專利名稱：一種控制蘋果展青霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用植酸(phytic acid)和膠紅酵母mucilaginosa) 結(jié)合使用控制蘋果展青霉素的方法，屬于植物采后病害得控制方法。
背景技術(shù)：
展青霉素又稱棒曲霉素，是青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬等霉菌代謝產(chǎn)生的一種有毒的真菌代謝產(chǎn)物，主要存在于霉爛的水果及制品中，是影響水果及果汁飲料質(zhì)量的主要因素之一。展青霉素是一種世界范圍內(nèi)的水果污染物，在多種水果、水果制品和果酒中均有發(fā)現(xiàn)，特別是蘋果及其加工品，展青霉素的污染相當嚴重。展青霉素的限量標準在大多數(shù)歐美國家為0 - 50 yg/kg;WH0推薦展青霉素在蘋果汁中的最高限量標準為50 μ g/ kg ； 我國相應(yīng)的標準規(guī)定，蘋果、山楂半成品限量標準為100 μ g/kg，果汁、果醬、果酒、罐頭和果脯的限量標準為50 μ g/kg。我國水果及其制品上的展青霉素污染，不僅威脅我國人民的身體健康，而且對我國水果及制品的出口創(chuàng)匯造成影響。引起蘋果采后腐爛的致病菌主要有灰葡萄孢(徹iiriis ci/^rea)和擴展青霉 iPenicillium expansum )?；移咸焰卟粫a(chǎn)生展青霉素，蘋果中的展青霉素主要是由擴展青霉產(chǎn)生的。因此要控制蘋果上的展青霉素，最主要的是防治蘋果污染擴展青霉及其產(chǎn)生
展青霉素。低溫貯藏、氣調(diào)貯藏是抑制水果采后病害的有效方法，但兩者都需要相應(yīng)的設(shè)備， 在廣大的發(fā)展中國家，已有的設(shè)備往往不能滿足大多數(shù)水果的需要。另外，有些致病霉菌比較耐低溫，在冷藏情況下仍能夠在水果上生長，并造成水果腐爛，甚至產(chǎn)生霉菌毒素。有些水果，特別是熱帶亞熱帶水果不能在低溫下貯藏(低溫下貯藏冷害嚴重)，只能在亞低溫下貯藏，此時致病霉菌繁殖仍然比較快，水果在貯藏期的腐爛比較嚴重，產(chǎn)生霉菌毒素，特別是展青霉素的機會就更多。長期以來，控制水果采后病害及霉菌毒素污染的主要措施是使用殺菌劑。殺菌劑的長期和大量使用，嚴重污染環(huán)境，有損于人類健康。美國科學(xué)院 (National Academy of kinces)的一份報告顯示，在用于處理食品的殺菌劑中，60%有致癌的危險性。目前多種殺菌劑(如Captan、Benomyl等)已被美國環(huán)保局明令禁止使用或者在部分水果產(chǎn)品上限制使用。為了保證農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全，各國科學(xué)家都在積極地探索能代替化學(xué)殺菌劑的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。當前國際上對用拮抗微生物進行水果采后病害的生物防治的研究已經(jīng)取得了階段性的成果，并認為這是最有希望取代化學(xué)殺菌劑的方法之一。隨著酵母分類、生態(tài)、生理、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究取得進展，人們對果蔬貯藏中利用酵母的興趣日益提高。國內(nèi)外的研究表明，許多酵母菌應(yīng)用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，這些酵母被稱為拮抗酵母。酵母菌遺傳穩(wěn)定，抑菌譜廣、效價高，一般不產(chǎn)生對人和寄主植物有害的代謝產(chǎn)物，安全性高，且對營養(yǎng)要求低，生長快，并對多種脅迫、逆境具有較強的耐受力，對大多數(shù)殺菌劑不敏感，對其它化學(xué)和物理處理能夠相容。因此近年來拮抗酵母作為水果采后病害生防菌，受到國際上的廣泛關(guān)注。
通過近20年的研究，已經(jīng)有數(shù)十種酵母顯示具有拮抗真菌的特性，特別是假絲酵母屬(Candida )、隱球酵母屬(Cryp tococcus )、畢赤酵母屬iPichia )、紅酵母屬 0 oi/oiorWa)、梅奇氏酵母屬(ifetschi^wia)、絲孢酵母屬(Jrichosporon )私(類酵母) 短梗霉屬Uareo力腫)等的研究相對較多。畢赤酵母O0ZcAia guilIiermondiΩ ^M 際上最早被報道能抑制果實病原真菌的生物防治酵母，而Candida oleophilia isolate 1-182已經(jīng)在1995年作為生物殺菌劑在美國環(huán)境保護署(EPA)登記，并已經(jīng)由美國Ecogen 公司商業(yè)化。此外，在南非一株采后拮抗酵母白隱球酵母(frj^iococcm a從idks)也已經(jīng)商業(yè)化，商品名為Yield Plus。值得注意的是，一些拮抗酵母不僅能直接抑制病原真菌，而且還能分解真菌毒素。 Coelho等(2007)用體外試驗(// vitro test)的方法研究拮抗酵母對展青霉素的降解作用，結(jié)果表明，將223Pg的展青霉素添加到含有25mL酵母培養(yǎng)液的三角瓶中，再在其中接種3X106 cells奧默畢赤酵母O^icAiao—eri)，在25° C培養(yǎng)，經(jīng)過兩天，展青霉素減少 83% ；經(jīng)過 五天，展青霉素減少99% ；再經(jīng)過十五天的培養(yǎng)，展青霉素的量減少到無法測定的水平。近年來，國外一些學(xué)者將拮抗酵母應(yīng)用于蘋果等水果展青霉素的控制上，得到了令人振奮的結(jié)果。Castoria等(2005)報道粘紅酵母O^oWor^a glut in is)和羅倫隱球酵Οτρtococcus在體外培養(yǎng)(// vitro test)情況下能分解展青霉素；將其應(yīng)用于蘋果上，可以顯著降低展青霉素在蘋果上的積累。Morales等(2008)報道清酒假絲傳母(Candida m^O在冷藏條件下(1°C )既能降低蘋果上青霉病的發(fā)生率，又能防治展青霉素在蘋果的積累。Tolaini等(2010)的研究發(fā)現(xiàn)，在實驗室及半商業(yè)貯藏情況下，香菇 {Lentinula ei/oifes)培養(yǎng)液能夠增強羅倫隱球酵母(C IaurentiO防治蘋果上擴展青霉的生長及展青霉素產(chǎn)生的作用。Lima等(2011)將羅倫隱球酵母(C)與低劑量的殺菌劑boscalid (BOSC), cyprodinil (CYPR)結(jié)合使用，有效地降低了蘋果上青霉病的發(fā)病率及展青霉素的積累。目前，生物降解展青霉素以降低水果及其制品中霉菌毒素含量已成為國際學(xué)術(shù)界研究的熱點。但到目前為止，已實際應(yīng)用于生產(chǎn)的拮抗菌種類不多，只有Biosave和Aspire 等少數(shù)幾種產(chǎn)品上市，而我國目前尚沒有拮抗菌應(yīng)用于實際生產(chǎn)。主要原因在于商業(yè)生產(chǎn)條件下，目前已報道的拮抗微生物的防治效果往往不如化學(xué)殺菌劑的效果，從而達不到保鮮要求。這些因素影響了拮抗菌作為果蔬保鮮劑在生產(chǎn)中的使用。膠紅酵母是我們課題組從鎮(zhèn)江江心洲無公害果園的土壤中篩選分離到的一株拮抗酵母。我們的大量研究表明膠紅酵母對草莓、桃、蘋果等水果的采后病害具有顯著的抑制作用。然而，我們的試驗結(jié)果也表明膠紅酵母對果實病害的防治效力與化學(xué)殺菌劑相比仍有較大的差距。因此進一步提高膠紅酵母的拮抗效力，是提高其對水果展青霉素控制水平，并將其應(yīng)用于水果貯藏保鮮的重要策略之一。植酸是以玉米、米糠或小麥為原料制備的。作為一種可生物降解的天然物質(zhì)，植酸不僅資源豐富，而且價格低廉、無毒安全。因其具有眾多獨特的生物學(xué)特性，在食品和水果采后保鮮等領(lǐng)域都有著廣泛的研究和應(yīng)用。在水果采后保鮮領(lǐng)域，植酸被作為理想的水果涂層，用來延緩果實中維生素C的降解，保持果實中的可溶性固形物和含酸量。研究表明植酸對多種病原菌引起的腐爛的抑制效果較弱，因此植酸作為保鮮劑應(yīng)用時，必須與其它防腐劑配合使用。
近年來，如何將植酸與其它安全的非殺菌劑方法有效整合，以獲得對水果采后真菌病害更高水平的控制，已成為國際上非常受關(guān)注的一個研究熱點。但國內(nèi)外對植酸與拮抗酵母結(jié)合使用控制蘋果展青霉素尚無相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種增強膠紅酵母控制蘋果展青霉素的方法。膠紅酵母與植酸結(jié)合使用制備成菌懸液，將菌懸液應(yīng)用到水果上，能降解蘋果果實傷口處的展青霉素。膠紅酵母與植酸結(jié)合使用，在體外培養(yǎng)(/ Wiro)情況下，對擴展青霉在PDA平板上生長有抑制作用；降解展青霉素；抑制擴展青霉在NYDB培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明具有安全、高效、成本低等優(yōu)點，可以廣泛地用于水果采后病害的生物防治過程中，減少水果展青霉素造成的損失。一種利用提高膠紅酵母對蘋果展青霉素的控制方法，按照下述步驟進行將膠紅酵母ifihodotorula mucilaginosa)活化，接種到NYDB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，離心得到菌體； 將菌體用植酸溶液稀釋制備成IX IO8個/mL的菌懸液；在果實傷口處加入30 μ 1酵母菌懸液，自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25°C，RH 95%)，即可控制蘋果展青霉素。。其中所述的NYDB培養(yǎng)基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水1000ml，自然pH。其中所述的菌懸液中植酸的質(zhì)量濃度為0. 1% - 0. 5%，優(yōu)選質(zhì)量濃度為0. m。其中所述的膠紅酵母、Rhodo torula muci laginosa)，保藏菌株編號為CGMCC No.3617。本發(fā)明的優(yōu)點
(1)本發(fā)明使用植酸與膠紅酵母結(jié)合使用，控制蘋果展青霉素，使用方法簡單，操作方便，效果好，成本低。(2)植酸與膠紅酵母結(jié)合使用，可以代替化學(xué)殺菌劑防治蘋果展青霉素，避免使用化學(xué)殺菌劑對人體的危害，具有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。


其中圖1為植酸與膠紅酵母結(jié)合對蘋果果實傷口展青霉素的控制；注CK 對照；0 膠紅酵母；0. 2 :0. 2%的植酸溶液處理；0+0. 2 0. 2%的植酸與膠紅酵母結(jié)合處理。圖2為不同濃度植酸對擴展青霉菌絲體在PDA平板上的生長情況；注CK:對照； 0 =NYDB培養(yǎng)的酵母菌懸液；0. 1%-0. 5% 含0. 1%_0. 5%植酸溶液培養(yǎng)的酵母菌懸液。腐爛直徑是放置7d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著性(p=0. 05)。
具體實施例方式通過借助以下實施實例將更加詳細的說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實施實例的限制。膠紅酵母、Rhodo torula muci laginosa)系本實驗室篩選分離得到，現(xiàn)保存于位于中國北京的北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏菌株編號為CGMCC No. 3617，于NYDA
5(NYDB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂)培養(yǎng)基4°C低溫保存。培養(yǎng)程序為(1)固體活化 將膠紅酵母接種于NYDA培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)48h ； (2)液體培養(yǎng)在250ml的三角瓶中裝入50 ml的NYDB種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)接入兩環(huán)活化好的膠紅酵母，在200 rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)，28°C條件下培養(yǎng)20h ； (3)增強將上述培養(yǎng)混合物7000Xg條件下離心lOmin，無菌生理鹽水洗滌兩次，以去除培養(yǎng)介質(zhì)，并用無菌生理鹽水重新懸浮酵母細胞，血球記數(shù)板調(diào)節(jié)細胞濃度為5X IO8個/mL。在250ml的三角瓶中分別裝入50ml NYDB培養(yǎng)基，并加入上述濃度的酵母細培養(yǎng)液1ml，然后在200 rpm，28°C條件下培養(yǎng)24h ； (4)離心分離再懸浮上述不同處理酵母培養(yǎng)混合物在7000 X g條件下，離心lOmin，并用無菌生理鹽水洗滌2次，以去除培養(yǎng)介質(zhì)，再用無菌生理鹽水及植酸溶液稀釋到所需濃度。其中使用的植酸購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。實施例1 植酸與膠紅酵母結(jié)合對蘋果傷口展青霉素的控制一、試驗方案
果實處理后，用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位形成統(tǒng)一大小和深度的傷口，每個傷口處等量加入30μ 1以下處理液(1)1X108 cells/ml的酵母菌(含0. 2 % PA); (2)1\108沈118/1111的酵母菌；(3)卩八(0.2 %);(4)無菌水。處理后果實放在塑料筐內(nèi)， 用保鮮膜密封，25°C貯藏。3h后在每個傷口處加入等量30μ 1 5 X104SpOreS/ml的A ^^/^ 孢子懸浮液。自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25°C，RH 95%)。每處理重復(fù)3次，每個重復(fù)12個果實。

樣品提取和凈化蘋果經(jīng)高速組織搗碎機勻漿后作為試樣。稱取濃縮試樣5g，精確至0. Olg，置于50ml燒杯中，用20mL蒸餾水稀釋并定量的轉(zhuǎn)移到125mL分液漏斗中，用 25mL乙酸乙酯振搖5min，靜置3min。待分層后，用刻度吸管移取上層有機相于另一分液漏斗中，再加用25mL乙酸乙酯于水相中，重復(fù)上述振搖提取過程兩次。棄去水層，合并三次乙酸乙酯提取液于分液漏斗中，加入IOmL碳酸鈉水溶液，立即振搖，靜置分層，此凈化操作應(yīng)在2min內(nèi)完成。再用IOmL乙酸乙酯提取碳酸鈉水層一次，棄去碳酸鈉水層，合并乙酸乙酯提取液，加入5滴冰乙酸后，全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40°C下蒸發(fā)至近干，用Iml乙酸鹽緩沖溶液溶解殘留物，經(jīng)0. 45 μ m濾膜濾至樣品瓶內(nèi)，采用高效液相色譜測定展青霉素的含量。二、試驗結(jié)果
按照上述步驟試驗，植酸與膠紅酵母結(jié)合對蘋果果實傷口展青霉素的控制效果如下 從圖1可以看出，0. 2%植酸單獨使用，可以控制蘋果傷口的展青霉素，膠紅酵母單獨使用，也能控制蘋果果實傷口處的展青霉素，展青霉素含量是對照的23. 2%。但將0. 2%的植酸與膠紅酵母結(jié)合使用時，其對蘋果傷口處展青霉素的控制效果最好，僅為對照的10. 4%。實施例2 不同濃度的植酸結(jié)合膠紅酵母對擴展青霉(A菌絲體生長的抑制效果
一、試驗方案
在裝有30mL PDA培養(yǎng)基的9cm的培養(yǎng)皿中打直徑為IOmm的小孔，取IX IO8 cells/ml 的膠紅酵母菌懸液(含0、0. 1%、0. 2%、0. 3%、0. 4%、0. 5%植酸)以及無菌水100 μ 1于打好的小孔中，3h后，注入濃度為5 X 104spores/ml擴展青霉0°. expansum) 100 μ 1。每個處理做三個平板，Ih后，用聚乙烯(PE)保鮮膜密封以防止交叉感染，放入28°C的恒溫恒濕培養(yǎng)箱(RH 95%)中培養(yǎng)，7d后，用游標卡尺測量各種霉菌病斑的直徑大小，試驗重復(fù)三次，以觀察膠紅酵母對霉菌生長的影響情況。二、試驗結(jié)果
按照上述步驟試驗，7d后觀察的膠紅酵母對霉菌生長的影響如下 由圖2可以看出，膠紅酵母單獨使用，對擴展青霉在PDA平板上生長有抑制作用。0. 2% 及0. 3%濃度的植酸結(jié)合膠紅酵母對擴展青霉在PDA平板上生長的抑制效果好于膠紅酵母單獨使用，其中，0. 2%植酸與膠紅酵母結(jié)合使用抑制效果最為顯著。實施例3 植酸結(jié)合膠紅酵母對展青霉素的降解作用一、試驗方案
在250ml的三角瓶中裝入50ml的NYDB (牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖IOgjK 1000ml)種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)接入兩環(huán)活化好的R. mucilaginosa，在200rpm，條件下培養(yǎng)20h ；將上述培養(yǎng)混合物7000 X g條件下，離心lOmin，無菌生理鹽水洗滌兩次，去除培養(yǎng)介質(zhì)，并用無菌生理鹽水重新懸浮酵母細胞，血球記數(shù)板調(diào)節(jié)細胞濃度為5X IO8Cells/ ml，在250ml的三角瓶中裝入50mlNYDB培養(yǎng)基中加入上述濃度的酵母細胞培養(yǎng)液Iml (植酸含量分別為0、0. 2%),同時加入濃度為Img的展青霉素標準品，然后在200rpmJ8°C條件下培養(yǎng)24h ；上述不同處理酵母培養(yǎng)混合物在7000 Xg條件下，離心10-15min，上清液經(jīng) 0. 45 μ m濾膜濾至樣品瓶內(nèi)，采用高效液相色譜測定展青霉素的含量。二、試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種控制蘋果展青霉素的方法，其特征在于按照下述步驟進行將膠紅酵母 {Rhodotorula mucilaginosa)活化，接種到NYDB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用植酸溶液稀釋制備成IXlO8個/mL的菌懸液；在果實傷口處加入酵母菌懸液，自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即可控制蘋果展青霉ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種控制蘋果展青霉素的方法，其特征在于其中所述的NYDB 培養(yǎng)基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水1000ml，自然pH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種控制蘋果展青霉素的方法，其特征在于其中所述的膠紅酵母 iMhodotorula smci^^iflosa)，保藏菌株編號為 CGMCC No. 3617。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種控制蘋果展青霉素的方法，其特征在于其中所述的菌懸液中植酸的質(zhì)量濃度為0. 1% - 0. 5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種控制蘋果展青霉素的方法，其特征在于其中所述的菌懸液中植酸的質(zhì)量濃度為0. 2%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制蘋果展青霉素的方法，屬于植物采后病害得控制方法。按照下述步驟進行將膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)活化，接種到NYDB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用0.2%植酸溶液稀釋制備成1×108個/mL的菌懸液；在果實傷口處加入30μl酵母菌懸液，自然晾干后，將果實放入塑料筐并用保鮮膜密封。本發(fā)明使用植酸結(jié)合膠紅酵母控制蘋果展青霉素，環(huán)保、安全、經(jīng)濟、高效、實用，具有重要的社會價值和經(jīng)濟價值。
文檔編號A23B7/154GK102197842SQ201110166738
公開日2011年9月28日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者任曉鋒, 張曉云, 張海暉, 張紅印, 朱淑云, 趙利娜 申請人:江蘇大學(xué)