專利名稱：一種hk97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學基因工程領域，具體涉及一種HK97噬菌體病毒樣顆粒蛋白的嵌合體的構建及其純化，以及在生物免疫靶向治療中的作用。
背景技術：
針對慢性疾病的治療性疫苗是目前疫苗研究的熱點之一，這些疾病包括慢性病毒感染、過敏性疾病、腫瘤、糖尿病、高血壓和阿爾茨海默病等。與普通預防性疫苗不同的是治療性疫苗針對的是自身抗原或外來免疫耐受抗原，因此，治療性疫苗要發(fā)揮治療作用必須首先打破免疫耐受，產生針對特定抗原的自身抗體或自身反應T細胞。由于治療性疫苗所針對的靶抗原一般是短肽，抗原性較弱，必須與合適的載體結合后，在免疫佐劑的幫助下才能發(fā)揮作用，因此，選擇合適的載體及佐劑往往是治療性疫苗成功的關鍵。目前常用的載體如KLH、破傷風類毒素等，效力一般不強，必須使用佐劑，而常用的佐劑如弗氏佐劑雖然效能較強，但不能應用于人體，鋁制佐劑雖然可應用于人體，但免疫效能很弱，而且也存在如腦動脈硬化、鋁鹽局部堆積等不良反應。因此，理想的治療性疫苗載體，應該在與靶抗原結合后，在不應用免疫佐劑的情況下，就能有效打破機體的免疫耐受， 產生高滴度抗體，發(fā)揮治療作用。病毒樣顆粒就是這樣一類理想的疫苗載體。病毒樣顆粒(VLP)是由病毒衣殼蛋白裝配成的不含病毒核酸的空殼結構，具有病毒的外形和免疫原性，可誘導機體產生以體液免疫為主的反應，從而產生針對與之結合的抗體，由于不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒復制增殖的風險。病毒樣顆粒由大量重復結構的衣殼蛋白單體聚合而成，進入體內后可以與特異性B細胞表面的B細胞受體結合并激活B細胞，同時，VLP還可提供外源性T細胞表位而激活輔助性T細胞，從而突破自身免疫耐受。另外每個衣殼蛋白單體一般具有堿性多肽域，如賴氨酸的-NH2，這些堿性多肽域朝向顆粒的外表面，短肽等小分子只要帶有合適的氨基酸基團，如-SH，通過異雙功能交聯(lián)劑就能結合并展示于VLPs表面，刺激機體產生抗體。目前國內外已制備出多種噬菌體病毒樣顆粒，如Qi3噬菌體病毒樣顆粒、人乳頭瘤病毒樣顆粒(朋力、1^2病毒樣顆粒等。瑞士 Cytos公司將Qi3噬菌體病毒樣顆粒為載體研制了一系列治療性疫苗，包括阿爾茨海默病AD疫苗(CAD106)、尼古丁疫苗(NIC002)、過敏性哮喘疫苗(CYT003-QbG10)等，其中其研制的針對血管緊張素II的降壓疫苗(CYTOOe-AngQb)，已完成IIa期臨床實驗，針對過敏性鼻結膜炎研制的疫苗 (CYT003-QbG10)已完成nb期臨床實驗。而比利時葛蘭素史克公司(GSK)研制的已經(jīng)上市的子宮頸癌疫苗Cervarix (TM)的主要疫苗成分就是HPV-16和HPV-18。這些病毒樣顆粒顯示了強大的免疫原性和人使用之后的安全性。迄今為止，HK97噬菌體病毒樣顆粒的研究雖有文獻報道，但是對其嵌合體的研究少見，且作為生物免疫靶向治療載體的用途未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體。
本發(fā)明的第二個目的是HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體在生物免疫靶向治療中的作用。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)HK97噬菌體病毒樣顆粒蛋白嵌合體HII-HK97-P的制備(1)將編碼HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP4基因插入pETDuet-Ι質粒(購自Novagen公司)的多克隆位點上；(2)在編碼HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP5基因的C端添加表達AFHYESQ 短肽的堿基序列，將該GP5基因插入pETDuet-Ι質粒的多克隆位點上，構建嵌合體表達質粒 pETDuet-HK97-P ；(3)將質粒pETDuet-HK97-P轉化至BL21(DE!3)感受態(tài)細菌，IPTG誘導表達病毒樣顆粒嵌合體前體P II-HK97-P ；(4)6% PEG80004°C沉降病毒樣顆粒嵌合體前體PII-HK97-P ；(5)強陰離子交換層析純化所述病毒樣顆粒嵌合體前體ΡΙΙ-ΗΚ97-Ρ ；(6)酸化誘導所述病毒樣顆粒嵌合體前體ΡΙΙ-ΗΚ97-Ρ成熟膨脹為成熟病毒樣顆粒嵌合體ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ ；(7)凝膠層析純化成熟病毒樣顆粒嵌合體ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ。本發(fā)明保藏培養(yǎng)物命名為Escherichia coli BL21 (DE3)/pETDuet-HK97_P，于 2011年6月21日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO :M2011206。本發(fā)明的優(yōu)點UHK97噬菌體病毒樣顆粒GP5蛋白羧基末端可以添加融合1_12個氨基酸而不影響病毒樣顆粒的自我組裝，從而以嵌合體形式將短肽表位直接展示在病毒樣顆粒表面。2、本發(fā)明制備的HK97噬菌體病毒樣顆粒蛋白嵌合體HII-HK97-P可以用于生物免疫靶向治療中。


序列表SEQ ID
因的核苷酸序列。序列表SEQ ID 因的核苷酸序列。序列表SEQ ID 因編碼的氨基酸序列。序列表SEQ ID 因編碼的氨基酸序列。圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定嵌合體表達質粒pETDuet-HK97-P。圖2 :HII-HK97-P病毒樣顆粒的成熟和純化過程。取酸化誘導后的樣品(Omin)、 中和后樣品(5min，10min，30min，60min，airs)進行SDS-PAGE電泳鑒定和純度分析，隨著中和時間的延長，五聚體和六聚體所占比例越來越大。圖3 :HK97-P病毒樣顆粒嵌合體前體ΡΙΙ_ΗΚ97_Ρ和成熟體ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ電鏡圖。 左圖為ΡΙΙ-ΗΚ97-Ρ電鏡圖，右圖為ΗΙΙ-ΗΚ97-Ρ電鏡，后者在形態(tài)結構上相比前體具有更薄
NO 1是本發(fā)明構建ΗΚ97噬菌體病毒樣顆粒嵌合體所用的GP4基 NO 2是本發(fā)明構建ΗΚ97噬菌體病毒樣顆粒嵌合體所用的GP5基 NO 3是本發(fā)明構建ΗΚ97噬菌體病毒樣顆粒嵌合體所用的GP4基 NO 4是本發(fā)明構建ΗΚ97噬菌體病毒樣顆粒嵌合體所用的GP5基的外殼，直徑由^nm擴大至約66nm。圖4 :HII-HK97-P疫苗免疫正常SD雄性大鼠后抗Pl短肽抗體滴度。第7、21、35、 45天免疫大鼠的抗Pl短肽抗體滴度的測定(血清均以1 1000稀釋)。
具體實施例方式以下實施案例在于進一步說明本發(fā)明，但不限制其范圍。實施案例1嵌合體表達質粒pETDuet-HK97-P的構建用引物5，-CCATGGCTGAAATCGTAAAAACGCTGT-3，；5，-CCGGAATTCTTATTTACCTAAGTT AGAAGGG-3’，通過PCR擴增得到編碼HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP4基因，大小為 678bp。用引物 5，-CCATATGTCTGAACTCGCTCTCATTC-3，； 5，-CTCGAGTCAACGAGATTCGTAGTGG-3 ’， 通過PCR擴增得到編碼HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP5基因，大小為1158bp。將上述得到的GP5基因片段和GP4基因片段插入pETDuet-Ι質粒(購自Novagen 公司)的兩個多克隆位點，構建嵌合體表達質粒pETDuet-HK97-P，酶切鑒定其分子量大小 (圖 1)。實施案例2 HII-HK97-P病毒樣顆粒的成熟及其純化(1)將質粒pETDuet-HK97-P轉化至BL21 (DE3)感受態(tài)細菌，挑取單個菌落于20ml 液體培養(yǎng)基中37°C擴增16小時，取該菌液Iml加入IL液體培養(yǎng)基中，37°C擴增數(shù)小時至培養(yǎng)基的OD6tltlnm約為0. 6，加入IPTG QOul，0. 2g/ml)誘導表達病毒樣顆粒嵌合體前體 PII-HK97-P。0)4小時后裂解細菌離心取上清于6% PEG80004°C沉降病毒樣顆粒嵌合體前體 PII-HK97-P過夜，PII-HK97-P經(jīng)UnoQ強陰離子交換層析 QOmM Tris-HCl, IM NaCl)純化。(3)陰離子交換純化后對PII-HK97-P進行誘導成熟將30mg/ml ΡΙΙ_ΗΚ97_Ρ病毒樣顆粒嵌合體前體1. 5ml稀釋于150ml酸化緩沖液(pH3. 8，250mM KCl,50mM Citrate)中1 小時，隨后加入1/6體積的中和緩沖液(ρΗ8· 3，IM Tris-HCl)至總體系的pH在7. 0以上， 室溫放置2小時或者更長時間。SDS-PAGE電泳鑒定病毒樣顆粒嵌合體前體、中間體和成熟體(見實施案例3，圖2)。(4)酸化誘導成熟的病毒樣顆粒嵌合體HII-HK97-P經(jīng)凝膠過濾層析純化以達到更高的純度。實施案例3 HII-HK97-P病毒樣顆粒的鑒定取HK97-P病毒樣顆粒嵌合體前體、中間體和成熟體各20ug進行6 % SDS-PAGE電泳(圖幻，并取HK97-P病毒樣顆粒嵌合體前體PII-HK97-P和成熟體HII-HK97-P進行透射電鏡(鎳網(wǎng)，4%醋酸雙氧鈾負染)下的形態(tài)和大小觀測(圖3)。電鏡觀測發(fā)現(xiàn)，HK97-P 病毒樣顆粒嵌合體前體PII-HK97-P是自行組裝的棱形病毒樣顆粒結構，直徑大約Mnm，而成熟體HII-HK97-P在形態(tài)結構上相比前體具有更薄的外殼，直徑稍微擴大，約為66nm。實施案例4 HII-HK97-P嵌合體疫苗免疫大鼠后抗P短肽抗體的產生清潔級SD大鼠10只隨機分為兩組，每組5只，飼養(yǎng)于清潔級動物房，采用iai/iai 光照及非限制性普通飲食。取HII-HK97-P疫苗免疫大鼠采用背部皮下3-4點注射疫苗的方案，400ul/只，疫苗劑量約300ug/只，于初次免疫后間隔兩周加強2次。0. 3%戊二醛交聯(lián)劑耦聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)與短肽P，以此耦聯(lián)物(IOug/孔)包被96孔ELISA板。于7、21、35、45天取大鼠鼠尾靜脈血使用ELISA進行抗P短肽抗體滴度的測定(血清均以1 1000稀釋)(圖4)。
權利要求
1.一種HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體，其特征在于該病毒樣顆粒的嵌合體是由構建的嵌合體表達質粒pETDuet-HK97-P經(jīng)過誘導表達、純化和酸化成熟而得到的。
2.如權利要求1所述的HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體，其中所述嵌合體表達質粒 pETDuet-HK97-P中含有HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP4基因。
3.如權利要求1所述的HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體，其中所述嵌合體表達質粒 pETDuet-HK97-P中含有HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP5基因，該GP5基因的C端添加了表達AFHYESQ短肽的堿基序列。
4.如權利要求3所述的HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體，其中所述AFHYESQ短肽的堿基序列是 5，-GCGTTCCACTACGAATCTCGT-3，。
5.如權利要求1所述的HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體，其作為生物靶向治療載體的用途。
6.如權利要求1所述的HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體，其中所述嵌合體表達質粒 pETDuet-HK97-P保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO :M2011206，保藏命名為 Escherichia coli BL21 (DE3)/pETDuet-HK97_P。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體，以及該嵌合體在生物免疫靶向治療中的作用。通過在HK97噬菌體病毒樣顆粒的GP5基因的C端添加表達AFHYESQ短肽的堿基序列，將該GP5基因和編碼HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP4基因插入到pETDuet-1質粒上，構建了HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體表達質粒，將表達質粒誘導表達后的前體進行純化、酸化誘導成成熟的HK97噬菌體病毒樣顆粒嵌合體。并將HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體作為生物靶向治療載體，制備成疫苗，發(fā)揮生物免疫靶向治療作用。
文檔編號C12N7/02GK102337251SQ201110171730
公開日2012年2月1日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權日2011年6月24日
發(fā)明者周子華, 廖玉華, 楊仕俊, 王敏, 邱志華, 陳芬, 陳霄 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院