專利名稱：一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的清除試劑及其使用方法。
背景技術(shù)：
支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的污染物，會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是由于支原體的二分裂時(shí)間為1-6小時(shí)，所以支原體污染培養(yǎng)細(xì)胞后初期不易察覺(jué)。在細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染支原體來(lái)源于口腔支原體(M. orale)、精氨酸支原體(M. arginini)、豬鼻支原體 (M. hyorhinis)和萊氏無(wú)膽甾原體(A. Iaidlawii)。培養(yǎng)細(xì)胞污染支原體后依不同支原體的抗原性及生化代謝差別而會(huì)有不同的致病性，但大致表現(xiàn)是相同的，最開(kāi)始引起實(shí)驗(yàn)者注意的是培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)變緩慢，之后培養(yǎng)液很快就變黃，而且細(xì)胞生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，繼而在某次傳代后出現(xiàn)細(xì)胞間大量黑點(diǎn)，細(xì)胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的細(xì)胞，細(xì)胞固縮，最終完全死亡。在細(xì)胞培養(yǎng)中，腫瘤系細(xì)胞一般為3η 如體，分裂時(shí)比2η體的原代細(xì)胞染色質(zhì)組蛋白合成量更多。而精氨酸作為組蛋白的主要構(gòu)成成分，在腫瘤系細(xì)胞分裂時(shí)所需的精氨酸量更大，所以相較于原代細(xì)胞，對(duì)支原體更敏感，所以黑點(diǎn)現(xiàn)象在腫瘤系細(xì)胞中更容易出現(xiàn)，出現(xiàn)后也更明顯。而原代細(xì)胞污染支原體后的表現(xiàn)主要是生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞變形，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡，逐漸出現(xiàn)巨細(xì)胞化及拉網(wǎng)現(xiàn)象，另外，有些懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞在支原體污染后，除了生長(zhǎng)緩慢外，經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)集現(xiàn)象。支原體分類屬于柔膜體綱，支原體目，其中能通過(guò)0.22um濾膜污染培養(yǎng)細(xì)胞的有支原體科和無(wú)膽留原體科兩個(gè)科，包括支原體屬的約80個(gè)種和無(wú)膽留原體的8個(gè)種中的某些種。由于支原體分類與細(xì)菌有差異，故一般用于細(xì)菌的抗生素并不能很好的殺滅抑制支原體，由于其種類繁多，故需選用有針對(duì)性的廣譜抗生素聯(lián)合用藥才能達(dá)到最大限度的清除和抑制，而目前并沒(méi)有研究出能夠系統(tǒng)消除支原體污染的試劑及方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑及其使用方法， 能夠系統(tǒng)的檢測(cè)出支原體的種類并將清除，可以有效的清除支原體污染，并不會(huì)對(duì)細(xì)胞的本身代謝帶來(lái)影響。所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于1. 一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于所述試劑由A液、B液等體積混合或A液、B液、 C液等體積混合而成，其中A液由半合成截短側(cè)耳素衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5% ；B液由喹諾酮類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中喹諾酮類衍生物質(zhì)量_體積百分比濃度為0.5% -1.5% ；C液由四環(huán)素類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合后四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量_體積百分比濃度為0. 25% -0. 75% ；所述A液、B液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2 ；所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。所述半合成截短側(cè)耳素衍生物選用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。所述喹諾酮類衍生物選用抗生素恩諾沙星或麻保沙星或單諾沙星。所述四環(huán)素類衍生物選用多西環(huán)素或二甲胺四環(huán)素。一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于包括以下步驟a、支原體檢測(cè)(1)提取細(xì)胞培養(yǎng)物中基因組DNA ；(2)將步驟⑴中提取的基因組DNA放入待測(cè)試管，使用設(shè)計(jì)的支原體檢測(cè)簡(jiǎn)并引物，使用PCR方法擴(kuò)增提取的基因組DNA目的片段，所述檢測(cè)引物為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無(wú)膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，
反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠上樣電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，根據(jù)產(chǎn)物片段判斷支原體種類；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過(guò)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用；(2)取半合成截短側(cè)耳素衍生物溶于0. OlMPBS配制成半合成截短側(cè)耳素衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5%的A液，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；取喹諾酮類衍生物溶于0. OlMPBS配制成喹諾酮類衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5%的B液，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌， 分裝，避光在-20°C凍存；取四環(huán)素類衍生物溶于0. OlMPBS配制成四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 25%-0. 75%的C液，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um —次性濾器過(guò)濾除菌， 分裝，避光在-20°C凍存；C、支原體清除步驟A中所檢測(cè)出來(lái)的支原體種類為同屬支原體，將配置好的A液、B液等體積混合，然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋500倍，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為溫度為37°C、5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過(guò)程中，每24h換液一次，換液時(shí)用0. OlMPBS清洗培養(yǎng)容器；步驟A中所檢測(cè)出來(lái)的支原體種類為不同屬的混合支原體，A液、B液、C液等體積混合制成清除試劑，然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋333倍，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為溫度為37°C、5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過(guò)程中，每24h換液一次，換液時(shí)用0. OlMPBS 清洗培養(yǎng)容器。在步驟a中，觀察成像系統(tǒng)，如果觀察到結(jié)果中的PCR產(chǎn)物片段單一，則直接純化PCR產(chǎn)物后測(cè)序，檢測(cè)出支原體的種類；如果PCR產(chǎn)物片段為混合污染，多個(gè)條帶陽(yáng)性，則將陽(yáng)性片段克隆入T載體，挑取單克隆后測(cè)序，檢測(cè)出支原體的種類。所述A液、B液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物和喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2;所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。本發(fā)明中A液、B液均為無(wú)色透明液體，C液則為淡黃色透明液體。將A液和B液按照培養(yǎng)截短側(cè)耳素類藥物與氟喹諾酮類藥物濃度比為3 2混合稀釋后，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，可以預(yù)防培養(yǎng)細(xì)胞的支原體污染。A液、B液、C液注意避光保存，低溫冷凍。-20°C避光保存2年有效，_70°C保存可長(zhǎng)期保存，4°C避光一周有效，常溫4 有效。使用過(guò)程中也盡量避光。使用本發(fā)明試劑和方法，如污染不嚴(yán)重，可在一周內(nèi)顯效。如污染嚴(yán)重，至少要處理兩周，還可以用來(lái)預(yù)防污染。經(jīng)治處理的污染細(xì)胞，治療周期完成后，細(xì)胞間無(wú)黑點(diǎn)，細(xì)胞生長(zhǎng)周期回復(fù)正常，細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)團(tuán)聚生長(zhǎng)。預(yù)防處理的培養(yǎng)基使用，在已經(jīng)清除污染源的情況下，可最大限度預(yù)防污染再次發(fā)生。


圖1是實(shí)施例一、二、三中使用清除試劑前后對(duì)照?qǐng)D，A是A549細(xì)胞治療前的熒光照片，A’是A549細(xì)胞治療治療后的熒光照片；B是SH-SY細(xì)胞治療前的熒光照片，B’是SH-SY細(xì)胞治療后的熒光照片；C是HELA細(xì)胞的治療前的熒光照片，C，是HELA細(xì)胞治療后的熒光照片；圖2是實(shí)施例一、二、三PCR產(chǎn)物電泳圖，圖3是實(shí)施例二測(cè)序圖，圖4是實(shí)施例四中細(xì)胞接種及藥物加入示意圖，圖5是實(shí)施例四中反應(yīng)產(chǎn)物熔解曲線，圖6是實(shí)施例五中細(xì)胞接種及藥物加入示意圖，圖7是實(shí)施例五內(nèi)參照片段的反應(yīng)曲線圖，圖8是實(shí)施例五中目的片段的反應(yīng)曲線圖，圖9是實(shí)施例五中反應(yīng)產(chǎn)物片段熔解曲線圖。
具體實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑由A液、B液等體積混合而成，其中A液由泰妙菌素和0. OlMPBS混合而成，混合液中泰妙菌素的質(zhì)量_體積百分比濃度為1.5% ；B液由恩諾沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中恩諾沙星質(zhì)量_體積百分比濃度為；將A液、B液等體積混合，混合液中泰妙菌素與恩諾沙星質(zhì)量比為3 2。
一種用以上試劑清除支原體污染的方法，選用A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)的培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其具體步驟如下a、支原體檢測(cè)(1)A549細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基以DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)公司GIBCO公司生產(chǎn))加入10% FBS (國(guó)產(chǎn)四季清胎牛，無(wú)支原體級(jí))配成完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C，5% C02， 20% 02，相對(duì)濕度100%的無(wú)菌溫箱；按蛋白酶K法快速提取基因組DNA ；(2)取步驟(1)中提取的基因組DNA放入待測(cè)試管中，使用設(shè)計(jì)的支原體檢測(cè)引物，使用PCR方法擴(kuò)增，所述檢測(cè)引物為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無(wú)膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；可以同時(shí)將兩種引物加入同一個(gè)待測(cè)試管，也可以分開(kāi)放入兩個(gè)待測(cè)試管。(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察，觀察結(jié)果如圖2，圖2中1、2、3泳道為A549細(xì)胞檢測(cè)條帶，樣品分別采集自不同的培養(yǎng)者，顯示和312bp處的無(wú)膽甾原體，分別代表萊氏無(wú)膽甾原體(Achol印Iasma laidlawii)禾口中度無(wú)膽留原體(Acholeplasma mocurum)；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過(guò)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用(2)分別配置A液、B液；取1. 5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為 1.5%的A液，分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)恩諾沙星溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌制成恩諾沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為1 %的B液，分裝，_20°C凍存；C、支原體清除將配置好的A液、B液等體積混合制成清除試劑，其混合后泰妙菌素和恩諾沙星的濃度比為3 2。將清除試劑加入A549細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中稀釋500倍，稀釋后泰妙菌素和恩諾沙星的質(zhì)量-體積比分別為15ug/ml和lOug/ml，其中，每24h換液一次，換液時(shí)用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，處理2周，待治療過(guò)程中A549細(xì)胞長(zhǎng)滿至瓶底面積的 60% -80%時(shí)，胰酶消化傳代，轉(zhuǎn)新瓶培養(yǎng)2周。取上述AB液清除試劑處理后的A549細(xì)胞，再次進(jìn)行PCR檢測(cè)。未再檢測(cè)出陽(yáng)性片段。將污染的未經(jīng)清除試劑處理的A549細(xì)胞用hoechst33258藍(lán)色染料染色(染料使用濃度300nM)，熒光顯微鏡觀察照相，如圖1中的照片A。同時(shí)將處理后的A549細(xì)胞也用 h0echst33258藍(lán)色染料(300nM)染色觀察照相，見(jiàn)圖1中照片A’。胞漿中的綠色熒光為針對(duì) LC3 (microtubule associated protein 1 light chain 3-LC3)的一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的二抗免疫熒光顯色。將A549細(xì)胞治療前的熒光照片圖A與治療后的熒光照片圖A’對(duì)比，其結(jié)果為治療前可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)由支原體污染激活的吞噬泡；治療后細(xì)胞生理狀態(tài)明顯恢復(fù)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯空泡聚集。實(shí)施例二所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑由A液、B液等體積混合而成，其中A液由沃尼妙林和0. OlMPBS混合而成，混合液中沃尼妙林的質(zhì)量_體積百分比濃度為1.5% ；B液由麻保沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中麻保沙星的質(zhì)量_體積百分比濃度為；A液、B液等體積混合，混合液中沃尼妙林與麻保沙星質(zhì)量比為3 2。一種用以上試劑清除支原體污染的方法，選用SH-SY-5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤) 的培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)，其具體步驟如下a、支原體檢測(cè)(1) SH-SY-5Y細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基以DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBC0公司生產(chǎn))加入10% FBS (國(guó)產(chǎn)四季清太牛，無(wú)支原體級(jí))配成完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C，5% C02,20% 02，相對(duì)濕度100%的無(wú)菌溫箱；按蛋白酶K法快速提取基因組DNA ；(2)取步驟(1)中提取的基因組DNA分別放入兩個(gè)待測(cè)試管中，并在兩個(gè)PCR反應(yīng)管中分別放入下面兩種支原體檢測(cè)引物，使用PCR方法擴(kuò)增，其檢測(cè)引物序列為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無(wú)膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，； (3)分別取兩個(gè)試管中的PCR產(chǎn)物以2 %瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，PCR產(chǎn)物成像結(jié)果如圖2，圖2中7、8、9泳道為SH-SY細(xì)胞檢測(cè)條帶，第7道未見(jiàn)無(wú)膽留原體片段，第8道可見(jiàn)472bp肺支原體(M. Pulmonis)片段產(chǎn)物，第9道為空白對(duì)眧.
/、、、 G) PCR產(chǎn)物切膠回收后，直接連接PMD19T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)室制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5ci株，涂板37°C培養(yǎng)過(guò)夜挑克隆，小提質(zhì)粒酶切鑒定后送測(cè)序；(5)測(cè)序結(jié)果如圖3，結(jié)果證實(shí)SH-SY-5Y細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)鼠呼吸道來(lái)源的支原體 (Mycoplasma pulmonis)污染；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過(guò)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用⑵)分別配置A液、B液；取1.5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為 1.5%的A液，分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)麻保沙星溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌制成麻保沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為1 %的B液，分裝，-20°C凍存；C、支原體清除將配置好的A液、B液等體積混合制成清除試劑，其混合后沃尼妙林和麻保沙星的質(zhì)量比為3 2。將清除試劑加入SH-SY-5Y細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中稀釋500倍，稀釋后沃尼妙林和麻保沙星的質(zhì)量-體積比分別為15ug/ml和10ug/ml，每24h換液一次，換液時(shí)用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，處理2周，待治療過(guò)程中SH-SY-5Y細(xì)胞長(zhǎng)滿至瓶底面積的 60% -80%時(shí)，胰酶消化傳代，轉(zhuǎn)新瓶培養(yǎng)，處理1-2周。取上述AB液清除試劑處理后的中SH-SY細(xì)胞，提取基因組DNA，再次進(jìn)行PCR 檢測(cè)。未再檢測(cè)出陽(yáng)性片段，將污染的未經(jīng)清除試劑處理的SH-SY-5Y細(xì)胞做熒光染色 hoechst和PI雙染，hoechst染料5ug/ml，PI染料0. 5ug/ml (含RNAase)，熒光顯微鏡觀察照相，如圖1中的照片B，用同種方法檢測(cè)處理后的SH-SY-5Y細(xì)胞觀察照相，見(jiàn)圖1中的照片B，。將SH-SY細(xì)胞治療前的熒光照片B與治療后的熒光照片B’對(duì)比，其結(jié)果為治療前PI染色可見(jiàn)細(xì)胞外花環(huán)狀排列的支原體集落；經(jīng)治療后PI染色未見(jiàn)明顯異常結(jié)構(gòu)。實(shí)施例三所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑由A液、B液、C液等體積混合而成，其中A液由沃尼妙林和0. OlMPBS混合而成，混合液中沃尼妙林的質(zhì)量_體積百分比濃度為1.5% ；B液由恩諾沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中恩諾沙星的質(zhì)量_體積百分比濃度為；C液由二甲胺四環(huán)素和0. OlMPBS混合而成，混合液中二甲胺四環(huán)素的質(zhì)量_體積百分比濃度為0.5% ；A液、B液、C液等體積混合，混合液中沃尼妙林、恩諾沙星、二甲胺四環(huán)素質(zhì)量比為—種用以上試劑清除支原體污染的方法，選用HELA細(xì)胞的培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)，其具體步驟如下a、支原體檢測(cè)(I)HELA細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基以DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBC0公司生產(chǎn))加入10% FBS(國(guó)產(chǎn)四季清太牛，無(wú)支原體級(jí))配成完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C，5% C02,20% 02，相對(duì)濕度100%的無(wú)菌溫箱；按蛋白酶K法快速提取基因組DNA ；(2)將步驟(1)中提取的基因組DNA放入待測(cè)試管，然后向試管中加入經(jīng)標(biāo)記的支原體檢測(cè)引物，使用PCR方法擴(kuò)增，所述檢測(cè)引物為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無(wú)膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，觀察結(jié)果如圖2，圖2中，4，5，6泳道為HELA細(xì)胞檢測(cè)條帶，第4道所示為萊氏無(wú)膽甾原體(A. Laidlawii)產(chǎn)物，第5道和第6到所示為混合污染的支原體屬產(chǎn)物；G) PCR產(chǎn)物切膠回收后，直接連接PMD19T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)室制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5ci株，涂板37°C培養(yǎng)過(guò)夜挑克隆，小提質(zhì)粒酶切鑒定后送測(cè)序；
(5)檢測(cè)結(jié)果，測(cè)序證實(shí)HELA細(xì)胞為混合污染，既有血清來(lái)源的無(wú)膽留原體也有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源的支原體多種；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12Η20，0· 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過(guò)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用(2)分別配置A液、B液、C液；取1. 5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS 溶液中，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為1.5%的A液，分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)恩諾沙星溶于IOOmlO. 01MPBS，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌制成恩諾沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為1 %的B液， 分裝，-20°C凍存；取二甲胺四環(huán)素0. 5g(500mg)溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng) 0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌配制成二甲胺四環(huán)素質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5%的C液， 分裝，-20°C凍存。C、支原體清除將配置好的A液、B液、C液等體積混合制成清除試劑，其混合后泰妙菌素、恩諾沙星和二甲胺四環(huán)素的質(zhì)量比為3 2 1。將配置好的清除試劑加入HELA細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中稀釋333倍，稀釋后泰妙菌素、恩諾沙星和二甲胺四環(huán)素的質(zhì)量-體積比分別約為 15ug/ml、10ug/ml和5ug/ml。每24h換液一次，換液時(shí)用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，處理 2周，待治療過(guò)程中HELA細(xì)胞長(zhǎng)滿至瓶底面積的60% -80%時(shí)，胰酶消化傳代；傳代時(shí)收集消化下來(lái)的細(xì)胞，特別注意需吹散成單細(xì)胞懸液，然后用離心洗滌的方法傳代。(分散的支原體沉降系數(shù)小，常規(guī)的轉(zhuǎn)速下可以留在上清中棄去，減少培養(yǎng)物中的荷菌量，故轉(zhuǎn)速宜低速500-800r/min)棄去離心后的培養(yǎng)基后，以0. OlMPBS重懸細(xì)胞沉淀，吹勻后再次離心，重復(fù)至少1次，洗滌后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新瓶培養(yǎng)(舊瓶棄去)。經(jīng)上述處理程序后的HELA細(xì)胞恢復(fù)快速生長(zhǎng)，細(xì)胞周期約Mh，故需頻繁傳代，同上述方法傳代，換液交替處理，至首次用藥處理的第14天終止。取上述ABC液清除試劑處理后的HELA細(xì)胞，再次進(jìn)行PCR檢測(cè)。未再檢測(cè)出陽(yáng)性片段。將污染的未經(jīng)清除試劑處理的HELA細(xì)胞做hoechst33258染料染色(染料使用濃度300nM)，熒光顯微鏡觀察照相，如圖1中的照片C，同時(shí)將處理后的HELA細(xì)胞做 hoechst33258染料(300nM)染色觀察照相，如圖1中的照片C’。將HELA細(xì)胞的治療前的熒光照片C和治療后的熒光照片C’作為對(duì)比，其結(jié)果為 治療前白色箭頭示細(xì)胞核外藍(lán)染小點(diǎn)，為支原體陽(yáng)性染色，圖片中橫線為20um;治療后視野背景清晰，無(wú)核外藍(lán)染小點(diǎn)，支原體染色陰性。實(shí)施例四本發(fā)明通過(guò)本實(shí)施例對(duì)于A液、B液、C液?jiǎn)为?dú)效力進(jìn)行檢測(cè)，其具體操作如下(1) 分別配置A液、B液、C液；取1.5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過(guò)濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為1. 5%的A液， 分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)恩諾沙星溶于IOOmlO. 01MPBS，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過(guò)濾除菌制成恩諾沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為的B液，分裝，-20°C凍存；取二甲胺四環(huán)素0. 5g(500mg)溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過(guò)濾除菌配制成二甲胺四環(huán)素質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5%的C液，分裝，-20°C凍存。
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(2)將實(shí)施例二中污染單一種支原體的SH-SY細(xì)胞換用新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)將A、B、C液分別設(shè)4個(gè)2倍稀釋的濃度梯度，加入完全培養(yǎng)基，即終濃度分別為，A 液 16、8、4、2ug/ml ；B 液 16、8、4、2ug/ml ；C 液 8、4、2、lug/ml。(4)將上述污染的細(xì)胞接種入12孔板，依濃度梯度分別用藥物處理，處理組合方式見(jiàn)附圖4;(5)處理一周后，如實(shí)施例1方法提取基因組DNA，用于PCR檢測(cè)；(6)將測(cè)序構(gòu)建的PMD19T載體質(zhì)粒做10倍的梯度稀釋；(7)用檢測(cè)引物做熒光定量PCR檢測(cè)支原體模版的拷貝數(shù)，其檢測(cè)引物為(正向引物 5，GGAGCTGGTAATGCCCAAAGT 3，反向引物5，ACGTTCTCGTAGGGATACCTTG3，)(8)采用絕對(duì)定量法絕對(duì)定量以質(zhì)粒測(cè)濃度后作為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍梯度稀釋，共6 個(gè)梯度，根據(jù)插入片段后質(zhì)粒分子量算出質(zhì)粒模板mol濃度，再換算成實(shí)際模板分子數(shù)，根據(jù)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖幻計(jì)算待測(cè)樣品的實(shí)際模板分子數(shù)，數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果見(jiàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表1。表權(quán)利要求
1.一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于所述試劑由A液、B液等體積混合或A液、B液、C液等體積混合而成，其中A液由半合成截短側(cè)耳素衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5%-1.5% ；B液由喹諾酮類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中喹諾酮類衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5% -1.5% ；C液由四環(huán)素類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 25% -0. 75% ；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述A液、B液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2;所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述半合成截短側(cè)耳素衍生物選用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述喹諾酮類衍生物選用抗生素恩諾沙星或麻保沙星或單諾沙星。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述四環(huán)素類衍生物選用多西環(huán)素或二甲胺四環(huán)素。
6.一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于包括以下步驟a、支原體檢測(cè)(1)提取細(xì)胞培養(yǎng)物中基因組DNA；(2)將步驟(1)中提取的基因組DNA放入待測(cè)試管，使用設(shè)計(jì)的支原體檢測(cè)簡(jiǎn)并引物， 使用PCR方法擴(kuò)增提取的基因組DNA目的片段，所述檢測(cè)引物為支原體屬正向引物 5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物 5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3‘無(wú)膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠上樣電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，根據(jù)產(chǎn)物片段判斷支原體種類；b、清除劑配置(1)取8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12Η20，0· 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過(guò)121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用；(2)取半合成截短側(cè)耳素衍生物溶于0.OlMPBS配制成半合成截短側(cè)耳素衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5%-1.5%的A液，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過(guò)濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；取喹諾酮類衍生物溶于0. OlMPBS配制成喹諾酮類衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5%的B液，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過(guò)濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；取四環(huán)素類衍生物溶于0. OlMPBS配制成四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 25% -0. 75%的C液，在超靜臺(tái)內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過(guò)濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；C、支原體清除步驟A中所檢測(cè)出來(lái)的支原體種類為同屬支原體，將配置好的A液、B液等體積混合， 然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋到一定濃度，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的溫度為37°C、 5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過(guò)程中，每24h換液一次，換液時(shí)用0. OlMPBS清洗培養(yǎng)容器；步驟A中所檢測(cè)出來(lái)的支原體種類為不同屬的混合支原體，A液、B液、C液等體積混合制成清除試劑，然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋一定濃度，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為溫度為37°C、5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過(guò)程中，每24h換液一次，換液時(shí)用 0. OlMPBS清洗培養(yǎng)容器。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于在步驟a中，觀察成像系統(tǒng)，如果觀察到結(jié)果中的PCR產(chǎn)物片段單一，則直接純化PCR產(chǎn)物后測(cè)序，檢測(cè)出支原體的種類；如果PCR產(chǎn)物片段為混合污染，多個(gè)條帶陽(yáng)性，則將陽(yáng)性片段克隆入T載體，挑取單克隆后測(cè)序，檢測(cè)出支原體的種類。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于所述A液、B液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物和喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2;所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑及其使用方法。所述試劑由A液、B液等體積混合或A液、B液、C液等體積混合而成，其中A液由半合成截短側(cè)耳素衍生物和0.01MPBS混合，混合后溶質(zhì)的質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5％-1.5％；B液由喹諾酮類衍生物和0.01MPBS混合，混合溶質(zhì)的質(zhì)量-體積百分比濃為0.5％-1.5％；C液由四環(huán)素類衍生物和0.01MPBS混合，混合后溶質(zhì)的質(zhì)量-體積百分比濃度為0.25％-0.75％。使用本發(fā)明試劑和方法，污染不嚴(yán)重，可在一周內(nèi)顯效。經(jīng)治處理的污染細(xì)胞，治療周期完成后，細(xì)胞間無(wú)黑點(diǎn)，細(xì)胞生長(zhǎng)周期回復(fù)正常，細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)團(tuán)聚生長(zhǎng)及拉網(wǎng)現(xiàn)象。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102409019SQ20111017139
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者胡曉鵬 申請(qǐng)人:胡曉鵬