專利名稱：一種日本假黃單胞菌和微生物菌劑及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種曰本fi黃單胞菌(.Pseudoxan thomonas japonensis ),以及一種含有該日本假黃單胞菌iPseudoxan thomonas japonensis )作為活性成分的微生物菌劑和它們的應(yīng)用；更確切地說(shuō)，涉及一種保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌 iPseudoxanthomonas japonensis^,以及含有此日本假黃單胞菌的微生物菌劑，還涉及所述日本假黃單胞菌或微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用、在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用、 在生物修復(fù)石油污染的土壤中的應(yīng)用、以及在生物修復(fù)石油污染的水體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)今世界，石油已經(jīng)成為人類最主要的能源之一，大量的石油及其加工品進(jìn)入土壤造成土壤的石油污染，給人類乃至整個(gè)生物圈帶來(lái)危害，從而成為世界性的環(huán)境問(wèn)題。在對(duì)石油污染的研究中，生物修復(fù)作為一種潛在的高效、低成本的清潔技術(shù)正日益受到重視。生物修復(fù)(Bioremediation)是指通過(guò)生物(特別是微生物)催化降解有機(jī)污染物， 從而修復(fù)被污染的環(huán)境或消除環(huán)境中的污染物的受控的或自發(fā)進(jìn)行的過(guò)程?！笆蜔N”是石油及其加工品中的主要污染成分，研究發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)石油烴能夠起到降解作用。微生物降解石油烴是19世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的。20世紀(jì)50年代前，以美國(guó)C. E.佐貝爾為代表，對(duì)海洋微生物降解石油烴進(jìn)行了廣泛的研究。50年代初氣相色譜問(wèn)世，放射性同位素示蹤法的普遍應(yīng)用，對(duì)研究石油烴的微生物降解機(jī)制起了積極的作用。60年代以來(lái)，由于海上石油污染日趨嚴(yán)重，促使不少沿海國(guó)家，如美國(guó)、加拿大、日本、英國(guó)和蘇聯(lián)等國(guó)，積極開(kāi)展了有關(guān)海洋微生物降解石油烴的研究工作。70年代中期，美國(guó)學(xué)者還用基因工程的技術(shù)培育了 “超級(jí)微生物”，以期能有效地降解石油烴。中國(guó)自1975年起，先后對(duì)青島膠州灣、渤海、廈門(mén)港、黃海和東海石油降解微生物的數(shù)量、分布、種類組成和影響降解因素等進(jìn)行了調(diào)查研究。在影響微生物對(duì)石油烴的降解的主要因素中，微生物的生理特性是決定降解石油烴能力的關(guān)鍵因素之一。目前已經(jīng)分離得到的微生物菌株對(duì)石油烴降解能力還較低，因此， 迫切需要開(kāi)發(fā)出一種能夠高效降解石油烴的微生物菌株及相關(guān)的微生物菌劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的微生物菌株對(duì)石油烴的降解能力低的缺點(diǎn)，提供一種能夠高效地降解石油烴的微生物菌株及相關(guān)的微生物菌劑和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)第一個(gè)發(fā)明目的，提供了一種日本假黃單胞菌Ο^ ^/οχ^ ΑοΜΜΜ japonensis),其中，該日本假黃單胞菌{Pseudoxanthomonas japonensis)的保藏編號(hào)為CGMCC No. 4797。為了實(shí)現(xiàn)第二個(gè)發(fā)明目的，提供了一種降解石油烴的微生物菌劑，其中，該微生物菌劑含有日本假黃單胞菌Wseudoxein thomonas japonensis )作為活性成分，其中，該日本 fiH^-lfi (.Pseudoxan thomonas j^wweflsis)的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4797。此外，本發(fā)明還提供了所述日本假黃單胞菌或所述微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述日本假黃單胞菌或所述微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述日本假黃單胞菌或所述微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染的土壤中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述日本假黃單胞菌或所述微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染的水體中的應(yīng)用。本發(fā)明的日本假黃單胞菌iPseudoxanthomonas japonensis)菌株是通過(guò)大量篩選工作篩選到的，該菌株對(duì)石油烴具有很強(qiáng)的降解能力。該菌株已于2011年04月觀日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No. 4797。本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌iPseudoxanthomonas japonensis)及含有該菌的微生物菌劑對(duì)石油烴具有很強(qiáng)的降解能力，可以廣泛地應(yīng)用于降解石油烴以及對(duì)石油污染的修復(fù)，如對(duì)石油污染的土壤的修復(fù)和對(duì)石油污染的水體的修復(fù)等。


圖1顯示了本發(fā)明篩選的保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌 (.Pseudoxant homonas japonensis)在固體TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)的形態(tài)；
圖2顯示了本發(fā)明篩選的保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌(作洲而忍/^ homonas japonensis^在固體TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時(shí)后經(jīng)菌苔染色后在光學(xué)顯微鏡的 100倍油鏡下的形態(tài)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種日本假黃單胞菌QPseudoxan thomonas japonensis )，其中，該日本假黃單胞菌G^ewi/ox^iAoffloaas J^wwez7lSi1S)的保藏編號(hào)為CGMCC No. 4797。經(jīng)過(guò) 16s rDNA擴(kuò)增與測(cè)序分析，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4797的菌株具有SEQ ID N0:1所示的 16s rDNA 序列。 本發(fā)明還提供了一種降解石油烴的微生物菌劑，其中，該微生物菌劑含有日本假黃單胞菌QPseudoxan thomonas japonensis )作為活性成分，其中，該日本假黃單胞菌 (.Pseudoxan thomonas japonensis )的保藏編號(hào)為CGMCC No. 4797。所述微生物菌劑中含有的日本假黃單胞菌G^i^/oxa/ iAoMwas j^^/^/^is)的量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每克所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)可以為0. 1-2. 5 X 101°個(gè)，更優(yōu)選為0. 5-1 X 101°個(gè)。根據(jù)本發(fā)明，所述微生物菌劑還含有培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、 石油篩選培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中的一種或幾種，優(yōu)選為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基能夠商購(gòu)得到或者根據(jù)“微生物培養(yǎng)基手冊(cè)”(Microbiology Culture Media Manual) 的記載制備得到。例如，所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以含有牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，其中，相對(duì)于100重量份的牛肉膏，蛋白胨的含量可以為150-250重量份，NaCl的含量可以為 50-150重量份，水的含量可以為15000-25000重量份，pH值可以為7. 2-7. 4 ；培養(yǎng)基中加入 1. 2重量％的瓊脂可制成固體培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌 (.Pseudoxanthomonas japonensis)及含有該菌株的微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌 (.Pseudoxanthomonas japonensis)及含有該菌株的微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌 (.Pseudoxanthomonas japonensis)及含有該菌株的微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染的土壤中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的日本假黃單胞菌 (.Pseudoxanthomonas japonensis)及含有該菌株的微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染的水體中的應(yīng)用。下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)驗(yàn)材料
一、篩選菌種的石油樣品
采自勝利油田的原油與市售0#柴油按1 :4的比例混合均勻，作為實(shí)驗(yàn)用石油。二、土壤樣品為采自山東勝利油田的三種不同的石油污染土壤樣品的1 :1 1的混合物，其分別為
1)采油井周圍的落地原油污染土壤；
2)油泥沙；和
3)長(zhǎng)期堆放油泥沙的耕層土。三、培養(yǎng)基
1)富集培養(yǎng)基K2HPO4 · 3H20 1. 0g, KH2PO4 1. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, NH4NO3 1. 0g, CaCl2 0. 02g，蒸餾水lOOOmL，調(diào)至PH7. 0，121°C滅菌20min，待冷卻后加入5g石油。2)分離培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯粉6. 0g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加入蒸餾水直至1000ml，并在115°C高壓滅菌20分鐘備用。3)菌種保存培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基
4)石油篩選培養(yǎng)基(液體):NaN031. 5g，(MM)2SO4 1. 5g,K2HPO4 lg，MgS04 ·7Η20 0.5 g, KCl 0. 5g, FeSO4 ·7Η20 0. OlgjCaCl2 0. 002g，蒸溜水 lOOOmL，調(diào)至 ρΗ8· 0，121°C滅菌 20min， 冷卻后加入2. 5g石油。培養(yǎng)基中加入1. 2重量％的瓊脂制成固體篩選培養(yǎng)基。5)固體TSA培養(yǎng)基胰蛋白胨15g，大豆胨5g，氯化鈉30g，瓊脂15g，加入蒸餾水直至終體積為1000ml, pH值為7. 1-7. 5。
實(shí)施例1
1、石油烴降解菌株的富集分離
稱取5g石油污染土壤混合物加入裝有IOOmL富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于^°C、 180r/min的恒溫?fù)u床條件下培養(yǎng)，5天后吸取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮的富集培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)5天，如此連續(xù)富集培養(yǎng)25天，培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后涂布在固體PDA培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)；待平板長(zhǎng)出菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落采用劃線分離法反復(fù)進(jìn)行分離純化， 直到得到單菌株的純培養(yǎng)物，純化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面。2、高降解活性菌株的篩選
將上述純化的菌株分別接種到裝有IOOmL篩選培養(yǎng)基的250mL三角瓶中J8°C、180r/ min的條件下培養(yǎng)5天，將培養(yǎng)液稀釋100倍后涂布在固體篩選培養(yǎng)基上，觀察各菌株在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，篩選出生長(zhǎng)較快、菌落較多的菌株。挑取各菌株的單菌落分別接種到裝有50ml液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在、180r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)Mh，測(cè)定菌液在600nm處的吸光度，用滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度使0D600nm約為0. 4，以此稀釋的菌液作種子接種篩
選培養(yǎng)基。吸取5ml準(zhǔn)備好的種子液接種到裝有IOOmL篩選培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在 、180r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4天后測(cè)定石油含量，每一種子液的處理重復(fù)三次，計(jì)算
平均降解率，篩選出石油降解率最高的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行了生物保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 4797。 實(shí)施例2
根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[4]和《放線菌系統(tǒng)學(xué)原理、方法及實(shí)踐》[5]中記載的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)篩得的保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的菌株進(jìn)行菌種鑒定。1、形態(tài)分析
對(duì)保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的菌株進(jìn)行形態(tài)分析并在光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果分別如圖1和2所示。菌落形態(tài)觀察是在固體TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行的，將菌株劃線接種后，于恒溫培養(yǎng)M小時(shí)觀察菌落形態(tài)。保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的菌株的菌落為淺黃色，圓形，質(zhì)地光滑，表面隆起。挑取培養(yǎng)M小時(shí)菌苔染色后在光學(xué)顯微鏡的100倍油鏡下觀察。在顯微鏡下可清楚的看到，保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的菌株的菌體細(xì)胞呈長(zhǎng)桿形，并且單個(gè)出現(xiàn)。2、16s rDNA 鑒定
16s rDNA的PCR擴(kuò)增和測(cè)序采用試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)提取并純化保藏號(hào)為CGMCC No. 4797的菌種的總DNA，然后以總DNA為模板，對(duì)16s rDNA保守序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。PCR擴(kuò)增引物分別為
27f (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)禾口 ； 1492r (5， -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，)。
PCR總反應(yīng)體系為50uL，具體包括
權(quán)利要求
1.一種日本假黃單胞菌(Pseudoxanthomonas japonensis)，其特征在于，該日本假黃單胞菌(Pseudoxanthomonas japonensis)的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4797。
2.一種降解石油烴的微生物菌劑，其特征在于，該微生物菌劑含有日本假黃單胞菌(Pseudoxanthomonas japonensis)作為活性成分，其中，該日本假黃單胞菌 (Pseudoxanthomonas japonensis)的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4797。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其中，每克所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為 0. 1-2. 5X1010 個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物菌劑，其中，每克所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為 0. 5-1 X IO10 個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中的任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑，其中，該微生物菌劑還含有培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、石油篩選培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物菌劑，其中，所述培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1所述的日本假黃單胞菌或權(quán)利要求2-6中的任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的日本假黃單胞菌或權(quán)利要求2-6中的任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的日本假黃單胞菌或權(quán)利要求2-6中的任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染的土壤中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的日本假黃單胞菌或權(quán)利要求2-6中的任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在生物修復(fù)石油污染的水體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種保藏號(hào)為CGMCCNo.4797的日本假黃單胞菌(Pseudoxanthomonasjaponensis)，以及含有此日本假黃單胞菌的微生物菌劑，還提供了所述日本假黃單胞菌或微生物菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用、在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用、在生物修復(fù)石油污染的土壤中的應(yīng)用、以及在生物修復(fù)石油污染的水體中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CGMCCNo.4797的日本假黃單胞菌(Pseudoxanthomonasjaponensis)及含有該菌的微生物菌劑對(duì)石油烴具有很強(qiáng)的降解能力，可以廣泛地應(yīng)用于降解石油烴以及對(duì)石油污染的修復(fù)，如對(duì)石油污染的土壤的修復(fù)和對(duì)石油污染的水體的修復(fù)等。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102250794SQ201110167149
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者劉雪, 葉婧, 朱昌雄, 李峰, 田云龍, 郭萍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所