專利名稱：一種蟬棒束孢菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)就涉及一種蟬棒束孢菌株，同時(shí)涉及該蟬棒束孢菌株在用于接種家蠶培養(yǎng)蟬花方面的用途。
背景技術(shù)：
蟬花是真菌寄生山蟬若蟲(chóng)致死的蟲(chóng)和菌的復(fù)合體，因其頭部長(zhǎng)出的孢梗束形似花蕾故名蟬花。蟬花是一個(gè)古老名貴而極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的蟲(chóng)生真菌。蟬花是清熱、解毒、驅(qū)風(fēng)、 鎮(zhèn)痛和明目的名貴草藥；主治小兒驚風(fēng)、夜啼等。臨床試驗(yàn)表明，蟬花有改善腎功能和減緩腎衰竭并發(fā)癥的作用；蟬花能明顯提高小鼠在常壓缺氧和高溫下的存活時(shí)間，表明其具有抗應(yīng)激和抗疲勞作用，有較好的鎮(zhèn)靜催眠作用。蟬花一般生長(zhǎng)在針闊葉混交林帶，森林覆蓋率為65. 13 %，大多分布在海拔700 950 m，坡度為30 40°的向陽(yáng)坡上，呈明顯的垂直分布狀態(tài)。據(jù)《證類本草》載“蟬花，所在皆有，七月采。生苦竹林者良，花出土上”。其主要產(chǎn)地是在江浙、川、云、貴和福、廣一帶，但產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)蟬花用作藥品和保健食品的需求。在自然基物上培養(yǎng)的蟬花只有子座而無(wú)蟲(chóng)體，外觀上與蟲(chóng)菌復(fù)合的野生蟬花有較大區(qū)別，因此不宜作為藥材上市，只能作為有關(guān)藥品或保健品的加工原料。近年研究蟬棒束孢Osaria cicai/ae)發(fā)酵菌絲體含有多種活性物質(zhì)，如、甘露醇、生物堿、麥角留醇、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、腺苷、維生素E、維生素A，不飽和脂肪酸，以及多種微量元素。并測(cè)定大多數(shù)活性成分高于天然蟬花含量。蟬棒束孢因其與冬蟲(chóng)夏草 {Cordyceps sinensis Sacc)含有相近的化學(xué)成分，所以常作為冬蟲(chóng)夏草的代用品。家蠶和蠶蛹是傳統(tǒng)的優(yōu)質(zhì)滋補(bǔ)品，化學(xué)成分十分豐富，家蠶的傳統(tǒng)利用主要是白僵蠶的利用；以及蛋白質(zhì)，脂肪酸開(kāi)發(fā)成各種食品及保健品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點(diǎn)而提供的一種能獲得與自然山林采集的蟬花一樣的感染體的蟬棒束孢菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供該蟬棒束孢菌株在用于接種家蠶培養(yǎng)蟬花方面的用途。一種Isaria cicadae (蟬棒束孢)青城山-16，其真菌學(xué)特征是
培養(yǎng)性狀在查氏培養(yǎng)基上25 士 1 °C培養(yǎng)14天，菌落直徑70mm，氈狀平展，具有豆汁黃粉層，背面無(wú)色。在薩氏培養(yǎng)基上25士 1°C培養(yǎng)14天，菌落直徑70mm，豆汁黃同心圓粉狀輪層，具淺茶色露珠，背面無(wú)色。個(gè)體產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分生孢子梗生長(zhǎng)于氣生菌絲上，由單生或?qū)ι袝r(shí)5-8個(gè)瓶梗組成的輪生體。瓶狀小梗具有基部膨大的較小瓶梗和基部不膨大的較大瓶梗兩種，其上均有細(xì)長(zhǎng)的管狀端部。小瓶梗9. 6-19. 2MmX2. 7-3Mm;大瓶梗27- 33MmX3_3. 6Mm。分生孢子壁光滑，透明，大小兩型，小孢子長(zhǎng)卵圓形至柱狀，6-7. SMfflX2. 4-3. 6Mm ；大孢子圓錐狀，長(zhǎng)柱狀，8. 4-10. 2ΜπιΧ3. 6- 4. 2Mm，頂端往往為長(zhǎng)柱狀雙細(xì)胞，偶爾具有兩個(gè)分隔的三細(xì)胞，22-25. 8MmX3-3. 6Mm。菌絲寬 1· 5- 2. OMm。該菌種已于2010年7月27日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)),保藏號(hào)CCTCC NO :M2010187，名稱為..Isaria cicadae青城山-16。(一)Isaria cicadae (蟬棒束孢)青城山-16的分離步驟
(1)2003年7月從青城山竹林中采到蟬若蟲(chóng)罹真菌病死亡的新鮮標(biāo)本；
(2)立即從其標(biāo)本的孢梗束膨大如花的頂部，用酒精火焰燒爍滅菌過(guò)的接種針，輕輕挑取少量孢子粉置于滅菌的沙氏培養(yǎng)基斜面上，于自然溫度下培養(yǎng)，3至5天后白色菌落長(zhǎng)滿斜面。(3)用透明膠紙粘菌制作棉蘭染色載玻片，顯微鏡檢，篩選出分生孢子梗生長(zhǎng)于氣生菌絲上，由單生或?qū)ι袝r(shí)5-8個(gè)瓶梗組成的輪生體。瓶狀小梗具有基部膨大的較小瓶梗和基部不膨大的較大瓶梗兩種，其上均有細(xì)長(zhǎng)的管狀端部。小瓶梗 9. 6-19. 2MmX2. 7-3Mm ；大瓶梗27- 33MmX3_3. 6Mm。分生孢子壁光滑，透明，大小兩型， 小孢子長(zhǎng)卵圓形至柱狀，6-7. 8MmX2. 4-3. 6Mm ；大孢子圓錐狀，長(zhǎng)柱狀，8. 4-10. 2MmX3. 6-4. 2Mm，頂端往往為長(zhǎng)柱狀雙細(xì)胞，偶爾具有兩個(gè)分隔的三細(xì)胞，22-25. 8MmX 3-3. 6Mm。 菌絲寬1.5- 2. OMfli。將分離獲得的本發(fā)明菌株，與Samson (1974)描述的(蟬擬青霉 Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson)艮口[Il單棒束抱/saria cicadae.對(duì)比得知，分離菌株青城山-16除具有較長(zhǎng)的披針狀瓶梗和偶見(jiàn)三細(xì)胞分生孢子外，主要個(gè)體特征與其瓶狀小梗4. 2-6. 5 μ mX 2. 5-3. 5 μ m ；分生孢子3. 5-8. OymXl. 5-3. 5 μ m的描述極其相似，因此鑒定為蟬棒束孢(haria cicadae), I命名為Isaria cicat/ae青城山-16。
(二)培賽Isaria cicadae (蟬棒束孢)青城山-16的培養(yǎng)基
用查氏(Capek)、改良查氏(Capek + 0. 05 %蛋白凍)、薩氏(Sabourd)或馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子粉。(三)菌種的保種和傳代一般用薩氏(Sabourd)培養(yǎng)基斜面，每年移接傳代一次。菌種斜面保存于4°C的保鮮室。一種用Isaria cicadae (蟬棒束孢)青城山-16培養(yǎng)蟬花的方法，包括以下步驟
(1)將/sariacicadae)青城山-16 用查氏(Capek)、改良查氏(Capek + 0. 05%蛋白凍)、薩氏(Sabourd)或馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子粉；
(2)采用0.05%吐溫80水將蟬棒束孢孢子從培養(yǎng)皿或試管斜面洗下并稀釋成IXlO6至 IXlO8分生孢子/ml濃度的孢子懸液；
(3)將老熟幼蟲(chóng)或幼蛹輕輕地放入上述孢子懸液中2至3秒鐘后撈起，置入滅菌的具吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，常溫或下保濕(RH值80%以上)培養(yǎng)2至3周獲得蟬花。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知選用家蠶作為感染對(duì)象獲得蟬花，是因?yàn)榧倚Q感染白僵菌所得僵蠶本身是一位傳統(tǒng)中藥，其安全性無(wú)可非議。選用家蠶老熟幼蟲(chóng)或幼蛹作感染體，這樣的蟲(chóng)態(tài)已經(jīng)不吃桑葉，而且對(duì)環(huán)境的微生物有了抗性即不容易感染雜菌，因而會(huì)獲得純凈的蟬花。本發(fā)明利用/saria cicadae著城山-16菌株培養(yǎng)的新鮮孢子粉感染蟲(chóng)能力較強(qiáng)特點(diǎn)，將其接種感染高齡家蠶幼蟲(chóng)或幼蛹后，經(jīng)保濕、保溫培養(yǎng)2至3周獲得蟬花。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
本發(fā)明的蟬棒束孢菌Usaria cicadae)青城山-16的分離步驟
(1)2003年7月從青城山竹林中采到蟬若蟲(chóng)罹真菌病死亡的新鮮標(biāo)本；
(2)立即從其標(biāo)本的孢梗束膨大如花的頂部，用酒精火焰燒爍滅菌過(guò)的接種針，輕輕挑取少量孢子粉置于滅菌的沙氏培養(yǎng)基斜面上，于自然溫度下培養(yǎng)，3至5天后白色菌落長(zhǎng)滿斜面。(3)用透明膠紙粘菌制作棉蘭染色載玻片，顯微鏡檢。篩選出菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與蟬棒 Isaria cicadae^) fttB^ Isaria cicstfei —16。通過(guò)以下例子來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明Isaria cicadae青城山-16的用途。實(shí)施例2:
一種用蟬棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培養(yǎng)蟬花的方法，包括以下步驟
(1)將/sariacicadae)青城山-16 用查氏(Capek)、改良查氏(Capek + 0. 05%蛋白凍)、薩氏(Sabourd)或馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基在下培養(yǎng)孢子粉；
(2)培養(yǎng)1周后，采用0.05%吐溫80水將蟬棒束孢孢子從培養(yǎng)皿或試管斜面洗下并稀釋成IXlO6至IXlO8分生孢子/ml濃度的孢子懸液；
(3)將5齡家蠶輕輕地放入上述孢子懸液中2秒鐘后撈起，置入滅菌的具吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，常溫下保濕(RH值80%以上)培養(yǎng)3周獲得蟬花。實(shí)施例3:
一種用蟬棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培養(yǎng)蟬花的方法，包括以下步驟 (1) (2)步同實(shí)施例2 ；
(3)將5齡家蠶輕輕地放入上述孢子懸液中3秒鐘后撈起，置入滅菌的具吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，下保濕(RH值80%以上)培養(yǎng)3周獲得蟬花。實(shí)施例4
一種用蟬棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培養(yǎng)蟬花的方法，包括以下步驟 (1) (2)步同實(shí)施例2 ；
(3)將已經(jīng)開(kāi)始吐絲并結(jié)成薄薄透明的蠶繭，剪開(kāi)包裹蠶的薄膜取出尚未脫皮的蠶輕輕地放入上述孢子懸液中2秒鐘后撈起，置入滅菌的具吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，下保濕 (RH值80%以上)培養(yǎng)2周獲得蟬花。實(shí)施例5:
一種用蟬棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培養(yǎng)蟬花的方法，包括以下步驟 (1) (2)步同實(shí)施例2 ；
(3)將已經(jīng)結(jié)繭的幼蛹剪開(kāi)包裹蠶的薄膜取出新化的蛹輕輕地放入上述孢子懸液中3 秒鐘后撈起，置入滅菌的具吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，常溫下保濕(RH值80%以上)培養(yǎng)2周獲得蟬花。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種蟬棒束孢菌(Jsaria cicadae)青城山_16，其特征在于所述菌種的保藏號(hào)為 CCTCC NO :M2010187o
2.如權(quán)利要求1所述的蟬棒束孢青城山-16在用于接種家蠶培養(yǎng)蟬花方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蟬棒束孢菌(Isariacicadae)青城山-16及其用途，所述菌種的保藏號(hào)為CCTCCNOM2010187。其真菌學(xué)特征是在查氏培養(yǎng)基上25±1℃培養(yǎng)14天，菌落直徑70mm，氈狀平展，具有豆汁黃粉層，背面無(wú)色。在薩氏培養(yǎng)基上25±1℃培養(yǎng)14天，菌落直徑70mm，豆汁黃同心圓粉狀輪層，具淺茶色露珠。背面無(wú)色。本發(fā)明能獲得與自然山林采集的蟬花一樣的感染體。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102250777SQ20111016591
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者劉愛(ài)英, 羅力, 胡海燕, 趙杰宏, 鄒曉 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)