專利名稱：一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)菌篩選領(lǐng)域，特別涉及一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法。
背景技術(shù)：
隨著染料工業(yè)的快速發(fā)展，印染工業(yè)廢水和染料生產(chǎn)廢水的排放造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題。染料根據(jù)其應(yīng)用分為酸性染料、分散染料、活性染料等等?；钚匀玖弦呀?jīng)成為棉纖維染色用最主要的染料類別，遠(yuǎn)大于其他染料。偶氮染料因其生產(chǎn)方法簡單，具有很廣的色譜范圍，并具有一定的牢度，因而成為商業(yè)應(yīng)用最多的合成染料。自然界存在的天然偶氮染料很少，工業(yè)用偶氮染料幾乎全部為人工合成產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜品種繁多，穩(wěn)定性高，具有很強(qiáng)的抗光、抗氧化的能力，故含偶氮染料的廢水通常比較難處理。而且偶氮染料和其代謝物會對人體健康造成危害，具有致癌、致畸、致突變的作用。關(guān)于活性染料脫色細(xì)菌的研究已有很多，但具有廣譜性脫色效果的細(xì)菌相對較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，該方法方法簡便快捷，成本低，對環(huán)境友好，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，包括(1)將活性染料污泥用無菌玻璃珠打散后制成的菌懸液接種于富集培養(yǎng)基中，使用含有不同濃度梯度的染料在富集培養(yǎng)基中馴化4周；(2)將馴化后的菌液，取OD值為1的菌液，做梯度稀釋，每個(gè)稀釋度的菌液均勻涂布到固體培養(yǎng)基上于35°C厭氧培養(yǎng)48h，重復(fù)此步驟直至固體培養(yǎng)基上長出的菌落大小均勻，邊緣清晰；將分離到的單菌落劃線至含染料的固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，將其接種于含染料的液體培養(yǎng)基中，觀察菌株脫色效果，將脫色效果好的菌株進(jìn)行保藏，即得。所述步驟⑴中的富集培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，配方如下牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，蒸餾水1000mL。所述步驟(1)中的含有不同濃度梯度的染料為經(jīng)濾菌的活性黑5、活性紅239、活性藍(lán)19或活性艷橙x-an，濃度梯度分別為50mg/L、100mg/L、150mg/L和200mg/L，改變濃度的時(shí)間間隔為7d。所述步驟(1)中的馴化條件為于35°C厭氧馴化。所述步驟⑵中的梯度稀釋為KT1 10_7的梯度稀釋。所述步驟O)中的固體培養(yǎng)基為步驟(1)中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入17g/L 的瓊脂粉。所述步驟(2)中的含染料的固體培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉 5g/L,瓊脂 20g/L，蒸餾水 IOOOmL,染料 50mg/L。所述步驟( 中的含染料的液體培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L,蒸餾水 IOOOmL,染料 50mg/L。所述保藏為做斜面低溫保藏和甘油冷凍保藏，斜面低溫保藏所用培養(yǎng)基為將固體培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后，倒入5mL液體于干凈試管中，將試管平放在坡面上，使管內(nèi)培養(yǎng)基形成斜面，且培養(yǎng)基上沿不超過試管的2/3 ；甘油冷凍保藏所用甘油為純甘油與無菌水體積比為1 1的混合液，將其加入含等體積過夜生長菌液的無菌EP管中，-20°C保藏，以上操作應(yīng)在無菌操作臺上進(jìn)行。有益效果本發(fā)明分離純化方法簡便快捷，成本低，對環(huán)境友好，應(yīng)用前景廣闊；篩選得到的細(xì)菌可應(yīng)用于脫色活性染料，可耐受強(qiáng)堿性染料廢水48h內(nèi)脫色率可達(dá)80%以上。


圖1為模式染料活性黑5的分子結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(1)將活性污泥制成的菌懸液接種于富集培養(yǎng)基中，使用含有不同梯度濃度染料的富集培養(yǎng)基馴化4周；其中富集培養(yǎng)基為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、蒸餾水1000mL，pH = 7. 0-8. 0 ；同時(shí)加入梯度濃度的濾菌染料，使培養(yǎng)基中染料的濃度均依次升高，為活性黑50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，每7d提高一個(gè)濃度梯度，于30 35°C， 厭氧條件下進(jìn)行馴化培養(yǎng)4周；(2)取馴化4周后的樣品，靜置30分鐘，取上層水樣lmL，作10—1 10_7梯度稀釋。每種稀釋濃度分別取ImL菌液于培養(yǎng)皿內(nèi)，適用無菌刮鏟將其均勻涂布在固體培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)皿倒置于35°C厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，挑取形態(tài)均勻、邊緣清晰的單一菌落， 編號，在固體培養(yǎng)基上劃線，將培養(yǎng)皿倒置于35°C厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再觀察結(jié)果，反復(fù)幾次，并在光學(xué)顯微鏡下使用油鏡鏡頭觀察，選取多個(gè)視野范圍觀測，確保95%以上的菌株是純的單一菌株后，將分離出的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，4°C下保存于冰箱中待后續(xù)進(jìn)行脫色試驗(yàn)。另取600 μ 1液體培養(yǎng)的細(xì)菌，加入600 μ 150%甘油，裝入滅過菌的EP管中混合均勻，做好標(biāo)記后保存于-20度。其中固體培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加入17g/L的瓊脂粉，高溫高壓滅菌后而冷卻形成的培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基為將固體培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后，趁熱倒入5mL液體于干凈試管中，將試管平放在坡面上，使管內(nèi)培養(yǎng)基形成斜面，且培養(yǎng)基上沿不超過試管的2/3，以上操作在無菌操作臺上進(jìn)行。(3)分別挑取經(jīng)分離純化后的單一菌落于含50mg/L染料的液體富集培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，蒸餾水IOOOmL)中培養(yǎng)，在35°C、250mL錐形瓶中裝液量IOOmL培養(yǎng)基的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48h，培養(yǎng)后通過顯微鏡觀察細(xì)菌生長情況以及測定溶液中染料的剩余濃度，從而確定出具有脫色活性偶氮染料特性的菌株。
該菌株在初始pH值為7. 0-8. 0，溫度為35°C，250mL錐形瓶的裝液量為IOOmL的條件下，菌株接種量為1%，染料初始濃度為50mg/L，培養(yǎng)時(shí)間48h，然后利用紫外分光光度法對染料濃度進(jìn)行測定，測定波長為498nm ；染料的脫色率可達(dá)91. 4%。
權(quán)利要求
1.一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，包括(1)將活性染料污泥用無菌玻璃珠打散后制成的菌懸液接種于富集培養(yǎng)基中，使用含有不同濃度梯度的染料在富集培養(yǎng)基中馴化4周；(2)將馴化后的菌液，取OD值為1的菌液，做梯度稀釋，每個(gè)稀釋度的菌液均勻涂布到固體培養(yǎng)基上于35°C厭氧培養(yǎng)48h，重復(fù)此步驟直至固體培養(yǎng)基上長出的菌落大小均勻， 邊緣清晰；將分離到的單菌落劃線至含染料的固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，將其接種于含染料的液體培養(yǎng)基中，觀察菌株脫色效果，將脫色效果好的菌株進(jìn)行保藏，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，其特征在于所述步驟(1)中的富集培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，配方如下牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L， 氯化鈉5g/L，蒸餾水1000mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，其特征在于所述步驟(1)中的含有不同濃度梯度的染料為經(jīng)濾菌的活性黑5、活性紅239、活性藍(lán)19或活性艷橙x-an，濃度梯度分別為50mg/L、100mg/L、150mg/L和200mg/L，改變濃度的時(shí)間間隔為7d。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，其特征在于所述步驟(1)中的馴化條件為于35°C厭氧馴化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，其特征在于所述步驟⑵中的梯度稀釋為10—1 10_7的梯度稀釋。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，其特征在于所述步驟O)中的固體培養(yǎng)基為步驟(1)中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入17g/L的瓊脂粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，其特征在于所述步驟O)中的含染料的固體培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂 20g/L，蒸餾水 IOOOmL,染料 50mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，其特征在于所述步驟O)中的含染料的液體培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，蒸餾水 1 OOOmL，染料 50mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脫色多種活性染料的細(xì)菌的篩選方法，包括(1)將活性染料污泥用無菌玻璃珠打散后制成的菌懸液接種于富集培養(yǎng)基中，使用含有不同濃度梯度的染料在富集培養(yǎng)基中馴化4周；(2)將馴化后的菌液，取OD值為1的菌液，做梯度稀釋，每個(gè)稀釋度的菌液均勻涂布到固體培養(yǎng)基上于35℃厭氧培養(yǎng)48h，重復(fù)此步驟直至固體培養(yǎng)基上長出的菌落大小均勻，邊緣清晰；將分離到的單菌落劃線至含染料的固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，將其接種于含染料的液體培養(yǎng)基中，觀察菌株脫色效果，將脫色效果好的菌株進(jìn)行保藏，即得。本發(fā)明分離純化方法簡便快捷，成本低，對環(huán)境友好，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12R1/01GK102268388SQ20111017042
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者于文娟, 張武剛, 柳建設(shè), 洪武林, 王兆慧, 許賀, 謝學(xué)輝 申請人:東華大學(xué)