專利名稱：一種浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法。
背景技術：
能源是人類社會生存和發(fā)展的根本。由于傳統(tǒng)化石能源如煤炭，石油，天然氣等不可再生資源的日益枯竭，以及減排溫室氣體保護環(huán)境，確保人類社會可持續(xù)發(fā)展的迫切需要，大力發(fā)展可再生的生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)已成為緩解當前能源和環(huán)境危機的必然選擇。燃料乙醇是生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)方面發(fā)展最快，規(guī)模最大的一種生物燃料，具有生產(chǎn)技術較為成熟、生產(chǎn)原料來源廣泛等特點。在燃油中加入適量的燃料乙醇，可使尾氣中一氧化碳和碳氫化合物的含量分別下降30. 8%和13. 4%。目前，以木質(zhì)纖維素資源為原料的第二代燃料乙醇是世界各國的研究熱點，也是未來燃料乙醇發(fā)展的趨勢。但由于其原料本身的性質(zhì)，必須首先對木質(zhì)纖維素原料進行預處理才能有效將其利用。目前對木質(zhì)纖維素類原料的預處理方式主要有物理法、化學法、 物理化學法和生物法。這些方法各有特點但它們的缺點也很明顯如物理法設備復雜，成本高昂；化學法對環(huán)境污染大，成本較高；物理化學法設備成本高，糖得率較低；生物法處理周期長，降解能力待提高。另外再加上相關酶的生產(chǎn)成本高；酵母對半纖維素的主要酶解產(chǎn)物五碳糖的利用率低下等問題，使得木質(zhì)纖維素燃料乙醇遲遲未能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。水生植物浮萍是世界上最小的開花植物，它屬單子葉植物綱，天南星目，浮萍科， 全世界分布廣泛，共有5屬38種，我國有4屬12種。浮萍具有淀粉含量高、生長速度快、 易于培養(yǎng)、材料成本低、不占用耕地、不與人爭糧等優(yōu)點，是一種極具潛力的用于燃料乙醇生產(chǎn)的原料。利用浮萍生產(chǎn)燃料乙醇的生產(chǎn)具有如下獨特優(yōu)勢1.浮萍的淀粉含量高，可達其干重的40%，Jay J Cheng報道浮萍淀粉年產(chǎn)量可達28t/hm2，而玉米淀粉年產(chǎn)量僅為 5t/hm2，相對于木質(zhì)纖維素原料，淀粉質(zhì)原料只需經(jīng)過簡單的處理工藝便可用于乙醇發(fā)酵； 2.浮萍繁殖速度很快，約2 7天可繁殖一代，高于任何一種高等植物，G. Oron等報道浮萍生長速率達到0. 1 0. 35g (干重)/g (干重)· d，年產(chǎn)量高達55t/hm2 (干重)，玉米為 4. 9t/hm2，浮萍生長期長，在大多數(shù)溫帶至熱帶地區(qū)均可全年生長；3.浮萍中蛋白質(zhì)含量高達30%以上，Bhanthumnavin和McGarry報告浮萍中蛋白質(zhì)年產(chǎn)量可高達2000kg/hm2，而大豆、大米和玉米蛋白質(zhì)年產(chǎn)量分別為300、70和180kg/hm2，Cully and Epps報道浮萍磷含量為13 29g/kg (干重)，使浮萍用于燃料乙醇的生產(chǎn)時不需要添加外源的氮和磷，有利于降低生產(chǎn)成本；4.浮萍組織中氮磷含量較高，能在多種富含營養(yǎng)的污水中生長，TKN、TP去除率可達77%，在處理污水時能產(chǎn)生大量生物質(zhì)供燃料乙醇生產(chǎn)。開發(fā)浮萍作為燃料乙醇生產(chǎn)的原料，符合國家對生物燃料原料“不與人爭糧，不與糧爭地”的指導要求，在改善能源生產(chǎn)和消費結構，保護生態(tài)環(huán)境，推進社會經(jīng)濟發(fā)展等方面有重要現(xiàn)實意義。

目前以浮萍為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的報道很少、相關研究還不夠深入，國內(nèi)未見相關報道，國外以浮萍為原料的乙醇發(fā)酵通常沒有預處理工藝，如Jay J. Cheng等報道通過淀粉酶、支鏈淀粉酶和糖化酶的酶解以及酵母的發(fā)酵，沒有預處理工藝，得到的乙醇為0. 26g/g浮萍干物質(zhì)，未提到發(fā)酵后乙醇的濃度以及發(fā)酵效率這兩個重要指標。而由于浮萍成份及結構的特殊性，若將浮萍直接用于發(fā)酵會存在發(fā)酵后乙醇濃度低，發(fā)酵效率不高，原料利用率差等問題。因此，有必要開發(fā)一種高效、安全的預處理技術對浮萍進行預處理，進而提高浮萍發(fā)酵后的乙醇濃度，提高發(fā)酵效率及原料的利用率，促進浮萍在燃料乙醇產(chǎn)業(yè)上的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決浮萍發(fā)酵后乙醇濃度較低，發(fā)酵效率不高，原料利用不充分的缺點，通過對浮萍進行簡單預處理后快速發(fā)酵生成乙醇，提高乙醇濃度和發(fā)酵效率，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的目的是通過如下措施來達到1、將新鮮浮萍全株置于60°C烘干后粉碎過60目篩；2、將浮萍干粉與水按照1 3 1 6 (質(zhì)量比)混勻制成浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基；3、將浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基置于超聲波發(fā)生器，以頻率22 kHz，功率范圍為400 700W 的超聲波對其進行超聲處理，時間100 200s，以冰水浴對培養(yǎng)基進行降溫；4、將超聲處理后的浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基升溫至95°C保持5min，按100 200μ l/100g 浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基的比例加入α -淀粉酶液化lOmin，碘檢呈紅棕色，完成液化，冷卻后補足蒸發(fā)的水份至初始料水比；5、將液化后的浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基于115°C滅菌20min，冷卻至50°C，無菌條件按 150 200 μ l/100g浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基的比例分別加入預處理酶和糖化酶，于50°C，180 220rpm同時進行預處理和糖化過程2h，將預處理后的浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基于無菌條件下向每IOOg浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床，180 220rpm，30°C發(fā)酵11 14h?；驅缇蟮母∑及l(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至30°C，無菌條件下加入預處理酶和糖化酶，同時接入酵母種子液和混合維生素液，180 220rpm振蕩，同步進行預處理、糖化和發(fā)酵；所述浮萍采自四川省成都市邛崍回龍鎮(zhèn)；所述加入的α -淀粉酶，標準酶活力為90KNU/ml (KNU為諾維信液化酶的專有單位)，酶活定義37°C、pH 5. 6時，每小時水解5. 26g淀粉的酶量為IKNU ；所述加入的預處理酶為β -葡聚糖，酶標準酶活> IX 105u/ml (酶活定義1ml酶液于50°C，pH 4. 5條件下，Imin催化β -葡聚糖水解生成Iug葡萄糖為一個β -葡聚糖酶活力單位)；所述加入的糖化酶Suhong GAII，標準酶活力為500AGU/ml，酶活定義在25°C， pH4. 3標準條件下，每分鐘水解Immol麥芽糖所需的酶量為IAGU ；所述的酵母種子液是用以下方法培養(yǎng)獲得的，培養(yǎng)基成分為葡萄糖100g/L，酵母粉8. 5g/L，硫酸銨1. 3g/L，硫酸鎂0. lg/L，氯化鈣0. 06g/L, 115°C滅菌20min，無菌條件下從YEPD斜面接入一環(huán)釀酒酵母，300C，150rpm, 14h后作為酵母種子液，此時菌液稀釋十倍后OD62tl為1. 0 1. 1?；蛘呷?. 25g安琪酵母干粉于無菌條件下加到50ml 2% (w/v)無菌葡萄糖液中置于搖床150rpm，37°C復水15min，然后于30°C，150rpm活化至酵母菌液稀釋十倍后0D620為1. 0 1. 1。
所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于混合維生素液成分為肌醇 0. 85g/L，VBl 0. 35g/L, VB6 0. 004g/L，煙酸 0. 004g/L，對氨基苯甲酸 0. 007g/L，生物素 24μ g/L，泛酸 3. 5ml/L。發(fā)酵結束后取樣測定發(fā)酵醪中乙醇濃度，最終乙醇濃度可達3. 17% (w/w)，發(fā)酵時間小于14h，發(fā)酵效率達到90%以上。

本發(fā)明提供了一種浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的預處理方法，與木質(zhì)纖維素原料用于燃料乙醇生產(chǎn)時需要進行復雜的預處理工藝相比，浮萍的預處理工藝在常溫下進行，簡單可行，耗時短，成本低廉，無污染物產(chǎn)生，預處理后的浮萍發(fā)酵可達到3. 17% (w/w)的乙醇濃度，相對于預處理前提高了 33. 2%，是目前所報道的基于浮萍原料生產(chǎn)燃料乙醇所達到的最高濃度，較木質(zhì)纖維素燃料乙醇的預處理工藝有明顯優(yōu)勢。
具體實施例方式以下所給出的實施例是為進一步說明本發(fā)明的基本原理和主要技術特征，并非對本發(fā)明的技術方案進行限制。本行業(yè)的技術人員應了解，本發(fā)明不受以下實施例的限制，對本發(fā)明中的技術方案進行的任何修改或局部替換，以及各種變化和改進，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。對照例1-2和實施例1-4所使用的酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CCTCC M206111 ；實施例5為安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的釀酒高活性干酵母。對照例1取20g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入80ml水混勻制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于95°C保溫5min，然后加入200 μ 1 α -淀粉酶，保溫IOmin進行液化，液化完成并冷卻后補足蒸發(fā)水分，115°C滅菌20min。冷卻后于無菌條件下加入150 μ 1糖化酶，50°C，220rpm 糖化2h，然后向每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，然后置于搖床200rpm，3(TC發(fā)酵13h后利用氣相色譜測得乙醇濃度為2.09% (w/w)，發(fā)酵效率為 70. 5%。對照例2取25g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入75ml水混勻制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于951保溫51^11，然后加入20(^1 α -淀粉酶，保溫IOmin進行液化，液化完成并冷卻后補足蒸發(fā)水分，115°C滅菌20min。冷卻后于無菌條件下加入200 μ 1糖化酶，50°C，220rpm糖化2h，然后向每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床， 220rpm, 30°C發(fā)酵14h后利用氣相色譜測得乙醇濃度為2. 38% (w/w)，發(fā)酵效率為64. 2%。實施例1取14. 29g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入85. 71ml水混勻制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于超聲波發(fā)生器，功率400W，IOOs進行預處理，用冰水浴冷卻反應體系，然后將培養(yǎng)基置于95°C保溫5min，加入100μ 1 α -淀粉酶，保溫IOmin進行液化，液化完成并冷卻后補足蒸發(fā)水分至初始料水比，1151滅菌201^11。冷卻至501后無菌條件下分別加入15(^1 預處理酶和糖化酶，50°C 200rpm預處理2h，然后向每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床180rpm，30°C發(fā)酵Ilh后利用氣相色譜測得乙醇濃度可達1. 95% (w/w)，發(fā)酵效率達94. 0% ο
實施例2取16. 67g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入83. 33ml水混勻制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于超聲波發(fā)生器，功率500W，130s進行預處理，用冰水浴冷卻反應體系，然后將培養(yǎng)基置于95°C保溫5min，加入150μ 1 α -淀粉酶，保溫IOmin進行液化，液化完成并冷卻后補足蒸發(fā)水分至初始料水比，1151滅菌201^11。冷卻至501后無菌條件下分別加入15(^1 預處理酶和糖化酶，50°C 220rpm預處理2h，然后向每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床180rpm，30°C發(fā)酵12h后利用氣相色譜測得乙醇濃度可達2. 13% (w/w)，發(fā)酵效率達92. 5%。實施例3取20g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入80ml水混勻制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于超聲波發(fā)生器，功率600W，160s進行預處理，用冰水浴冷卻反應體系，然后將培養(yǎng)基置于95°C保溫5min，加入200 μ 1 α -淀粉酶，保溫IOmin進行液化，液化完成并冷卻后補足蒸發(fā)水分至初始料水比，115°C滅菌20min。冷卻至50°C后無菌條件下分別加入150 μ 1預處理酶和糖化酶，50°C 220rpm預處理2h，然后向每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床200rpm，3(TC發(fā)酵13h后利用氣相色譜測得乙醇濃度可達 2. 40% (w/w)，發(fā)酵效率為 91. 2%。實施例4取25g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入75ml水混勻制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于超聲波發(fā)生器，功率700W，200s進行預處理，用冰水浴冷卻反應體系，然后將培養(yǎng)基置于951保溫51^11，加入20(^1 α -淀粉酶，保溫IOmin進行液化，液化完成并冷卻后補足蒸發(fā)水分，115°C滅菌20min。冷卻至30°C后無菌條件下分別加入200 μ 1預處理酶和糖化酶， 再向每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床220rpm， 30°C發(fā)酵13. 5h后利用氣相色譜測得乙醇濃度可達3. 17% (w/w)，此時發(fā)酵效率為90. 4%。實施例5取25g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入75ml水混勻制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將 培養(yǎng)基置于超聲波發(fā)生器，功率700W，200s進行預處理，用冰水浴冷卻反應體系，然后將培養(yǎng)基置于95°C保溫5min，加入200 μ 1 α-淀粉酶，保溫IOmin進行液化，液化完成并冷卻后補足蒸發(fā)水分，115°C滅菌20min。冷卻至30°C后無菌條件下分別加入200 μ 1預處理酶和糖化酶，再向每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml安琪酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床 220rpm，3(TC發(fā)酵13. 5h后利用氣相色譜測得乙醇濃度為2. 67%，發(fā)酵效率為74. 1%。
權利要求
1.一種浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于包括以下步驟a 將新鮮浮萍全株置于60°C烘干后粉碎過60目篩；b 將浮萍干粉與水混勻制成浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基，放入超聲波發(fā)生器對其進行預處理，同時利用冰水浴對反應體系降溫；c 將超聲波處理后的浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基升溫至95°C保持5min，加入α -淀粉酶進行液化，液化完成后補足蒸發(fā)的水份；d:將液化后的浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基于115°C滅菌20min，冷卻至50°C，無菌條件加入預處理酶和糖化酶，于50°C，180 220rpm進行培養(yǎng)基的預處理和糖化2小時，在無菌條件下向每IOOg浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基中接入IOml酵母種子液和Iml混合維生素液，置于搖床，180 220rpm, 30°C發(fā)酵11 14h ；或將滅菌后的浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至30°C，無菌條件下加入預處理酶和糖化酶，同時接入酵母種子液和混合維生素液，180 220rpm振蕩，同步進行預處理、糖化和發(fā)酵。
2.根據(jù)權利要求1所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于浮萍干粉與水按質(zhì)量比13 16混勻制成浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權利要求1所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于超聲波預處理時所使用的超聲波頻率為22kHz，功率為400 700W，時間為100 200s。
4.根據(jù)權利要求1所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于加入的α-淀粉酶量為100 200 μ l/100g浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基，碘檢呈紅棕色時完成液化。
5.根據(jù)權利要求1所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于加入的糖化酶量為150 200 μ l/100g浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權利要求1所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于加入的預處理酶是β-葡聚糖酶。
7.根據(jù)權利要求6所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于加入的預處理酶量為150 200 μ l/100g浮萍發(fā)酵培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權利要求1所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于所述的酵母種子液是用以下方法培養(yǎng)獲得的，培養(yǎng)基成分為葡萄糖100g/L，酵母粉8. 5g/L，硫酸銨 1. 3g/L，硫酸鎂0. lg/L，氯化鈣0. 06g/L, 115 °C滅菌20min，無菌條件下從YEPD斜面接入一環(huán)釀酒酵母，30°C，150rpm，14h后作為酵母種子液，此時菌液稀釋十倍后OD62tl為1. 0 1. 1，或者取0.25g酵母干粉于無菌條件下加到50ml 2% (w/v)無菌葡萄糖液中置于搖床 150rpm，37°C復水15min，然后于30°C，150rpm活化至酵母菌液稀釋十倍后0D620為1. 0 1. 1。
9.根據(jù)權利要求1所述的浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于混合維生素液成分為肌醇 0. 85g/L，VB1 0. 35g/L，VB6 0. 004g/L，煙酸 0. 004g/L，對氨基苯甲酸 0. 007g/ L，生物素 24 μ g/L，泛酸 3. 5ml/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種浮萍發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法。主要工藝過程包括原料烘干后粉碎，與水混勻，對混合物進行超聲波預處理，再加入α-淀粉酶滅菌冷卻后加入預處理酶和糖化酶進行預處理和糖化，在無菌條件下加入預備好的釀酒酵母種子液和混合維生素液，放入搖床進行發(fā)酵。本發(fā)明利用一種非糧、水生植物浮萍來生產(chǎn)燃料乙醇；通過對浮萍進行預處理提高發(fā)酵后乙醇濃度，預處理工藝簡單，成本低廉，無污染物產(chǎn)生，發(fā)酵時間短、效率高。
文檔編號C12P7/06GK102277389SQ20111016941
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權日2011年6月22日
發(fā)明者方揚, 趙海, 陳謙, 靳艷玲 申請人:中國科學院成都生物研究所