專利名稱：一種快速高效獲得抗原特異性b細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種快速高效獲得抗原特異性B細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
分離、培養(yǎng)及鑒定產(chǎn)生特異性結(jié)合某目標(biāo)抗原的抗體的B細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域研究中是非常重要的。這種B細(xì)胞可以用于制備抗原特異性抗體以及回收編碼這種抗體的核酸序列，還可用于抗原結(jié)合特性分析等功能測定?？贵w由B細(xì)胞產(chǎn)生，可以用于鑒定外源性或內(nèi)源性抗原，如毒素、細(xì)菌、病毒、細(xì)胞因子、酶等。每種抗體結(jié)合于抗原的特定表位?？贵w識別特異性表位且與之結(jié)合的能力使 抗體成為有用的治療和診斷工具。目前所使用的，獲得免疫系統(tǒng)中針對某種抗原的B細(xì)胞，并制備單克隆抗體的方法主要為雜交瘤技術(shù)。即用抗原免疫動物，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，然后用該動物的脾細(xì)胞(含大量B細(xì)胞)與能無限增殖的骨髓瘤細(xì)胞系融合以形成雜交瘤，通過分泌抗體的抗原特異性檢測進(jìn)行雜交瘤篩選鑒定，獲得分泌針對目標(biāo)抗原抗體的細(xì)胞克隆。但是抗原特異性B細(xì)胞在脾臟細(xì)胞中的“豐度”使分離抗原特異性克隆變得隨機(jī)性很大。當(dāng)尋找具體的表位特異性或功能活性的B細(xì)胞時，人們希望這一 B細(xì)胞經(jīng)過某種篩選過程，以使獲得目的單克隆抗體的成功率變得更大。此外，可在篩選獲得的抗原特異性B細(xì)胞中克隆抗體的可變區(qū)基因序列，將其構(gòu)建成全長抗體后，在合適的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)如哺乳動物細(xì)胞或者細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，直接得到目標(biāo)單克隆抗體。因此，一種能夠快速、高效獲得產(chǎn)生針對某抗原特異性抗體的B細(xì)胞的方法對于生物學(xué)基礎(chǔ)研究和抗體相關(guān)的診斷和治療產(chǎn)品的開發(fā)是很有價值的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速高效獲得抗原特異性B細(xì)胞的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種富集目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞(群體)的方法，包括從含有B細(xì)胞的群體中富集CD19+/IgG+且能夠與目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞為目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞。在一個優(yōu)選例中，所述含有B細(xì)胞的群體是含有目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞的群體。在另一優(yōu)選例中，所述從含有B細(xì)胞的群體中富集⑶19+/IgG+且能夠與目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞的步驟進(jìn)行至少一次，如進(jìn)行1-20次。在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)抗原是病毒侵染動物體的關(guān)鍵蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)抗原來源于(但不限于)流感病毒，負(fù)黏液病毒，皰疹病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，Hiv病毒，手足口病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)抗原包括(但不限于)來源于流感病毒的血凝素蛋白(HA)，來源于狂犬病病毒但狂犬病毒G蛋白。
在另一優(yōu)選例中，利用⑶19結(jié)合分子和IgG結(jié)合分子來富集⑶19+/IgG+的B細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，以不同的可識別信號來標(biāo)記所述的⑶19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子以及目標(biāo)抗原，從而富集CD19+/IgG+且能夠與該目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的可識別信號是熒光標(biāo)記物，不同的熒光標(biāo)記物具有不同的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長。在另一優(yōu)選例中，所述的⑶19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子和目標(biāo)抗原可同時加入到含有B細(xì)胞的群體中以富集目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞(即CD19結(jié)合分子和IgG結(jié)合分子、目標(biāo)抗原組合使用)；或者，所述的CD19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子和目標(biāo)抗原分批次加入到含有B細(xì)胞的群體以富集目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞(即CD19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子和目標(biāo)抗原分開使用)。在另一優(yōu)選例中，以熒光染料FITC標(biāo)記⑶19結(jié)合分子；以熒光染料APC標(biāo)記IgG·結(jié)合分子；以熒光染料Cy3標(biāo)記目標(biāo)抗原。在另一優(yōu)選例中，所述的以熒光染料Cy3標(biāo)記目標(biāo)抗原的步驟包括先將目標(biāo)抗原與生物素(biotin)偶聯(lián)，獲得目標(biāo)抗原-生物素偶聯(lián)物；然后將與熒光染料Cy3偶聯(lián)的鏈霉菌親和素(Streptavidin)與目標(biāo)抗原-生物素偶聯(lián)物反應(yīng)，從而獲得以熒光染料Cy3標(biāo)記的目標(biāo)抗原。在另一優(yōu)選例中，所述的⑶19結(jié)合分子是抗⑶19抗體；或所述的IgG結(jié)合分子是抗IgG抗體。在另一優(yōu)選例中，采用流式細(xì)胞術(shù)富集⑶19+/IgG+且能夠與該目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備目標(biāo)抗原特異性的抗體的方法，包括(a)從含有B細(xì)胞的群體中富集⑶19+/IgG+且能夠與該目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞為目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞；(b)從(a)的目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞中獲得抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；(C)將(b)的抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因分別與重鏈恒定區(qū)基因和輕鏈恒定區(qū)基因連接，從而表達(dá)獲得目標(biāo)抗原特異性的抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于富集目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞的試劑盒，包括CD19結(jié)合分子；IgG結(jié)合分子和目標(biāo)抗原；以及至少三種不同的可識別信號，分別用于標(biāo)記所述的抗CD 19抗體、抗IgG抗體和目標(biāo)抗原；或包括分別以三種不同的可識別信號標(biāo)記的⑶19結(jié)合分子，IgG結(jié)合分子和目標(biāo)抗原。在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)抗原來源于(但不限于)流感病毒，負(fù)黏液病毒，皰疹病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒，手足口病毒；或所述的可識別信號是熒光標(biāo)記物，選自(但不限于)FITC，Cy3，Cy5，APC0在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中包括熒光染料FITC標(biāo)記的⑶19結(jié)合分子；熒光染料APC標(biāo)記的IgG結(jié)合分子和熒光染料Cy3標(biāo)記的目標(biāo)抗原。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)的其它試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括使用說明書。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、HA/RBD(SARS S蛋白受體結(jié)合區(qū))蛋白標(biāo)記生物素(biotin)。(A)HA-biotin活性檢測；(B)RBD-biotin活性檢測。圖2、抗原特異性目的B細(xì)胞的流式細(xì)胞分選圖。
A :45. 9%表示外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中單核淋巴細(xì)胞群，主要包括B細(xì)胞和T細(xì)胞；B :CD19+和IgG+(即CD19和IgG雙陽性)的細(xì)胞為記憶性B細(xì)胞，占O. 64% ；C : RBD-Fc，同型對照；D HA特異性記憶B細(xì)胞，約占總的記憶B細(xì)胞O. 61 %。圖3、所制備全人單克隆抗體的濃度。其中，1C4 5A6指21株全人單克隆抗體；Vector指僅瞬轉(zhuǎn)表達(dá)載體骨架IgH、IgL于293T細(xì)胞的情形。圖4、ELISA檢測所制備全人單克隆抗體對HA蛋白的結(jié)合情況。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人致力于研究快速、高效分離抗原特異性B細(xì)胞克隆群體的方法。經(jīng)過深入研究，揭示了特別適合于鑒別B細(xì)胞的表面標(biāo)志物，并以特定的抗原篩選包含能與該抗原結(jié)合的抗體的B細(xì)胞。本發(fā)明的方法獲得的B細(xì)胞的克隆群體可用于B細(xì)胞功能研究，制備抗原特異性單克隆抗體以及回收編碼這種抗體的可變區(qū)基因序列。如本文所用，所述的“抗原”是指一種免疫原，其在刺激B細(xì)胞群體后，能夠使得一些B細(xì)胞分泌對該抗原有特異性結(jié)合的抗體。所述的抗原例如來源于流感病毒，負(fù)黏液病毒，皰疹病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒，手足口病毒等等。如本文所用，所述的“目標(biāo)抗原”是指感興趣的抗原，需要分離對該抗原有特異性結(jié)合的特異性B細(xì)胞。所述目標(biāo)抗原可以是抗體可結(jié)合的任何物質(zhì)，包括但不限于肽、蛋白質(zhì)或其片段；碳水化合物；有機(jī)和無機(jī)分子；由動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和病毒產(chǎn)生的受體；酶；生物途徑的激動劑和拮抗劑；激素和細(xì)胞因子。如本文所用，“目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞”是指能產(chǎn)生結(jié)合特定目標(biāo)抗原的抗體的B細(xì)胞。如本文所用，所述的“含有B細(xì)胞的群體”是指一種混合細(xì)胞群體，其中包含有能夠分泌對目標(biāo)抗原有特異性結(jié)合的抗體的B細(xì)胞群體。所述的含有B細(xì)胞的群體例如是從宿主外周血、脾臟等中得到的包含目標(biāo)B細(xì)胞的細(xì)胞分離物。如本文所用，“富集”細(xì)胞(群體)是指增加包含在混合細(xì)胞群體中所需目的B細(xì)胞的含量，通常是指提高“目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞”的頻率。因此，富集細(xì)胞群體指因富集步驟而產(chǎn)生的具有更高頻率目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞的細(xì)胞群體，但是這種細(xì)胞群體內(nèi)的B細(xì)胞可來源于不同的生殖系(Germline),且分泌可變區(qū)基因不同的抗體。
如本文所用，“細(xì)胞群體”包括富集前和富集后細(xì)胞群體，當(dāng)進(jìn)行多個富集步驟時，細(xì)胞群體可以是富集前和富集后的。每種細(xì)胞群體可直接用于下一步驟，可部分或全部冷凍用于長期或短期貯藏并用于隨后的步驟。同時，細(xì)胞群體的細(xì)胞可單獨(dú)進(jìn)行懸浮以得到單細(xì)胞懸浮液。一種或多種抗原特異性單細(xì)胞懸浮液可一起鋪板用于進(jìn)一步分析或分離其產(chǎn)生的抗體。如本文所用，所述的“可識別信號”是指與CD19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子或目標(biāo)抗原結(jié)合或偶聯(lián)的、用于指示(或作為指示標(biāo)志)CD19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子或目標(biāo)抗原與B細(xì)胞發(fā)生結(jié)合的信號。本發(fā)明提供了分離抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體的方法，包括從含有B細(xì)胞的群體中富集CD19+/IgG+雙陽性且能夠與目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞為目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞。⑶19是B細(xì)胞特異性的標(biāo)記，表達(dá)于除漿細(xì)胞之外一切B細(xì)胞；IgG是已進(jìn)行亞型轉(zhuǎn)換的成熟B細(xì)胞表面標(biāo)記，因此使用⑶19結(jié)合分子(如抗⑶19抗體)和IgG結(jié)合分子(如抗IgG抗體)就可以從含有B細(xì)胞的群體中分離B細(xì)胞(記憶性B細(xì)胞)。為了獲得·目標(biāo)抗原特異性的B細(xì)胞,因此加上目標(biāo)抗原作為篩選標(biāo)記(Marker)。本發(fā)明所述方法可用于富集(或分離)至少一種目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞。本發(fā)明的方法包括能分開、組合、連續(xù)、重復(fù)或周期地使用的一系列培養(yǎng)和選擇步驟。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于分離至少一種目標(biāo)抗原特異性細(xì)胞，所述目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞能用于產(chǎn)生對目標(biāo)抗原有特異性結(jié)合的單克隆抗體或編碼這種抗體的基因序列。富集帶有特定的可識別信號的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，多種富集細(xì)胞的方法均可用于本發(fā)明。本發(fā)明中，較佳地，通過在CD19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子或目標(biāo)抗原上設(shè)置不同的可識別信號，根據(jù)判讀B細(xì)胞上存在的可識別信號，來富集細(xì)胞群體。根據(jù)分選方法的不同，可以選擇不同類型的可識別信號。例如，通過流式細(xì)胞分選方法富集細(xì)胞群體以形成包含至少一種抗原特異性B細(xì)胞的富集細(xì)胞群體，所采用的可識別信號較佳地為熒光染料，根據(jù)熒光染料特定的激發(fā)光波長或發(fā)射光波長來判讀。本發(fā)明的方法可以測定任何目標(biāo)抗原的抗體特異性結(jié)合情況。在利用多于一個富集步驟的方法中，在每個富集步驟中使用的目標(biāo)抗原可以是彼此相同或不同的。使用相同的目標(biāo)抗原進(jìn)行多次的富集步驟，可以提高最終的細(xì)胞群體中該目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞的比例。針對相同抗原的多個富集步驟可產(chǎn)生大的和/或不同的抗原特異性富集細(xì)胞群體；針對不同抗原的多個富集步驟可產(chǎn)生對不同抗原有交叉特異性的富集細(xì)胞群體。在本發(fā)明的抗體制備方法中，優(yōu)選在抗原特異性B細(xì)胞的克隆群體富集步驟和培養(yǎng)步驟之后制備抗體。本方法包括對從一個或多個分離的抗原特異性細(xì)胞中進(jìn)行抗體可變區(qū)基因基因擴(kuò)增并進(jìn)行測序的步驟。可使用本領(lǐng)域已知的用于測序的任何方法，對重鏈、輕鏈可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)進(jìn)行測序。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包括以下步驟的方法a)制備包含至少一種抗原特異性B細(xì)胞的細(xì)胞群體；b)例如通過流式細(xì)胞分選方法富集細(xì)胞群體以形成包含至少一種抗原特異性B細(xì)胞的富集細(xì)胞群體；
c)從富集B細(xì)胞群體中分離單個B細(xì)胞；且d)測定單個B細(xì)胞是否產(chǎn)生針對抗原有特異性的抗體。本發(fā)明公開的B細(xì)胞選擇、分離方案有很多優(yōu)勢，包括但不限于下列首先，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)用本方法制備針對目的抗原(如流感血凝素(HA)蛋白)的抗原特異性B細(xì)胞時，所獲得的抗原特異性B細(xì)胞來源于不同的生殖系，能產(chǎn)生結(jié)合HA蛋白多種不同表位的抗體。第二，運(yùn)用本發(fā)明的B細(xì)胞篩選方案可獲得經(jīng)過體細(xì)胞高頻突變的成熟B細(xì)胞，由其得到的抗體通常具有很高的親和力。第三，運(yùn)用本發(fā)明的B細(xì)胞篩選方案可得到對靶抗原具有高選擇性(抗原特異性) 且為IgG亞類的B細(xì)胞。第四，本發(fā)明B細(xì)胞選擇方案傾向于可重現(xiàn)地產(chǎn)生具有抗原特異性的抗體序列，所述抗體序列包含了抗體重輕鏈可變區(qū)基因的完整結(jié)構(gòu)，即具有完整的FWR1，F(xiàn)WR2，F(xiàn)WR3，CDRl，CDR2, CDR2, CDR3, D 區(qū)和 J 區(qū)?？傊?，本發(fā)明方法可通過使用比先前已知的更有效率的方案用于產(chǎn)生對更多不同表位顯示更高結(jié)合親和力的抗體。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。本發(fā)明以從接種2009年甲型HlNl流感疫苗志愿者體內(nèi)獲得HA蛋白特異性B細(xì)胞為例，詳細(xì)說明本方法具體操作過程。實(shí)施例I、HA蛋白表達(dá)純化根據(jù)2009 年甲型 HlNl 流感病毒(A/California/7/2009 (HlNl)，購自華蘭生物工程股份有限公司)HA蛋白基因組序列，構(gòu)建表達(dá)載體，使用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞(Bac-to-Bac)蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。具體如下I.取得目的基因模板HA的GenBank號為FJ966082. I (由TAKARA公司全基因合成該目的基因模板)。2.引物的設(shè)計與合成，加入酶切位點(diǎn)(EcoRI/XhoI)；按照引物設(shè)計原則,使用Primer premier5. O軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。序列分別為HA-SP :5’ -CCG |GAATTC| TACTTCCGTTATGATCATC-3j (SEQ ID NO :1)HA-AS :5’ -CCG |CTCGAG| TTAAATACATATTCTAC-3’ (SEQ ID NO :2)引物序列中的方框分別表示限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I位點(diǎn)。3.目的基因進(jìn)行常規(guī)方法PCR擴(kuò)增；按照以下50ul體系加入各反應(yīng)物并混合均勻
2 XPfu Plus PCR Master Mix(購自 TIANGEN) 25 μ 引物1+lul
模板Ιμ
ddH2022μ1將加好的反應(yīng)體系按下列反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C，5min ;(94°C，45sec ；55°C,45sec ；72°C,2min ；32 循環(huán))；72°C,5min ;4°C，終止。4.擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoR I (TAKARA)和Xho I (TAKARA)酶切然后割膠回收；5. pFastBac-HTb 質(zhì)粒(購自 Invitrogen)使用限制性內(nèi)切酶 EcoR I (TAKARA)和Xho I (TAKARA)酶切，然后割膠回收；·6.目的基因與載體的連接，獲得pFastBac-HA-His ；7.感受態(tài)DH5a (購自Transgen)的轉(zhuǎn)化、涂板、挑克隆、搖菌；8.菌液PCR驗(yàn)證；9.小量抽提質(zhì)粒(試劑盒購自TIANGEN)；10.測序，經(jīng)BLAST驗(yàn)證，100%匹配；11.感受態(tài)DHlOBac的重組轉(zhuǎn)位、涂板、挑克隆、搖菌；12.菌液PCR驗(yàn)證，采用Ml3通用引物，序列為M13-SP :5’ -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’ (SEQ ID NO 3)M13-AS :5，-AGCGGATAACAATTTCACACAAGG-3’ (SEQ ID NO 4)13.常規(guī)方法進(jìn)行Bacmid粘粒的大量抽提與純化。I. 2、HA-His蛋白的細(xì)胞表達(dá)I. 2. I病毒包裝，脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染(6孔板)I. 2. I. I轉(zhuǎn)染前一天鋪板，3孔(9父105個/孔)。I. 2. I. 2首先觀察High Five細(xì)胞(購自Invitrogen),細(xì)胞長至50-80%可以轉(zhuǎn)染。I. 2. I. 3在6個I. 5ml離心管中各加入ΙΟΟμ I的Sf900II SFM(沿管壁加，不要有氣泡)，6個離心管中分為3個A管，3個B管。1.2. I. 4在B管中加入10 μ I的脂質(zhì)體，加進(jìn)去后用搶輕輕吹打混勻。I. 2. I. 5在A管中加入4 μ g的質(zhì)粒(Bacmid粘粒)，同樣用移液槍輕輕吹打混勻。I. 2. I. 6待前面兩步全部加完后，在用手指輕彈一下，保證充分混勻。I. 2. I. 7用微量移液器將A管中的液體全部轉(zhuǎn)移至B管中，吸A管中的液體時，注意用搶混勻，吹時沿著管壁減少氣泡的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)移至B管中后在用微量移液器上下吹打幾次，保證混勻。1.2. I. 8 靜置 15 分鐘。I. 2. I. 9取IOOOml微量移液器在I. 5ml離心管中補(bǔ)加入800 μ I Sf900II SFM，共約Iml左右。I. 2. I. 10用吸管吸去六孔板之前的培液，用微量移液器沿孔壁慢慢加入Iml的混合物(加液體的時候速度要慢)，蓋上蓋子，做好標(biāo)記。I. 2. I. 11放入37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。I. 2. I. 12培養(yǎng)6-8小時后，將轉(zhuǎn)染液吸去，重新?lián)Q新鮮的培養(yǎng)液(Sf900IISFM)3ml。I. 2. I. 13繼續(xù)培養(yǎng)72小時。I. 2. I. 1472小時后，開始收細(xì)胞上清(第一代重組桿狀病毒)和細(xì)胞裂解液。3000rpm離心5min，將細(xì)胞上清，即第一代病毒凍存于_70°C ;將離下的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，充分振蕩使細(xì)胞裂解，或超聲若干次(5秒一次)，100°C反應(yīng)五分鐘，凍存于_20°C。I. 3、HA-His 蛋白的純化 ①前期預(yù)處理20mM PB (pH 5. 89)透析過夜，O. 45mm孔徑膜抽濾；②純化方法先后以Q-FF柱和SP柱(購自GE Healthcare)串聯(lián)純化利用羥基磷灰石填料柱(購自Bio-rad)進(jìn)行精細(xì)純化；③Q-FF與SP串聯(lián)純化后，用SDS-PAGE檢測純化效果，如圖IA (SDS-PAGE)和B (Western Blot)。Q-FF柱和SP柱串聯(lián)純化方法①平衡柱子，使用Buffer A (Buffer A :20mM磷酸鈉，I. OmM EDTA，0. 01%表面活性劑-NP9，5%丙三醇，pH 5. 89)進(jìn)行平衡，3ml/min流速，直至吸光值平穩(wěn)，約10個柱體積；②上樣，暫停純化儀，將進(jìn)液管從Buffer A中取出，插入預(yù)處理好的樣本中，2ml/min流速進(jìn)行上樣，并收集穿透；③再平衡，當(dāng)樣品上樣完畢時，將進(jìn)液管取出，放入Buffer A中，2ml/min流速直至吸光值再次平穩(wěn)；④使用Buffer B (20mM磷酸鈉，O. 03 % Tergitol (表面活性劑)，5 %丙三醇，pH
7.02)洗脫，并收集洗脫樣本，直至吸光值平穩(wěn)；⑤使用Buffer C(20mM 磷酸鈉，150mM NaCl，O. 03 % Tergitol，5 % 丙三醇，pH
7.02)洗脫，并收集洗脫樣本，直至吸光值平穩(wěn)；⑥最后用O. 5M氫氧化鈉清洗柱子上的所有雜蛋白，不收集。羥基磷灰石填料柱純化方法⑦平衡柱子，使用buffer B進(jìn)行平衡，3ml/min流速，直至吸光值平穩(wěn)，約10個柱體積；⑧上樣，暫停純化儀，將進(jìn)液管從buffer B中取出，插入預(yù)處理好的樣本中，2ml/min流速進(jìn)行上樣，并收集穿透；⑨再平衡，當(dāng)樣品上樣完畢時，將進(jìn)液管取出，放入buffer B中，2ml/min流速直至吸光值再次平穩(wěn)；⑩使用bufferD (40mM 磷酸鈉，O. 05% Tween-20，5% 丙三醇，pH 7.20)洗脫，并收
集洗脫樣本，直至吸光值平穩(wěn)；(11)使用 buffer E (IOOmM 磷酸鈉，O. 05% Tween-20，5%丙三醇，pH 7. 20)洗脫，
并收集洗脫樣本，直至吸光值平穩(wěn)；(12)最后用O. 5M氫氧化鈉清洗柱子上的所有雜蛋白，不收集。實(shí)施例2、HA蛋白生物素標(biāo)記以及檢測
I、HA蛋白生物素標(biāo)記(I)根據(jù)Sulfo-NHS-LC-Biotin手冊(Pierce)計算加入生物素試劑的量按照每mo I蛋白對應(yīng)20mol生物素計算，Iml O. 3mg/ml的HA蛋白需要生物素(IOmM)試劑量
權(quán)利要求
1.一種富集目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞的方法，其特征在于，包括從含有B細(xì)胞的群體中富集CD19+/IgG+且能夠與目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞為目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)抗原是病毒侵染動物體的關(guān)鍵蛋白。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)抗原來源于流感病毒，負(fù)黏液病毒，皰疫病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒,手足口病毒。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，利用CD19結(jié)合分子和IgG結(jié)合分子來富集CD19+/IgG+的 B 細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，以不同的可識別信號來標(biāo)記所述的CD19結(jié)合分子、IgG結(jié)合分子以及目標(biāo)抗原，從而富集CD19+/IgG+且能夠與該目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，以熒光染料FITC標(biāo)記CD19結(jié)合分子；以熒光染料APC標(biāo)記IgG結(jié)合分子；以熒光染料Cy3標(biāo)記目標(biāo)抗原。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的CD19結(jié)合分子是抗CD19抗體；或所述的IgG結(jié)合分子是抗IgG抗體。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，采用流式細(xì)胞術(shù)富集CD19+/IgG+且能夠與該目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞。
9.一種制備目標(biāo)抗原特異性的抗體的方法，其特征在于，包括 (a)從含有B細(xì)胞的群體中富集CD19+/IgG+且能夠與該目標(biāo)抗原結(jié)合的B細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞為目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞； (b)從(a)的目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞中獲得抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因； (C)將(b)的抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因分別與重鏈恒定區(qū)基因和輕鏈恒定區(qū)基因連接，從而表達(dá)獲得目標(biāo)抗原特異性的抗體。
10.一種用于富集目標(biāo)抗原特異性B細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包括 CD19結(jié)合分子；IgG結(jié)合分子和目標(biāo)抗原；以及至少三種不同的可識別信號，分別用于標(biāo)記所述的抗CD19抗體、抗IgG抗體和目標(biāo)抗原； 或包括 分別以三種不同的可識別信號標(biāo)記的CD19結(jié)合分子，IgG結(jié)合分子和目標(biāo)抗原。
11.如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述的目標(biāo)抗原來源于流感病毒，負(fù)黏液病毒，皰疫病毒，狂犬病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV病毒，手足口病毒；或 所述的可識別信號是熒光標(biāo)記物，選自FITC，Cy3，Cy5，APC0
12.如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，其中包括 熒光染料FITC標(biāo)記的CD19結(jié)合分子；熒光染料APC標(biāo)記的IgG結(jié)合分子和熒光染料Cy3標(biāo)記的目標(biāo)抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速高效獲得抗原特異性B細(xì)胞的方法。提供了特別適合于鑒別B細(xì)胞的表面標(biāo)志物，并以特定的抗原篩選包含能與該抗原結(jié)合的抗體的B細(xì)胞。本發(fā)明的方法可快速、高效獲得抗原特異性B細(xì)胞。
文檔編號C12N15/13GK102839152SQ201110165320
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者孫兵, 陳愛中, 邊超, 王凌凌 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院