專利名稱：GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)在16種常見呼吸道病毒分型檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，哨點(diǎn)醫(yī)院等用于呼吸道相關(guān)疾病患者鼻咽抽提物標(biāo)本的16種呼吸道病毒(包括FluA、FluB、sHlNl、PIVUPIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、Co V 0C43、CoV 229E、CoV HKUl和 Adv)感染的同時(shí)檢測(cè)和分型。具體在NCBI下載16種呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻(xiàn)和多序列比對(duì)，確定病原體相對(duì)保守區(qū)，設(shè)計(jì)多重特異性引物。進(jìn)行單管多重(18重)PCR檢測(cè)16種呼吸道病毒保守區(qū)，整個(gè)反應(yīng)不到2個(gè)小時(shí)。本專利克服了病毒培養(yǎng)法、直接熒光抗體法、芯片檢測(cè)方法的操作繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，成本較高等缺點(diǎn)，為呼吸道病毒分型技術(shù)提供了新的思路，其高特異性、高靈敏度、快速的特點(diǎn)為呼吸道疾病相關(guān)病毒的快速準(zhǔn)確篩查和分型提供了有力的技術(shù)支撐，對(duì)研究我國呼吸道病患者感染病原譜和分子流行病學(xué)調(diào)查有重要意義。
背景技術(shù)：
急性呼吸道感染是廣泛分布于成年人和兒童的感染性疾病之一，具有相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率。大部分急性上呼吸道疾病和下呼吸道疾病主要是由呼吸道病毒引起的。傳統(tǒng)認(rèn)為，引起呼吸道疾病的主要病毒病原體有流感病毒A型(FluA)和B型(FluB)、人鼻病毒(HRV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3、PIV4)、腺病毒(Adv)等。然而，近十年來，新的呼吸道病毒不斷被發(fā)現(xiàn)，人偏肺病毒(HMPV)、冠狀病毒(NL63、HKU1、0C43、229E)、博卡(HBoV)病毒等也成為呼吸道疾病的重要病原，給人類的健康構(gòu)成很大的威脅。由于這些病毒引起的感染癥狀和流行癥狀相似，僅靠臨床癥狀及常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行病毒病原的確定是非常不可靠的，因此，迫切需要一種高靈敏度、高特異性的方法可以同時(shí)檢測(cè)傳統(tǒng)的和新興出現(xiàn)的呼吸道病原體，為臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，預(yù)防院內(nèi)感染。對(duì)于病毒性呼吸道感染的診斷，病毒培養(yǎng)法、直接熒光抗體法等傳統(tǒng)方法依然是實(shí)驗(yàn)室診斷的的常用方法。病毒培養(yǎng)法雖然特異性良好，但耗時(shí)耗力，難以應(yīng)用于臨床早期診斷和指導(dǎo)治療，一些病毒培養(yǎng)條件苛刻甚至不能培養(yǎng)。直接熒光抗體法(DFA)雖然快速，但需要專業(yè)的技術(shù)人員，特異性的抗體等。由于傳統(tǒng)病毒診斷技術(shù)存在明顯缺陷，其在臨床中的應(yīng)用受限。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，核酸擴(kuò)增法近年來被認(rèn)為是是簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性強(qiáng)的病毒檢測(cè)方法。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種新型PCR技術(shù)，能夠同時(shí)擴(kuò)增出多條目的DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)多病原體的快速鑒別和診斷，降低檢驗(yàn)成本。為了在單個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)更多常見呼吸道病毒，以實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、特異的檢測(cè)呼吸道病毒混合感染，本研究建立了基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(MultiplexRT-PCR)體系同時(shí)快速檢測(cè)常見的16種呼吸道病毒FluA、FluB、sHlNl、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoVHKUl和Adv，并對(duì)該方法的特異性和敏感性進(jìn)行了分析
發(fā)明內(nèi)容
I.在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/)下載上述 16 種呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻(xiàn)和多序列比對(duì)，確定病原體相對(duì)保守區(qū)，輸入GeXPeXpress Prof iler軟件設(shè)計(jì)多重特異性引物(Specif ic-Primer, SP-Primer)。將設(shè)計(jì)的引物通過NCBI Primer-Blast, Primer Premier 5. O分析評(píng)價(jià),使各引物具有相對(duì)一致的Tm值。參考多序列比對(duì)結(jié)果，在突變位置設(shè)置簡(jiǎn)并堿基。在全部正向引物和反向引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(Tag)，構(gòu)成特異性嵌合引物。上游通用引物標(biāo)簽的5’端標(biāo)記熒光染料Cy5(Cy5-Tag_F)。在整個(gè)引物體系中加入一對(duì)擴(kuò)增人類RNase P基因的引物Rnasep (F/R)，以檢驗(yàn)人源樣品質(zhì)量。引物信息見表I。2.建立了如下的檢測(cè)過程，詳見如下(I)合成引物引物均由上海Invitrogen公司合成，除Cy5-Tag_F采用HPLC純化夕卜，其余引物均PAGE純化。(2)使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，洗脫體積為50 μ 1，分裝置 于-80°C保存。(3)建立同時(shí)檢測(cè)16種呼吸道病毒的多重RT-PCR反應(yīng)體系，并對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。(4)用該18重RT-PCR檢驗(yàn)臨床標(biāo)本，對(duì)體系進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估。(5)將18對(duì)引物分成兩個(gè)體系，每個(gè)體系分別檢測(cè)9種、7種病毒，用QIAxcel全自動(dòng)電泳儀檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，為體系推廣做評(píng)定。表I GeXP 18重RT-PCR檢測(cè)16種呼吸道疾病相關(guān)病毒引物信息表
權(quán)利要求
1.一種單管18重PCR同時(shí)檢測(cè)16種呼吸道病毒，包括用于檢測(cè)呼吸道病毒FluA、FluB、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoVHKUU Adv的型特異性引物和檢測(cè)sHlNl的亞型特異性引物，另外包括一對(duì)擴(kuò)增人類RNaseP基因的引物檢驗(yàn)人源樣品質(zhì)量。
2.雙管多重(10重和9重)PCR同時(shí)檢測(cè)16種呼吸道病毒，體系A(chǔ)包括FluA、FluB、sHlNl、PIVl、HRV、CoV 0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv 和 RNase P 引物，體系 B 包含 PIV2、PIV3、RSVA, RSVB, CoVNL63、HMPV, HBoV 和 RNase P 引物，用 QIAxcel 全自動(dòng)電泳儀檢測(cè)。
3.權(quán)利要求I所述的18重PCR技術(shù)的引物和通用引物包括核酸序列表所列的基因序列及其每種序列的互補(bǔ)序列或變體。
4.權(quán)利要求I所述的18重PCR檢測(cè)技術(shù)包括呼吸道疾病相關(guān)病毒FluA、FluB、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv和sHlNlo
5.權(quán)利要求2所述的雙管多重PCR檢測(cè)技術(shù)分別包括呼吸道疾病相關(guān)病毒FluA、FluB、sHlNl、PIV1、HRV, CoV0C43、CoV229E、CoVHKUU Adv 和 PIV2、PIV3、RSVA, RSVB,CoVNL63、HMPV、HBoV。
6.權(quán)利要求4所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，哨點(diǎn)醫(yī)院用于呼吸道疾病相關(guān)病毒 FluA、FluB、PIVl、PIV2、PIV3、RSVA, RSVB, HRV, HMPV, HBoV, CoVNL63、CoV0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv 和 sHlNl 同時(shí)檢測(cè)和分型。
7.權(quán)利要求I所述的同時(shí)檢測(cè)呼吸道疾病相關(guān)病毒FluA、FluB、PIVUPIV2、PIV3、RSVA, RSVB, HRV, HMPV, HBoV, CoV NL63、CoV 0C43、CoV 229E、CoV HKUl、Adv 和 sHlNl 的多重PCR技術(shù)的反應(yīng)程序和檢測(cè)程序。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、哨點(diǎn)醫(yī)院等用于呼吸道相關(guān)疾病患者鼻咽抽提物標(biāo)本的16種呼吸道病毒(包括FluA、FluB、sH1N1、PIV1、PIV2、PIV3、RSVA、RSVB、HRV、HMPV、HBoV、CoV NL63、CoV OC43、CoV 229E、CoV HKU1和Adv)感染的同時(shí)檢測(cè)和分型。具體在NCBI下載16種呼吸道病毒代表株的核苷酸序列，通過查閱文獻(xiàn)和多序列比對(duì)，確定病原體相對(duì)保守區(qū)，設(shè)計(jì)多重特異性引物。進(jìn)行單管多重(18重)PCR檢測(cè)16種呼吸道病毒保守區(qū)，整個(gè)反應(yīng)不到2個(gè)小時(shí)。本專利既克服了常規(guī)單管多重?zé)晒舛ㄐ訮CR檢測(cè)不能分型的缺點(diǎn)，也克服了常規(guī)芯片檢測(cè)方法的操作繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，成本較高等缺點(diǎn)，為呼吸道病毒分型技術(shù)提供了新的思路，其高特異性、高靈敏度、快速的特點(diǎn)為呼吸道疾病相關(guān)病毒的快速準(zhǔn)確篩查和分型提供了有力的技術(shù)支撐，對(duì)研究我國呼吸道病患者感染病原譜和分子流行病學(xué)調(diào)查有重要意義。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102839223SQ20111016872
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者馬學(xué)軍, 李瑾, 毛乃穎, 許文波, 譚文杰 申請(qǐng)人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所