漏檢和不能及時準確地診斷。近年來核酸分子檢測技術在檢驗醫(yī)學和臨床研究中顯示出強大的優(yōu)勢，相比較免疫診斷技術具有靈敏度好、特異性強和可定量等優(yōu)點。但這項技術在進行確定病原體載量時仍存在操作復雜，費時，容易導致假陽性等缺點。因此，檢測技術需要改進和提高，進而降低污染和簡化操作過程?！?br> 目前在臨床核酸檢測中使用較多的是熒光定量PCR技術，該技術已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。這項技術不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點?？梢詫θ祟惷庖呷毕莶《?、肝炎病毒、流感病毒、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、EB病毒、巨細胞病毒、梅毒螺旋菌、結核分枝桿菌、淋球菌、沙眼衣原體和解脲支原體等病原微生物進行定量測定。目前，常用的病原微生物實時熒光定量PCR技術包括探針類和染料類兩種。在實際醫(yī)學檢驗操作中，進行熒光定量PCR實驗的模板是核酸。作為模板的核酸物質往往要進行純化，甚至幾次純化，這樣才能避免核酸中的雜質(如血清蛋白，膽紅素，脂類等)抑制PCR反應。核酸純化過程比較復雜，繁瑣，耗時較長。這也導致了在臨床樣本的實際檢測中，單位時間內核酸檢測效率比較低下。另外，核酸純化過程需要多次離心或移管等操作，也導致核酸以氣溶膠的形式外溢到環(huán)境中，很容易造成樣品檢測的假陽性污染，這也是臨床核酸檢測實驗室條件要求很高的主要原因。核酸純化涉及到的基本原理基本上都是，首先使細胞膜破裂，染色體DNA和蛋白質變性，然后用有機溶劑抽提使核酸和蛋白分離或直接將核酸吸附于某些固體顆粒的表面，再進行沉淀或洗脫，從而獲取高純度的核酸。目前市場上的核酸檢測試劑盒中核酸純化方法主要有以下幾種(I)煮沸法。該方法主要是通過沸水浴裂解細胞，釋放核酸物質，同時使蛋白質變性，然后通過離心沉淀的方式去除變性的蛋白質和雜質，最后回收核酸用于PCR擴增。該方法操作相對較簡單，但是由于在高溫變性蛋白質過程中，會導致部分核酸的損失。另外，這種方法獲得的核酸仍然含有大量的雜質，因此也會產生PCR反應的抑制。(2)二氧化硅膜柱法。該方法首先是用異硫氰酸胍或鹽酸胍作為細胞裂解和蛋白變性液來裂解細胞，然后核酸釋放到上清液中。再將上清液過二氧化硅膜柱子，在異硫氰酸胍或鹽酸胍作為離液鹽的作用下，核酸被特異的吸附到二氧化硅膜柱上。然后用乙醇清洗膜柱，最后洗脫核酸進行PCR擴增。該方法獲得核酸樣品比較純，但是，由于膜柱吸附效率較低，會導致部分核酸的丟失。(3)納米磁珠法。該方法過程與二氧化硅膜柱法基本相同，只是用納米磁珠法來代替二氧化硅膜柱。該方法獲得的核酸純度高，并且核酸回收率要遠超二氧化硅膜柱法。以上三種市場主流核酸提取方法，雖然在原理上，操作上和回收得率上各不相同，每種方法都有其各自的優(yōu)勢和特點。但是，三種方法無一例外都有操作時間長，操作復雜，不利于人工大規(guī)模處理樣本，以及核酸回收損失等這些缺點。在實際進行核酸檢測的過程中，為了排除假陰性結果和確定PCR的反應效率，需要在PCR反應體系中加入內標(內對照分子)。內標可以監(jiān)控PCR反應，避免樣本抑制物、DNA(RNA)提取過程的丟失、誤操作等造成的假陰性結果；并對以上原因造成的定量誤差進行修正。如中國專利申請CN1203366A采用珠蛋白基因等作為內標，CN1664098A采用beta-肌動蛋白作為內標，CN1687454A采用res_l基因作為內標，CN1940087A采用了 RNA內標。然而，相對于PCR檢測方法，人們對內標的研究工作卻相對很少，特別是競爭性內標，其設計有一定的技術難點。正是由于PCR反應具有強大的擴增效率，也導致其易污染的缺點，極微量的污染可導致陽性結果，靈敏度過高可能會導致假陽性率增加。在導致PCR假陽性的因素中，產物污染是最嚴重的因素之一。為防止PCR產物污染，以避免假陽性和提高PCR診斷技術的準 確性，已成為急待解決的問題。在PCR產物中引入dU代替dT。這種dU化的PCR產物與尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG) —起孵育，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。采用UNG酶，在進行PCR之前對模板及其它反應物進行處理，可以防止因產物污染所致的假陽性。目前我國國家藥政部門在接受PCR相關檢測試劑盒申報時，已經把是否采用了 UNG酶作為審批條件之一。但在目前仍然存在一些技術性問題，如UNG酶的活性保存非常重要。今后，UNG酶及其相應的系統(tǒng)將成為常規(guī)PCR檢測試劑盒的組份。檢測肝炎病毒核酸的方法目前已有很多，且有很多商業(yè)化試劑盒生產。但目前定量試劑盒大部分技術仍存在操作復雜和靈敏性低，準確性差等缺點，檢測技術需要改進和提高。需要解決的技術關鍵是進一步提高檢測的特異性和靈敏度，降低污染的機會，簡化操作方法。針對這些問題，本發(fā)明應用核酸釋放劑快速獲得肝炎病毒的核酸，實現(xiàn)一步法和一管法完成熒光快速定量檢測過程，并采用競爭性內標和防污染系統(tǒng)降低假陽性和假陰性，大大提高了檢測效率，靈敏度和準確性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了提供一種快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒及檢測方法。一種快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，包括核酸釋放試劑、核酸擴增試劑、對照品、標準品和內標，所述核酸釋放試劑為SDS、3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(Chaps)、(NH4)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸釋放試劑按體積百分比為O. 25% SDS、
O.25% Chaps,5% (NH4) 2S04、I % 甲酰胺，余量為水。所述標準品為為非感染性肝炎病毒DNA或RNA ;所述對照品為陰性對照為無菌雙蒸水，陽性對照為非感染性肝炎病毒DNA或RNA。所述核酸擴增試劑為I. 5-5mM 的 MgCl2, 20_50mM Tris-HCl, pH8. 3-8. 5，35_75mM的 KC1，2. 5-4mM 的 dNTP, I. 25-5U Taq 酶，0· 1-0. 5U UNG 酶，50_200nM 探針，50_200nM 內標探針，50-750nM肝炎病毒上下游引物。所述模板為DNA時，酶混合液為Taq酶5U和UDG酶O. 5U ;模板為RNA時，酶混合液為Taq酶5U、UDG酶O. 5U和反轉錄酶100U。所述dNTPs 的組成比例為dATP dCTP dGTP dUTP = I : I : I : I : 2(體積比);所述的PCR增強劑為O. I 5mg/mlBSA, 5 500mmo 1/L海藻糖,0. I 5MBetaine和O. 01 % I %明膠的混合水溶液。所述肝炎病毒為乙肝HBV時。探針5，TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG，3上游引物5，ACACCTCCTTTCCATGGCTGC，3；
下游引物5’ AGCGCCGACGGGACGTAGAC，3 ；內標探針5 ’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC ’ 3 ;其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、J0E、HEX 和 TET 中的一種熒光基團。所述肝炎病毒為丙肝HCV時。探針5，TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG，3上游引物5’GAGAGCCATAGTGGTCTG’ 3 ；下游引物5’GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’ 3 ；內標探針5 ’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC ’ 3，其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、J0E、HEX 和 TET 中的一種熒光基團。快速定量檢測病原微生物核酸的試劑盒的檢測方法將待測樣品，標準品和對照品分別加入核酸釋放劑混合均勻，室溫靜止10分鐘后，加入核酸擴增試劑進行PCR擴增；所述核酸釋放試劑SDS、3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(Chaps)、(MM)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸釋放試劑按體積百分比為O. 25 % SDS、O. 25 % Chaps、5 %(NH4) 2S04、I %甲酰胺，余量為水。所述肝炎病毒為乙肝HBV時。探針5，TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG，3上游引物5，ACACCTCCTTTCCATGGCTGC，3；下游引物5’AGCGCCGACGGGACGTAGAC’ 3 ；內標探針5 ’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC ’ 3 ;其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、J0E、HEX 和 TET 中的一種熒光基團。所述肝炎病毒為丙肝HCV時。探針5，TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG，3上游引物5’GAGAGCCATAGTGGTCTG’ 3 ；下游引物5’GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’ 3 ；內標探針5 ’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC ’ 3，其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、J0E、HEX 和 TET 中的一種熒光基團。所述的待檢樣品為人源或動物源的血清、血漿、精液或唾液等。本發(fā)明的優(yōu)點及所產生的積極的技術效果是I、本發(fā)明的優(yōu)點在于一種能夠高效快速釋放肝炎病毒核酸的釋放試劑的發(fā)明和使用。該釋放劑與其他釋放劑相比，成份不含有生物活性成分，如蛋白酶K，莎梵婷(surfactin)，能夠有效和快速地滅活樣本中的各種具有生物活性的物質，如DNA酶，RNA酶等。該試劑的適用樣本范圍寬，可以是血清、血漿、唾液、人體組織細胞和細菌等等。其次，該釋放劑對于核酸擴增試劑和Taq酶、UDG酶和反轉錄酶沒有任何抑制效應。再者，該釋放劑裂解效果穩(wěn)定，無需加熱，在室溫18_30°C條件下，即可將肝炎病毒中的核酸釋放出來。應用該核酸釋放劑可以實現(xiàn)無需單獨提取核酸樣本，直接進行PCR擴增反應，實現(xiàn)了核酸提取零耗時。整個樣本處理和檢驗過程簡單、快捷、高效、靈敏度高，是快速且定量檢測肝炎病毒核酸的最佳選擇。同時這避免了核酸提取過程中導致的核酸損失，以及因為核酸提取過程導致了核酸氣溶膠的產生。2、檢測技術靈敏性強，特異和精確本發(fā)明采用競爭性內標和UDG酶系統(tǒng)完成對樣品中提取的肝炎病毒核酸的實時PCR檢測，降低了交叉污染的可能性；優(yōu)化的PCR反應體系，降低樣本中干擾物質對PCR熒光信號的影響(如血清蛋白，膽紅素，脂類等)使檢測靈敏度達到100IU/ml，達到7個數量級的動態(tài)范圍。 3、操作極其簡便，應用范圍廣泛本發(fā)明操作極其簡單，容易掌握，只需要移液器，PCR反應管和PCR檢測儀就能完成樣品的快速定量檢測。本發(fā)明操作簡便、快速、成本低廉，并且易于開發(fā)為自動化檢測系統(tǒng)，并對小量樣品的進行快速定量篩檢。本發(fā)明檢測一些HBV和HCV的陽性樣品，與目前市場主流核酸診斷試劑相比，本發(fā)明有更寬的線性范圍，有更高的靈敏度。


圖I為本發(fā)明實施例提供的檢測臨床檢驗中心HBV血清標準物質；圖2為本發(fā)明實施例提供的檢測HBV國家線性靈敏度參考品的檢測結果和理論結果的符合度；圖3為本發(fā)明實施例提供的檢測國家陰性參考品時的內標檢測情況；圖4為本發(fā)明實施例提供的檢測4份HCV陽性樣本結果
具體實施例方式實施例I HBV陰陽性血清的檢測用帶濾芯吸嘴取5μ I 核酸釋放劑(O. 25% SDS, O. 25% Chaps, 5% (NH4)2SO4,1 %甲酰胺組成。)加入到PCR反應管中。然后分別吸取5μ I待測的血清樣本，陽性對照，陰性對照，已知濃度的HBV DNA陽性病毒血清(1000IU/ml，500IU/ml)，加入到核酸釋放劑中，移液器輕輕吸打5-8次，室溫靜止10分鐘。然后根據反應數在每管中加入I μ I內標(已知的陽性內對照-500copies/y 1)，最后加入40μ I已配置好的PCR反應液，反應液組成如下，于Bio-Rad IQ5進行熒光定量PCR擴增，程序如下。PCR反應液組分
~^·Γ
IOXBuffer5. O μ I
權利要求
1.一種快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，包括核酸釋放試劑、核酸擴增試劑、對照品、標準品和內標，其特征在于所述核酸釋放試劑為SDS、3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(Chaps)、(NH4)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸釋放試劑按體積百分比為O. 25% SDS,O. 25% Chaps,5% (NH4) 2S04、I % 甲酰胺，余量為水。
2.按權利要求I所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，其特征在于所述標準品為為非感染性肝炎病毒DNA或RNA ;所述對照品為陰性對照為無菌雙蒸水，陽性對照為非感染性肝炎病毒DNA或RNA。
3.按權利要求I所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，其特征在于所述核酸擴增試劑為 I. 5-5mM 的 MgCl2, 20-50mM Tris-HCl，pH8. 3-8. 5，35_75mM 的 KCl，2. 5_4mM 的dNTP, I. 25-5U Taq 酶，O. 1-0. 5UUNG 酶，50_200nM 探針，50_200nM 內標探針，50_750nM 肝炎病毒上下游引物。
4.按權利要求3所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，其特征在于所述模板為DNA時，酶混合液為Taq酶5U和UDG酶O. 5U ;模板為RNA時，酶混合液為Taq酶5U、UDG酶O. 5U和反轉錄酶100U。
5.按權利要求3所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，其特征在于所述dNTPs的組成比例為dATP dCTP dGTP dUTP = I :1:1:1: 2(體積比)；所述的PCR增強劑為 O. I 5mg/mlBSA, 5 500mmol/L 海藻糖，O. I 5M Betaine 和 O. 01 % I % 明膠的混合水溶液。
6.按權利要求3所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，其特征在于所述肝炎病毒為乙肝HBV時；探針5’ TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’ 3 上游引物5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’ 3 ； 下游引物5’ AGCGCCGACGGGACGTAGAC’ 3 ； 內標探針5’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’ 3 ;其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、J0E、HEX和TET中的一種熒光基團。
7.按權利要求3所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒，其特征在于所述肝炎病毒為丙肝HCV時；探針5’ TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’ 3 上游引物5’ GAGAGCCATAGTGGTCTG’ 3 ； 下游引物5’ GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’ 3 ； 內標探針5 ’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC ’ 3，其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、J0E、HEX和TET中的一種熒光基團。
8.一種按照權利要求I所述的快速定量檢測病原微生物核酸的試劑盒的檢測方法，其特征在于將待測樣品，標準品和對照品分別加入核酸釋放劑混合均勻，室溫靜止10分鐘后，加入核酸擴增試劑進行PCR擴增；所述核酸釋放試劑SDS、3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(Chaps)、(MM)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸釋放試劑按體積百分比為O.25% SDS,O. 25% Chaps,5% (NH4) 2S04、I % 甲酰胺，余量為水。
9.按權利要求8所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒的檢測方法，其特征在于所述肝炎病毒為乙肝HBV時；探針5’ TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’ 3上游引物5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’ 3 ；下游引物5’ AGCGCCGACGGGACGTAGAC’ 3 ； 內標探針5’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’ 3 ;其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一種熒光基團。
10.按權利要求8所述的快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒的檢測方法，其特征在于所述肝炎病毒為丙肝HCV時；探針5’ TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’ 3上游引物5’ GAGAGCCATAGTGGTCTG’ 3 ；下游引物5’ GCGGGTTGATCCAAGAAAGG’ 3 ； 內標探針5 ’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC ’ 3，其中探針和內標探針分別標記FAM、Alexa546、JOE、HEX和TET中的一種熒光基團。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學臨床診斷領域，具體說是快速定量檢測肝炎病毒核酸的試劑盒及檢測方法。包括核酸釋放試劑、核酸擴增試劑、對照品、標準品、內標和模板，所述核酸釋放試劑SDS、3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(Chaps)、(NH4)2SO4和甲酰胺的水溶液，其中核酸釋放試劑按體積百分比為0.25％SDS、0.25％Chaps、5％(NH4)2SO4、1％甲酰胺，余量為水。本發(fā)明的優(yōu)點在于一種能夠高效快速釋放肝炎病毒核酸的釋放試劑的發(fā)明和使用。在核酸釋放劑的作用下，核酸能夠直接從微量樣品中釋放出來，直接加入PCR反應液進行熒光定量檢測，從而實現(xiàn)快速核酸檢測。無需單獨提取樣本核酸，直接在PCR反應管內完成核酸提取與熒光定量PCR的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102827947SQ20111016429
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權日2011年6月17日
發(fā)明者李望豐, 李靜芝, 周凱, 許守民, 劉立俠 申請人:東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司