專利名稱:一株具有防霉作用的短小芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明提供一株對(duì)倉儲(chǔ)片煙具有防霉作用的短小芽孢桿菌菌株,及其應(yīng)用,屬于生物防治領(lǐng)域。
背景技術(shù):
煙葉的自然醇化或人工發(fā)酵是提高煙葉燃吸品質(zhì)和可用性的必要環(huán)節(jié)之一。片煙醇化貯藏周期長達(dá)1-2年,期間極易發(fā)生因微生物引起的霉變,使煙葉品質(zhì)降低或完全失去使用價(jià)值。腐敗是經(jīng)細(xì)菌生長、繁殖后引起的變軟、發(fā)臭性劣化。霉變是指由霉菌引起的劣化,在煙葉倉儲(chǔ)損耗中占著很大的比例,嚴(yán)重影響煙葉的外觀品質(zhì)和香味品質(zhì),降低煙葉的使用價(jià)值,是當(dāng)前儲(chǔ)煙重要安全問題之一。2002年我國加入WTO后,儲(chǔ)煙逐漸由片煙替代把煙,儲(chǔ)煙霉變問題更加突出,據(jù)統(tǒng)計(jì),貯煙和卷煙制品每年因霉變?cè)斐蓳p失相當(dāng)驚人, 達(dá)到煙草商品總額的-3%.尤其是當(dāng)前儲(chǔ)煙醇化從自然醇化向人工可控醇化(增溫增濕)發(fā)展趨勢明顯,霉變成為亟待解決的首要倉儲(chǔ)難題。此外,霉菌能產(chǎn)生霉菌毒素,會(huì)嚴(yán)重的影響人體健康,特別是很多霉菌如黃曲霉具有致癌作用。因此,控制儲(chǔ)煙霉變損失,除經(jīng)濟(jì)上需要外,也是控制微生物污染、保護(hù)環(huán)境和人類健康的需要。片煙的防霉非常困難,這主要是由于片煙屬于吸食性商品,對(duì)片煙外觀和感官評(píng)吸品質(zhì)有嚴(yán)格的要求,常規(guī)的化學(xué)防霉劑對(duì)片煙的品吸特性易造成不良影響,易產(chǎn)生殘留, 應(yīng)用非常有限。為此,人們研究了密封降氧、輻射防霉、臭氧防霉等技術(shù),均不同程度存在環(huán)境安全、影響煙葉醇化和外觀品質(zhì)等問題。近年來,利用植物提取物和微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行片煙防霉成為研究的熱點(diǎn)。利用煙葉表面的有益微生物進(jìn)行防霉,具有成本低、使用方便、 對(duì)煙葉影響小等特點(diǎn)。國內(nèi)報(bào)道煙葉生物防霉文獻(xiàn)有“陳貨發(fā)酵期間烤煙葉面微生物活性及其應(yīng)用研究[J].中國煙草科學(xué),1997,4:13-14. ”和“防煙葉霉變菌株對(duì)煙葉霉變的影響 [J].生命科學(xué)研究,2004,8 C3) =278-282. 上述研究表明,烤煙表面有益微生物在倉儲(chǔ)煙葉醇化和防霉方面有一定的應(yīng)用潛力,但對(duì)片煙防霉效果以及分離菌株的分類地位等均未作深入研究。目前,倉儲(chǔ)片煙防霉尚無有效方法,在生產(chǎn)中大多通過加強(qiáng)倉儲(chǔ)環(huán)境的管理(如調(diào)節(jié)環(huán)境溫濕度)來避免或減少片煙霉變損失。本發(fā)明的發(fā)明人在對(duì)片煙表面微生物區(qū)系開展系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,篩選獲得了具有防霉作用、改善片煙品質(zhì)的優(yōu)良菌株,在所有已申請(qǐng)的專利文獻(xiàn)中均沒有涉及本發(fā)明主題的文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù),針對(duì)目前片煙倉儲(chǔ)過程中防霉的實(shí)際問題和需求,本發(fā)明篩選出一株抗霉菌活性高、防霉效果好、促進(jìn)片煙醇化的新型生防細(xì)菌菌株,并據(jù)此制備出了高效的生物防霉菌劑,可應(yīng)用于倉儲(chǔ)片煙防霉。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明分離篩選到的對(duì)倉儲(chǔ)片煙具有防霉作用的短小芽孢桿菌菌株,經(jīng)鑒定為,菌株代號(hào)為LZ-7,命名為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus,現(xiàn)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏,保藏日為2010年8月23日,保藏編號(hào)為CGMCC No. 4116。所述菌株對(duì)倉儲(chǔ)片煙具有防霉作用。實(shí)際應(yīng)用時(shí),可以將其制成微生物制劑,其有效成分為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus LZ-7的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物或短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus LZ-7的孢子,或者進(jìn)一步地,再包括一種或多種制劑學(xué)上的載體。所述微生物制劑的制備工藝為斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一壓慮一烘培 —粉碎一產(chǎn)品(包裝劑型為原粉)。詳細(xì)實(shí)施步驟為(1)將本發(fā)明的菌株LZ-7斜面試管種接種到肉湯培養(yǎng)基搖瓶中,震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。(2)將搖瓶種按種子培養(yǎng)基的體積比12%接種量接種入50L種子罐,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,種子罐所用的培養(yǎng)劑配方為玉米粉。(3)將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的12%接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng),生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同。(4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中溶氧量為12% -18%,攪拌速度為200rpm/ min,發(fā)酵溫度為31°C,全流程培養(yǎng)時(shí)間為72h,發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到101(lCfU/mL以上。(5)發(fā)酵完成后,發(fā)酵液經(jīng)過濾直接分裝成液體劑型,或烘培成干粉經(jīng)氣流粉碎后分裝成固體劑型。經(jīng)試驗(yàn)證明,本發(fā)明的菌株LZ-7能有效抑制霉菌的生長,對(duì)擴(kuò)展青霉、黑曲霉、黃曲霉抑制率達(dá)70%左右,LZ-7菌懸液與霉菌孢子混合接種,則可延遲片煙發(fā)霉時(shí)間。室內(nèi)防霉試驗(yàn)結(jié)果表明,LZ-7對(duì)倉儲(chǔ)片煙具有一定的防霉效果,能顯著延遲片煙霉變發(fā)生時(shí)間, 25°C下,片煙含水率32%時(shí),LZ-7菌劑80倍稀釋液,能延遲片煙發(fā)霉時(shí)間5d,稀釋40倍, 延遲片煙發(fā)霉10d,稀釋20倍,延遲片煙發(fā)霉15d。實(shí)倉試驗(yàn)結(jié)果表明,LZ-7菌劑80倍液處理片煙較對(duì)照能延遲片煙發(fā)霉時(shí)間27天。感官評(píng)吸表明,LZ-7菌劑80倍液處理片煙與對(duì)照相比,香氣質(zhì)、余味、雜氣、刺激性等主要感官指標(biāo)差異不大,香氣量有一定增加,感官評(píng)吸質(zhì)量有一定提高。本發(fā)明的菌株具有抗霉菌活性強(qiáng)、防霉效果好、改善片煙品質(zhì)以及環(huán)境安全和無污染等特點(diǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的微生物制劑具有生產(chǎn)使用成本低、使用方便、防霉效果好、促進(jìn)片煙醇化等優(yōu)點(diǎn),克服了化學(xué)防霉劑易影響片煙品質(zhì)、易形成殘留等缺點(diǎn),適合倉儲(chǔ)片煙的生物防霉。本發(fā)明對(duì)保護(hù)環(huán)境以及消費(fèi)者的身體健康,減少經(jīng)濟(jì)損失,提高片煙產(chǎn)品的質(zhì)量具有重要意義。
本發(fā)明的短小芽孢桿菌LZ-7命名為Bacillus pumilus,已于2010年8月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 4116,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所,郵編100101。圖1 菌株LZ-7對(duì)擴(kuò)展青霉菌絲生長的抑制作用。
圖2 菌株LZ-7對(duì)黑曲霉菌絲生長的抑制作用。圖3 菌株LZ-7對(duì)黃曲霉菌絲生長的抑制作用。圖4 :7月23日實(shí)倉試驗(yàn)對(duì)照片煙霉變情況。圖5 :7月23日實(shí)倉試驗(yàn)LZ_7的80倍液處理片煙霉變情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1生防細(xì)菌的分離與鑒定準(zhǔn)確稱量片煙樣品10. 0g,裝入有IOOmL無菌水的三角瓶中,200rpm/min搖床上震蕩30min,用單層紗布過濾,將洗脫液進(jìn)行4 5次10倍系列稀釋,用微量移液器從低濃度到高濃度依次吸取10_6、10_5、10_4各0. ImL,涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,每個(gè)稀釋度3次重復(fù),下培養(yǎng)48 72h。稀釋度以每板50-100個(gè)單菌落為宜,挑取不同類型菌落于NA 平板上純化3次,然后劃線于NA斜面,4°C保存?zhèn)溆?。在NA培養(yǎng)基平皿近邊緣接種3個(gè)細(xì)菌菌株,置25°C培養(yǎng)Mh,長出菌帶后,于培養(yǎng)皿中心點(diǎn)接法接種霉菌菌塊(0=5mm),以只接霉變菌的平板為對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每天觀察,待對(duì)照菌落長滿培養(yǎng)皿時(shí)測量霉變菌菌落半徑以及對(duì)照菌落半徑,判斷供試菌株抑制霉變菌的作用大小,計(jì)算各菌株對(duì)霉變菌的抑制率。通過此方法,從片煙表面共篩選出157株細(xì)菌,篩選出2個(gè)具有較強(qiáng)拮抗活性的菌株。通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16SrDNA序列分析,其中1株細(xì)菌被鑒定為 Bacilluspumilus,菌株代號(hào)為LZ-7,于2010年8月23日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏,保藏編號(hào)為CGMCC No. 4116。抑菌試驗(yàn)表明,LZ-7對(duì)擴(kuò)展青霉、黑曲霉、黃曲霉具有較強(qiáng)的拮抗作用(如圖1-3所示),抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1LZ-7對(duì)部分霉菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.一株具有防霉作用的短小芽孢桿菌,其特征在于該菌株命名為短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus,其菌種已于2010年8月23日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏,保藏編號(hào)為CGMCC No. 4116。
2.權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌在倉儲(chǔ)片煙防霉中的應(yīng)用。
3.—種對(duì)倉儲(chǔ)片煙具有防霉作用的微生物劑,其特征在于其中有效成分為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus LZ-7的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物或短小芽孢桿菌Bacillus pumilus LZ-7 的孢子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物制劑,其特征在于還包括制劑學(xué)中的常規(guī)載體。
5.權(quán)利要求3所述的微生物制劑的制備工藝,其特征在于,步驟如下(1)將本發(fā)明的菌株LZ-7斜面試管種接種到肉湯培養(yǎng)基搖瓶中,震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期;(2)將搖瓶種按種子培養(yǎng)基的體積比12%接種量接種入50L種子罐,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,種子罐所用的培養(yǎng)劑配方為玉米粉;(3)將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的12%接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng),生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同;(4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中溶氧量為12%-18%,攪拌速度為200rpm/min,發(fā)酵溫度為31°C,全流程培養(yǎng)時(shí)間為72h,發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到IOiciCfuAiL以上;(5)發(fā)酵完成后,發(fā)酵液經(jīng)過濾直接分裝成液體劑型,或烘培成干粉經(jīng)氣流粉碎后分裝成固體劑型。
6.權(quán)利要求3所述的微生物劑在倉儲(chǔ)片煙防霉中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株防倉儲(chǔ)片煙霉變的細(xì)菌菌株,屬于植物病害生物防治領(lǐng)域,該菌種已于2010年8月23日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏,分類命名為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus,保藏編號(hào)為CGMCC No.4116。本發(fā)明的菌株能夠抑制片煙霉菌的生長,對(duì)霉菌引起的霉變有良好的防治作用,對(duì)片煙醇化有一定促進(jìn)作用。本發(fā)明還公開了一種對(duì)倉儲(chǔ)片煙具有防霉作用的微生物劑,其中有效成分為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus LZ-7的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物或短小芽孢桿菌Bacillus pumilus LZ-7的孢子。具有生產(chǎn)使用成本低、使用方便、防霉效果好、促進(jìn)片煙醇化等優(yōu)點(diǎn),克服了化學(xué)防霉劑易影響片煙品質(zhì)、易形成殘留等缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102250793SQ201110166940
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者馮超, 周顯升, 孔凡玉, 張成省, 王鳳龍, 王新偉, 馬強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所