專利名稱：：檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒，屬于植物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：洋蔥腐爛病菌QBurkholderiagladioliρv.aWiicoh)隸屬于原核生物界(Procaryoces)、薄壁菌門(Gracilicutes)、腸桿菌禾斗(Enterobacteriaceae)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、唐菖蒲伯克霍爾德菌(Murkholderiagladioli)。唐菖蒲伯克霍爾德嵬〔Burkholderiagladioli)是一種引起唐菖蒲球莖腐爛的病原菌，Severini在1913年的文獻(xiàn)中最早描述了這種病原菌，并將其命名為作洲而膨/？浙gladioli01992ip，Pseudomonasgladioli與胃它7^{同屬于fiUfi屬(.Pseudomonas)rRNAGroupII的菌種一起被劃分到了一個(gè)新屬——伯克霍爾德菌屬Ofcrf^Aferia),從而被命名為Burkholderiagladioli。洋蔥腐爛病菌最初只是被當(dāng)成一種植物病原菌。寄主植物主要是蔥屬植物{Alliumc^a)和郁金香屬(TWiA3spp.)。主要致病癥狀是鱗莖的內(nèi)部鱗片腐爛，初期外觀看不到癥狀，但后期整個(gè)鱗莖變軟，可看到大量細(xì)菌分泌物。在葉片上也可產(chǎn)生干燥的壞死斑。洋蔥腐爛病菌侵染洋蔥葉片后，一到兩片葉片會(huì)枯萎變白，并且脫落，病原菌由葉片再侵染至球莖。受侵染的洋蔥鱗球莖，先期外部無明顯特征，只在鱗球莖頸部出現(xiàn)腐爛，剖開后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部一到兩個(gè)小鱗莖已呈水浸狀。后期肉質(zhì)鱗狀組織出現(xiàn)水浸狀，由白黃色變?yōu)闇\褐色，逐漸腐爛變軟，在病害發(fā)病后期會(huì)有粘性、腐爛難聞液體流出，直至整個(gè)球莖變干、枯萎。田間發(fā)病率可達(dá)到89.1%。傳播途徑包括帶菌種子、鱗球莖，土壤等。1985年，Christenson^ΜΜΙBurkholderiagladioli感染囊性纖維化(CF，CisticFibrosis)病人呼吸道的病例。接著，陸續(xù)在慢性肉芽腫和免疫功能減弱的病人體RM7Burkholderiagladioli.Burkholderiagladioli感染的病癥還包括敗血病、膿腫、骨髓炎、角膜炎和淋巴腺炎。^zr姑Weriagladioli可能主要導(dǎo)致CF病人的急性感染以及肺移植術(shù)后的血液感染，目前還沒有^zr姑Weria^/ai/iWi在病人與病人之間傳播的報(bào)道。洋蔥腐爛病菌是引起洋蔥腐爛的高風(fēng)險(xiǎn)檢疫性病菌，其準(zhǔn)確檢測和鑒定在檢驗(yàn)檢疫工作中具有重要意義。鑒于我國目前沒有洋蔥腐爛病的發(fā)生危害報(bào)道，為了減少境外洋蔥腐爛病菌傳入的風(fēng)險(xiǎn)、保護(hù)公眾健康，本發(fā)明研究開發(fā)出一種特異的洋蔥腐爛病菌檢測技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列。所述探針的5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。本發(fā)明根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Burkholderiagladiolipv.alliicolaITS基因序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)并經(jīng)大量篩選得到最佳引物和探針。探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標(biāo)記淬滅熒光染料BHQl。引物和探針由寶生物工程有限公司合成。上游引物PBAF:5'-GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC-3'(SEQIDNo.1)；下游引物PBAR:5'-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-3'(SEQIDNo.2);探針為FAM_ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1(SEQIDNo.3)。檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物和檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針；所述檢測引物為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列，所述探針為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列，探針的5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。一種檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒，由以下組分組成(1)PCR反應(yīng)液由2X反應(yīng)液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；反應(yīng)液I^remixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.IuM；2X反應(yīng)液I^remixEXTaq購于Takara公司；引物和探針均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDN0.3所示的核苷酸序列，探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標(biāo)記淬滅熒光染料BHQl；(2)無DNA酶的滅菌純化水用自來水兩次蒸餾，經(jīng)過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率彡18.0ΜΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。Millipore-Q純化水151bf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘；(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min；(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區(qū)序列(SEQIDN0.4)的重組質(zhì)粒，Ct值為22.0沘.0。陽性對照的制備方法為用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列對洋蔥腐爛病菌進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得高純度的138bp核糖體基因保守區(qū)序列(SEQIDNo.4)，與pGEM-Teasy載體(購自Promega公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自Promega公司)，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2.O(購自TaKafci公司)質(zhì)粒提取試劑盒提取DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒作為陽性對照，命名為pGEM-Bga。10倍連續(xù)梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22.O觀.O均可作為陽性對照。核糖體基因保守區(qū)序列如下(SEQIDNo.4):ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGACTCGAGTCTTTGTCATTGGCGATTGAGCCAGTCAGAGTGATGAGTACACAAGTGTGCTTATCGGCTGTCGTTCTTTAACAATCTAGAAGAAGTAGTAATTTGGATAGCGGAAGC。本試劑盒還可以含有細(xì)菌基因組DNA提取試劑，其目的是從培養(yǎng)的待測細(xì)菌中提取得到基因組DNA，屬于本領(lǐng)域常規(guī)操作。多種商業(yè)來源的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均可滿足要求。例如本發(fā)明還可以包括(5)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，貨號DP302-02。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法能在搖培12h后，從模擬的最低含菌量的洋蔥種子中檢出洋蔥腐爛病菌。研究表明，在3000粒洋蔥種子表面，最低帶菌量118個(gè)、制樣時(shí)完全被從種子表面洗脫下來的情況下，通過本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法能夠快速有效地檢出洋蔥腐爛病菌。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明建立了特異、靈敏、快速的TaqMan探針熒光定量PCR方法和試劑盒用于檢測洋蔥腐爛病菌。利用洋蔥腐爛病菌保守基因序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針并進(jìn)行篩選，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件和體系，對BurkholderiagladioliW.alIiicola菌、對照菌進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法和試劑盒的特異性、敏感度、重復(fù)性等。該方法利用高特異性引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了快速、高特異性和高靈敏度的結(jié)合，檢測靈敏度達(dá)1個(gè)拷貝/反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間僅需1h左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法和試劑盒適合于口岸對洋蔥腐爛病菌的快速檢測。以下通過實(shí)施例和說明書附圖詳細(xì)說明本發(fā)明技術(shù)方案，并不以此限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。圖1為實(shí)施例1的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為實(shí)施例1的Burkholderiagladiolipv.alliicola菌iTaciMan探針熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果。圖3為實(shí)施例IBurkholderiagladiolipv.alliicola菌TaqMan探針熒光定量PCR靈敏度檢測結(jié)果。圖4為實(shí)施例3各個(gè)梯度不同時(shí)間點(diǎn)熒光定量PCR檢測結(jié)果。圖5為實(shí)施例3各個(gè)梯度不同時(shí)間點(diǎn)熒光定量PCR檢測結(jié)果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測一.材料與方法1.材料試劑Burkholderiagladiolipv.alliicolaATCC20157、ATCC20159、ATCC20160、ATCC20161由美國CampbellVegetableResearch&DevelopmentCenter的HasanBolkan博士提共。BurkholderiaandropogonisATCC23060,BurkholderiacaryohpyATCC11441,BurkholderiaglumaeATCC33617購自中國菌種保藏中心。^/rlCepaciaY3,Burk.MultivoransPW99,Burk.cenocepaciaY10,Burk.cenocepacia317,Burk.stabilisJlOO,Burk.vietnamiensis419,Burk.anthinaYP46,Burk.pyrrocinia？m，Burk.arborismi,Burk.seminalisMb,Burk.contaminansY4DNA由浙江大學(xué)謝關(guān)林教授提供。細(xì)菌培養(yǎng)使用NA培養(yǎng)基、反應(yīng)液ft~emiXEXTaq等試劑均購自Takara公司；PCR所用探針引物合成自Takara公司。2.儀器SLAN熒光定量PCR儀，超低溫冰箱(Thermo)，超凈臺(蘇凈集團(tuán))，培養(yǎng)箱(Memmert)。3.特異性探針及引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Burkholderiagladiolipv.alliicola核糖體基因序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物和探針。探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標(biāo)記淬滅熒光染料BHQ1。引物和探針由寶生物工程有限公司合成。上游引物PBAF:5,-GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC-3'；下游引物PBAR5'-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-3‘；探針為FAM-ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線將搖培的菌懸液進(jìn)行10倍倍比稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用3MPetrifilm菌落總數(shù)測數(shù)片對菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別取1PL做模板，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行定量擴(kuò)增，利用熒光定量PCR儀配套軟件繪制以初始模板濃度的對數(shù)為X軸，Ct值為Y軸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.熒光定量PCR特異性檢測熒光定量PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件總反應(yīng)體系為20μ，包括PremixEXTaq10PL，上游引物0.5μ，下游引物0.5μ，探針0.3μ，模板菌液1μ(模板DNA采用TIANGEN公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取)，用ddH20補(bǔ)足至20μ。反應(yīng)條件為95"C5mins，l個(gè)循環(huán)；95"C5s；60"C20s，40個(gè)循環(huán)。選取細(xì)菌菌液為模板進(jìn)行姑oAferiagladiolipv.aBiicoh菌特異性檢測，陰性對照選取伯克氏菌屬的菌株作為參比菌株。6.熒光定量PCR靈敏度檢測用滅菌水按十倍梯度稀釋姑Weriagladiolipv.alliicola菌液進(jìn)行相對靈敏度檢測，取1PL菌液進(jìn)行PCR檢測，并同時(shí)取相同量菌液涂布平板，30°C培養(yǎng)36h后進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)，以確定每稀釋倍所含菌量。二.結(jié)果與分析1.標(biāo)準(zhǔn)曲線5個(gè)梯度的菌懸液，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，利用熒光PCR儀配套軟件生成擴(kuò)增反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.416x+44.287,r=-0.9999。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，菌懸濃度在1.02X107cfu/mL1.02X103cfu/mL范圍內(nèi)與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系，熒光定量PCR的擴(kuò)增效率為96.3%，也就是說，每個(gè)循環(huán)的重點(diǎn)，擴(kuò)增子的拷貝數(shù)增加1.96倍，或96.3%的模板被擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。2.供試的4株洋蔥腐爛病菌(ATCC20157、ATCC20159、ATCC20159、ATCC20159)、14種洋蔥腐爛病菌近似種(BurkholderiaandropogonisATCC23060，BurkholderiacaryohpyATCC11441,BurkholderiaglumaeATCC33617,Burk.CepaciaY3,Burk.MultivoransPff99,Burk.cenocepaciaY10,Burk.cenocepacia317,Burk.stabilisJ100,Burk.vietnamiensis419,Burk.anthinaYP46,Burk.pyrrocinia301,Burk.arborisHT1,Burk.seminalisR45,Burk.contaminansY4)在相同條件下進(jìn)行TaqMan探針熒光定量PCR檢測。該方法中4株洋蔥腐爛病菌均有明顯的擴(kuò)增曲線生6成，說明本試驗(yàn)TaqMan探針及引物具有高特異性(圖2)。3.靈敏度檢測結(jié)果供試的洋蔥腐爛病菌梯度菌液在同一反應(yīng)中，通過細(xì)菌總數(shù)測數(shù)片測得梯度濃度依次為1.02Χ107、1·02Χ106、1·02Χ105、1·02Χ104、1·02Χ103、1·02XIO2cfu/mL以及空白對照。本試驗(yàn)的檢測下限為1.02X103cfu/mL，體現(xiàn)了該方法的高靈敏度，如圖3所示。實(shí)施例2檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒一種檢測洋蔥腐爛病菌^zr姑Weriagladiolipv.aWiicoh的試劑盒，由以下組分組成(I)PCR反應(yīng)液由2X反應(yīng)液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；反應(yīng)液I^remixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.IuM；2X反應(yīng)液I^remixEXTaq購于Takara公司；引物和探針均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標(biāo)記淬滅熒光染料BHQl。(2)無DNA酶的滅菌純化水用自來水兩次蒸餾，經(jīng)過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率彡18.OMΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。MiIlipore-Q純化水15Ibf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘。(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min。(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區(qū)序列(SEQIDN0.4)的重組質(zhì)粒，Ct值為22.0沘.0。陽性對照的制備方法為用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列對洋蔥腐爛病菌進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得高純度的138bp核糖體基因保守區(qū)序列(SEQIDNo.4)，與pGEM-Teasy載體(購自Promega公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自Promega公司)，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2.O(購自TaKafci公司)質(zhì)粒提取試劑盒提取DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒作為陽性對照，命名為pGEM-Bga。10倍連續(xù)梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22.0觀.0均可作為陽性對照。(5)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司(天根生化科技(北京)有限公司)，貨號DP302-02。操作流程詳細(xì)說明如下1.切去洋蔥鱗球莖的部分腐爛組織或者病健交界處組織，放入滅菌的研缽中，加入適量的0.8%的生理鹽水，充分研磨，用移液器吸取研磨液轉(zhuǎn)入1mLEP管中，1500rpm3000rpm低速離心去除大的顆粒，將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的1mLEP管中，13000rpm高速離心，棄上清液，加入100μL滅菌水重懸沉淀，進(jìn)行劃線涂板培養(yǎng)；從平板培養(yǎng)基上挑取疑似單菌落接種至14mL的液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。2.取14mL的過夜培養(yǎng)菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清。3.按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購自TIANGEN公司)說明書操作提取、純化得到菌液模板DNA。4.熒光定量PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件總反應(yīng)體系為20μ，包括IX反應(yīng)液I^remixEXTaq10μ,上游引物0.5μ(0.3uM)，下游引物0.5μ(0.3uM)，探針0.3μ(0.luM)，菌液模板DNA1μ(步驟3試劑盒提取得到)，用無DNA酶的滅菌純化水補(bǔ)足至20μ。按上述的PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系，放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)置為95"C5mins，l個(gè)循環(huán)；95"C5s；60°C20s，40個(gè)循環(huán)。對待檢樣品進(jìn)行檢測時(shí)，每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性對照和陽性對照，反應(yīng)體系中菌液模板DNA分別用陰性對照和陽性對照替代。陰性對照用于判定反應(yīng)體系及整個(gè)操作過程是否受污染，陽性對照用于判定整個(gè)反應(yīng)過程的有效性。5.結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值判斷反應(yīng)結(jié)果，Ct值在36個(gè)循環(huán)以內(nèi)判定為陽性，Ct值超過36個(gè)循環(huán)判定為陰性。其中，陰性對照Ct值應(yīng)為無或至少大于36個(gè)循環(huán)，陽性對照Ct值應(yīng)處于2228個(gè)循環(huán)范圍內(nèi)，陰性對照或陽性對照任何一個(gè)不滿足要求，則整個(gè)檢測過程判定為無效。實(shí)施例3檢測洋蔥腐爛病菌的試劑盒(I)PCR反應(yīng)液由2X反應(yīng)液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；反應(yīng)液I^remixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.IuM；2X反應(yīng)液I^remixEXTaq購于Takara公司；引物和探針均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF(引物1)為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR(引物2)為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光染料6-Carboxyfluorescein(FAM)，3'端標(biāo)記淬滅熒光染料BHQl。(2)無DNA酶的滅菌純化水用自來水兩次蒸餾，經(jīng)過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，收取電阻率彡18.OMΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。MiIlipore-Q純化水15Ibf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌15分鐘。(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min。(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區(qū)序列(SEQIDN0.4)的重組質(zhì)粒，Ct值為22.0沘.0。陽性對照的制備方法同實(shí)施例2。本試劑盒的使用方法同實(shí)施例2，其中待測的細(xì)菌基因組DNA可采用本領(lǐng)域公知技術(shù)或通過任何市售的基因組提取試劑盒獲得。實(shí)施例4用實(shí)施例2的試劑盒模擬帶菌種子制樣液的制備及熒光定量PCR檢測一.材料與方法1.材料試劑Burkholderiagladiolipv.alliicolaATCC20157，進(jìn)口洋蔥種子(以色列)，實(shí)施例2的試劑盒(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供)。2.儀器設(shè)備SLAN熒光定量PCR儀，超凈臺(蘇凈)，培養(yǎng)箱(Memmert)。3.菌懸液制備培養(yǎng)30mLBurkholderiagladioliρv.aWiicoh菌懸液，將搖培的菌懸液進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋，采用3MPetrifilm菌落總數(shù)測數(shù)片對菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度取100PL，做三個(gè)重復(fù)，將測試片置于觀°C溫箱中培養(yǎng)72h，取出計(jì)算測試片所有紅色菌落的數(shù)目(不論大小和顏色深淺)，同一梯度三個(gè)重復(fù)的平均值乘以稀釋度作為菌懸液的濃度。4.模擬帶菌種子制樣液的制備及熒光定量PCR檢測(1)將搖培的菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10°cfu/mL，每個(gè)梯度100mL，在每個(gè)梯度菌懸液中加入3000粒不含包衣的洋蔥種子，然后放在觀°C培養(yǎng)箱中搖培，每個(gè)梯度取1mL搖培液加入1.5mLEP管中低速離心，去除大的雜質(zhì)顆粒，然后高速離心沉淀，去掉上層液體，用100PL無菌水重懸沉淀，制成菌懸液，每個(gè)梯度菌懸液各取1PL作為模板，按照實(shí)施例2試劑盒使用方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測。(2)將含洋蔥種子的各個(gè)梯度的菌懸液分別搖培6h、12h、24h，分別取不同時(shí)間點(diǎn)的搖培液進(jìn)行熒光定量PCR，同時(shí)取不同時(shí)間點(diǎn)的搖培液各1mL進(jìn)行，加入1.5mLEP管中低速離心，去除大的雜質(zhì)顆粒，然后13000rpm高速離心沉淀，去掉上層液體，用100μ無菌水重懸沉淀，制成菌懸液，每個(gè)梯度菌懸液各取1PL作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以比較不同搖培時(shí)間的差別。二.結(jié)果(1)不同時(shí)間點(diǎn)搖培液檢測結(jié)果取0h、6h、12h、24h不同時(shí)間點(diǎn)的搖培液1μ，按實(shí)施例2操作方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測結(jié)果，各個(gè)梯度各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光定量PCR檢測結(jié)果見圖4，各個(gè)梯度各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光定量PCR檢測Ct值見表1。從檢測結(jié)果的Ct值可以看出，同一梯度不同時(shí)間點(diǎn)的熒光定量PCR檢測Ct值基本以3個(gè)Ct左右增加，在熒光擴(kuò)增效率100%的情況下，模板濃度相差十倍，則Ct值相差約3.32，建立的熒光定量PCR體系擴(kuò)增效率為96.3%，也就是說大致可以判斷在不同時(shí)間點(diǎn)菌體濃度是以十倍的比例增加。加入的搖培液為100mL，菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果顯示搖培菌懸液濃度為1.18X108CFU/mL，也就是說梯度稀釋搖培液最低含菌量為118個(gè)，從熒光定量PCR檢測結(jié)果可以看出，建立的熒光定量PCR體系，能在搖培Mh后從含菌量為118個(gè)的模擬帶菌種子樣品中檢出^zr姑οAferiagladioli爐.alliicola。權(quán)利要求1.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，其特征在于為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。2.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，其特征在于為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針，其特征在于所述探針的5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。4.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒含有檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物和檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR探針；所述檢測引物為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列，所述探針為序列表SEQIDNo.3的寡核苷酸序列，探針的5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。5.檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于由以下組分組成(1)PCR反應(yīng)液由2X反應(yīng)液I^remixEXTaq、引物PBAF、引物PBAR和探針組成；其中，引物PBAF為序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR為序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探針為序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM，3‘端標(biāo)記淬滅熒光染料BHQl；(2)無DNA酶的滅菌純化水；(3)陰性對照lmLX1管；研磨無菌健康洋蔥鱗球莖，用0.01mol/LpH7.2PBS緩沖鹽溶液制成20%懸液，121°C滅活30min；(4)陽性對照=ImLXl管；為含有洋蔥腐爛病菌ifea核糖體基因保守區(qū)序列SEQIDNO.4的重組質(zhì)粒，Ct值為22.0沘.0。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)液I^emixEXTaq的終濃度為1X，引物PBAF的終濃度為0.3uM、引物PBAR的終濃度為0.3uM，探針的終濃度為0.luM。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述陽性對照的制備方法為用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的引物序列對洋蔥腐爛病菌進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得高純度的138bp核糖體基因保守區(qū)序列SEQIDNo.4，與pGEM-Teasy載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Ε.coliCompetentCellsDH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用TakaraMiniBESTPlasmidPurificationKitVer2·0質(zhì)粒提取試劑盒提取DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒作為陽性對照，命名為pGEM-Bga；10倍連續(xù)梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22.0觀.0者作為陽性對照。8.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述的檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒還含有(5)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。全文摘要本發(fā)明公開了檢測洋蔥腐爛病菌的核苷酸序列和試劑盒，屬于植物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。檢測洋蔥腐爛病菌的熒光定量PCR檢測引物，為序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法和試劑盒能夠特異、靈敏、快速地檢出洋蔥腐爛病菌。文檔編號C12Q1/68GK102230015SQ201110168198公開日2011年11月2日申請日期2011年6月21日優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日發(fā)明者呂玉峰,周琦,李子龍,李建光,梁新苗,江麗輝,汪萬春,王中康,王文靜,邊勇,鄧叢良,高文娜,黃魁建申請人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心