專利名稱：Sanger測序反應優(yōu)化劑及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種Sanger測序反應優(yōu)化劑，具體地說是一種在Sanger測序反應體系對測序峰圖、讀長具有很好的優(yōu)化作用的優(yōu)化劑，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
Sanger測序法主要包括樣品制備、樣品檢測、測序反應體系的建立、測序反應純化、熒光檢測5個步驟，其中測序反應體系的建立是Sanger測序法的精髓所在，反應體系中加入具有4種不同顏色熒光標記的ddNTP，完成反應中止及熒光標記，從而在機器檢測時發(fā)現(xiàn)4種不同顏色的熒光標記，讀取對應熒光顏色獲取4種堿基信息?，F(xiàn)今ABI的3730XL能夠獲得500bp的高質量峰圖及序列結果，500bp之后的峰圖及序列的準確性有很大程度的下降。在實際操作過程中，我們往往想要獲得更長的序列和更準確的結果，所以我們通過實驗獲取相關優(yōu)化劑優(yōu)化測序反應體系，獲得更好的峰圖及序列結果。

發(fā)明內容
為了彌補現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提出一種Sanger測序反應優(yōu)化劑，能夠對測序反應結果起到顯著的效果，使測序讀長更長，序列更準確。本發(fā)明的另一目的在于提出一種上述優(yōu)化劑的制備方法。本發(fā)明的第三目的在于提出一種上述優(yōu)化劑的推薦使用方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明思路為本發(fā)明的發(fā)明思路為甜菜堿、二硫蘇糖醇、DMSO都有很好的針對復雜模板的擴增調控作用，優(yōu)化各種試劑的配制即不影響測序體系中對熒光染料的干擾又要達到既定效果，我們根據大量實驗及合理配制各種試劑的濃度達到最好的結果。本發(fā)明具體技術方案為一種Sanger測序反應優(yōu)化劑，該優(yōu)化劑包括甜菜堿(Betaine)、二硫蘇糖醇 (DTT)、DMSO和BSA ；其配比為2. 7 5mol/L Betaine、3 10mmol/L DTT、3% 8% DMS0、30 80mg/L BSA。所述各成分的最佳配比為2. 7mol/L Betaine、6. 7mmol/L DTT、6. 7% DMS0、55mg/L BSA。一種所述的Sanger測序反應優(yōu)化劑的制備方法，具體步驟如下(1)按照上述的甜菜堿配比配制甜菜堿；(2)在配置好的甜菜堿中加入按權利要求1或2的比例配制的DTT、DMSO及BSA， 混合均勻；(3)過濾除菌，分裝后-20°C保存。上述優(yōu)化劑在Sanger測序反應中的應用。上述的應用，其中，在Sanger測序反應體系中加入1/5測序反應體系體積的權利要求1或2所述的優(yōu)化劑。注意事項(I)Betaine為一水合物，非鹽酸鹽化合物，加水溶解后添加其它成份。(2) DTT現(xiàn)用現(xiàn)配，保證試劑新鮮，-20°C儲存不超過三個月。(3) DMSO為粘稠液體，取樣準確。(4) BSA儲存液避免反復凍融。本發(fā)明的優(yōu)點與效益本發(fā)明的優(yōu)化劑由Betaine、DTT、DMSO (二甲基亞砜)、BSA四種成分組成。本發(fā)明在Sanger測序法反應制備時添加1/5體積優(yōu)化劑，建立一種新的測序反應制備體系，在堿基讀長及準確性上有顯著提高。本發(fā)明的優(yōu)化劑與不添加優(yōu)化劑相比，只需少量添加即可得到讀長更長，峰型更優(yōu)，結果更準，重復性更好，穩(wěn)定性更佳，對特殊結構及高GC含量的困難模板具有優(yōu)化作用，對分子生物學測序技術提供使用價值。本發(fā)明提供了制備方法。


圖1為未添加優(yōu)化劑的測序峰圖前200bp處，背景峰高，測序效果不理想。圖2為添加優(yōu)化劑的測序峰圖前200bp處，背景峰低，測序效果理想。圖3為未添加優(yōu)化劑的測序峰圖500_520bp處，重復結構處峰圖紊亂且影響后續(xù)峰圖，測序效果不理想。圖4為添加優(yōu)化劑的測序峰圖500_520bp處，重復結構不影響峰圖，測序效果理
術g
；ο圖5為未添加優(yōu)化劑的測序峰圖在600bp處終止。圖6為添加優(yōu)化劑的測序峰圖在SOObp處任然有有效峰圖。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明優(yōu)化劑的制備優(yōu)化劑成分2. 7mol/L Betaine、6. 7mmol/L DTT、6. 7% DMSO>55 μ g/mlBSA。具體制備方法(1)配制 2. 7mol/L Betaine (Sigma 公司彡 98 % )
在50ml容器中加入18. 2g Betaine,加入40ml dd H2O充分溶解。(2)配制 lmol/L DTT 用20ml 0. 01mol/L乙酸鈉(北京化學試劑公司AR)溶液(pH5. 2)溶解 3. 09gDTT(Sigma 公司 BioUltra，for molecular biology, ^ 99. 5% (RT))，過濾除菌后分裝成Iml小份貯存于-20°C。(3)將 lmol/L DTT 加入到 2. 7mol/L Betaine 溶液中50ml 體積中加入 3. 35ml lmol/L DTT 稀釋為 6. 7mmol/L DTT。(4)加入DMSO (北京化學試劑公司AR)50ml 體積中加入 3. 35ml 100% DMSO 稀釋為 6. 7% DMSO0(5)加入 BSA
50ml 體積中加入 275 μ 1 10mg/ml 標準 BSA 稀釋為 55 μ g/ml。(6)過濾除菌使用0. 22 μ m過濾器過濾除菌，Iml/管分裝后，_20°C保存。實施例2本發(fā)明優(yōu)化劑的制備優(yōu)化劑成分5mol/L Betaine、3mmol/L DTT、8% DMS0、80 μ g/mlBSA。按照上述成分配比采用現(xiàn)有技術方法配制。實施例3本發(fā)明優(yōu)化劑的制備優(yōu)化劑成分3mol/L Betaine、10mmol/L DTT>3% DMS0、30 μ g/mlBSA。按照上述成分配比采用現(xiàn)有技術方法配制。實施例4本發(fā)明優(yōu)化劑的具體應用例本發(fā)明“基于Sanger測序法的反應優(yōu)化劑”通過專業(yè)分析軟件分析測序結果，對比峰圖及序列，對峰圖結構、堿基讀長和堿基的準確性上有顯著的提高。一、基于Sanger測序法的反應優(yōu)化劑的實驗方法測序反應優(yōu)化劑的具體操作如下1、按照BigDye V3. 1試劑盒使用說明操作，在20 μ 1體系中加入4 μ IBigDye，2 μ 1 BigDyeBuffer，引物3. 2pmol,Template適當，1/5體積的實施例1制備的優(yōu)化劑，即4μ 1， 補充ddH20至20 μ 12、按照下面的程序進行PCR反應
權利要求
1.一種Sanger測序反應優(yōu)化劑，其特征在于，該優(yōu)化劑包括甜菜堿(Betaine)、二硫蘇糖醇(DTT)、DMSO和BSA ；其配比為2.7 5mol/L Betaine、3 10mmol/LDTT、3% 8% DMS0、30 80mg/L BSA。
2.根據權利要求1所述的Sanger測序反應優(yōu)化劑，其特征在于，所述各成分配比為2.7mol/L Betaine、6. 7mmol/L DTT、6. 7% DMS0、55mg/LBSA。
3.—種權利要求1或2所述的Sanger測序反應優(yōu)化劑的制備方法，其特征在于，具體步驟如下(1)按照權利要求1或2所述的甜菜堿配比配制甜菜堿；(2)在配置好的甜菜堿中加入按權利要求1或2的比例配制的DTT、DMSO及BSA，混合均勻；(3)過濾除菌，分裝后-20°C保存。
4.權利要求1或2所述的優(yōu)化劑在Sanger測序反應中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，在Sanger測序反應體系中加入1/5測序反應體系體積的權利要求1或2所述的優(yōu)化劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Sanger測序反應優(yōu)化劑，該優(yōu)化劑包括甜菜堿(Betaine)、二硫蘇糖醇(DTT)、DMSO和BSA；其配比為2.7～5mol/L Betaine、3～10mmol/LDTT、3％～8％DMSO、30～80mg/L BSA。本發(fā)明的優(yōu)化劑由Betaine、DTT、DMSO(二甲基亞砜)、BSA四種成分組成。本發(fā)明在Sanger測序法反應制備時添加1/5體積優(yōu)化劑，建立一種新的測序反應制備體系，在堿基讀長及準確性上有顯著提高。本發(fā)明的優(yōu)化劑與不添加優(yōu)化劑相比，只需少量添加即可得到讀長更長，峰型更優(yōu)，結果更準，重復性更好，穩(wěn)定性更佳，對特殊結構及高GC含量的困難模板具有優(yōu)化作用，對分子生物學測序技術提供使用價值。本發(fā)明提供了制備方法。
文檔編號C12Q1/68GK102329856SQ20111016581
公開日2012年1月25日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權日2010年12月3日
發(fā)明者陳禹保, 黃捷勤 申請人:北京標凱科技有限公司