專利名稱：固態(tài)發(fā)酵矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白制備抗氧化多肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白制備抗氧化多肽的方法，屬于水產(chǎn)品加工及微生物生物技術交叉領域。
背景技術：
我國是水產(chǎn)大國，魚類資源豐富，但加工和綜合利用還比較落后，大多以冷凍冷藏、罐頭食品及飼料魚粉等傳統(tǒng)加工為主，加工程度低，加工方式傳統(tǒng)，深加工生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品鮮有報道。蛋白質水解后產(chǎn)生易于吸收、溶解性好、乳化性好，并具有多種生理活性的多肽，改善了蛋白質的功能特性，提高了蛋白質的營養(yǎng)及利用價值。蛋白來源不同，蛋白水解多肽的結構和功能各有差異。已經(jīng)進行研究的蛋白質有酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、魚蛋白、玉米蛋白和雞蛋蛋白。魚蛋白營養(yǎng)豐富、原料充足，是進行蛋白質水解多肽制備的首選蛋白質。目前國內外已對包括泥鰍、狗鱈、沙丁魚、太平洋牙鱈、大西洋鮭魚等多種魚的蛋白質的酶解特性進行了研究。將魚蛋白水解，可以產(chǎn)生具有包括降血壓、抗菌、清除體內自由基、抗氧化、降低膽固醇等多種生理活性的活性多肽。目前報道的包括魚類蛋白水解基本上都是直接添加成品堿性蛋白酶對蛋白質進行水解。成品堿性蛋白酶價格較昂貴，增加了生產(chǎn)成本。矛尾刺蝦虎魚(Acanthogobius hasta)又名長身鯊，屬蝦虎魚科，矛尾刺蝦虎魚種，為海水產(chǎn)大型蝦虎魚，分布于太平洋西北部、中國、日本和韓國。目前國內外尚無利用安全菌株米曲霉Aspergillus oryzae固態(tài)發(fā)酵制備魚蛋白水解多肽的研究，更沒有關于利用矛尾刺蝦虎魚固態(tài)發(fā)酵制備魚蛋白水解多肽的文獻報導。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服目前魚蛋白水解多肽制備過程中的不足，提供一種新的工藝簡單、可操作性強的通過米曲霉Aspergillus oryzae固態(tài)發(fā)酵的方式制備矛尾刺蝦虎魚蛋白水解抗氧化多肽的方法。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種微生物固態(tài)發(fā)酵矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白制備抗氧化多肽的方法，其特點是，它采用固態(tài)發(fā)酵形式，其具體步驟如下(1)矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白的制備取新鮮矛尾刺蝦虎魚，除去魚鱗、魚皮、內臟，清洗干凈，勻漿機勻漿，勻漿液80°C水浴保溫20min，使內源酶失活；10°C，SOOOg離心 20min，除去上層油脂后，置80°C烘干，得干燥肌肉蛋白；(2)制備發(fā)酵基質將干燥肌肉蛋白和直徑為1. 0-1. 5mm蛭石按照重量比60 40 混合攪拌混勻，用pH 7. 5，0. 2M的磷酸緩沖液調節(jié)含水率至55 %，得發(fā)酵基質，按V/V 50 % 將發(fā)酵基質裝于三角瓶中115°C滅菌20min備用；(3)微生物固態(tài)發(fā)酵將米曲霉Aspergillus oryzae菌種在PDA斜面培養(yǎng)基上活化，從活化后的菌種斜面上挑取孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基，300C、120rpm培養(yǎng)至菌體濃度達到107CFU/ml，得種子液；按V/W 5% (發(fā)酵基質干重計算)接種量將種子液接種于滅菌過的發(fā)酵基質，30°C，發(fā)酵4d;(4)分離發(fā)酵結束后，加蒸餾水浸泡、攪拌、過濾，濾清液即為抗氧化多肽，或者將濾清液濃縮干燥制粉，得抗氧化多肽粉。馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)可以按以下方法配置馬鈴薯200g(切片水煮30min，過濾取汁)、蔗糖20. 0g、蒸餾水lOOOmL，pH值自然。固體培養(yǎng)基另加1. 5 2g/100mL的瓊脂。米曲霉Aspergillus oryzae為美國食品藥品監(jiān)督局FDA1989年公布了公認為 Generally Recognized as &ife菌株，或GRAS菌株，是公認的安全微生物菌種。本發(fā)明所述的可以選用購自中科院微生物所的米曲霉Aspergillus oryzae (菌株號AS3. 951)。以下是發(fā)明人所做的關于本發(fā)明方法的技術方案或參數(shù)的優(yōu)選試驗及其結果。1、測定樣品的制備發(fā)酵一定時間后，Ig固態(tài)發(fā)酵基質加入IOml蒸餾水，30°C， 180rpm震蕩30min ；4 °C，20000g離心IOmin，上清液過0. 22 μ m濾膜后用蒸餾水稀釋為 10mg/mL的多肽液作為樣品進行測定。2、接種量對蛋白酶和多肽的影響按照本發(fā)明方法步驟(2)制備好發(fā)酵基質后，按照V/W 5^,10^,15%接種量將種子液接種到發(fā)酵基質后300C發(fā)酵培養(yǎng)，分別在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h 取樣，測定蛋白酶活性和 DPPH 清除率(1，l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) α, α-二苯基-β-苦基胼基游離基清除率)。結果如圖1，接種量變化對蛋白酶活性和 DPPH清除率影響不顯著，考慮到成本的原因，接種量選擇5%。3、蛭石含量對蛋白酶和多肽的影響直徑1.0-1. 5mm蛭石和干燥肌肉蛋白樣品按照W/W 50 50,40 60,30 70， 20 80混勻，即蛭石含量分別為50%,40%,30%,20%o其它條件同“2”，分別在0，12，24， 36，48，60，72，84，96，108，120h取樣，測定蛋白酶活性和DPPH清除率。結果如圖2，蛭石含量為40%時蛋白酶產(chǎn)量最高，且DPPH清除率最早(84h)達到最大值，因此選定蛭石含量為 40%。4、水分含量對蛋白酶和多肽的影響直徑1. 0-1. 5mm蛭石和干燥肌肉蛋白樣品混勻，蛭石含量為40 %，接種量選擇 5%。用pH 7. 5，0. 2M的磷酸緩沖液調節(jié)含水率分別為45%，55%和65%。其它條件同(5)， 分別在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取樣，測定蛋白酶活性和DPPH清除率。結果如圖3，水分含量為55%時蛋白酶產(chǎn)量最高，且DPPH清除率最早(84h)達到最大值，因此選定水分含量為陽％。5、發(fā)酵起始pH對蛋白酶和多肽的影響直徑1. 0-1. 5mm蛭石和干燥肌肉蛋白樣品混勻，蛭石含量為40 %，接種量選擇 5%。用pH 6. 5，pH 7. 0，pH 7. 5，pH 8. 0，0. 2M的磷酸緩沖液調節(jié)含水率為55%。其它條件同“2”，分別在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取樣，測定蛋白酶活性和DPPH清除率。結果如圖4，雖然在pH7.0時蛋白酶的產(chǎn)量最高，但在pH7. 5時多肽的DPPH清除率最高，因此選定PH為7. 5。6、發(fā)酵溫度對蛋白酶和多肽的影響直徑1. 0-1. 5mm蛭石和干燥肌肉蛋白樣品混勻，蛭石含量為40 %，接種量選擇 5%。pH 7. 5，含水率為55%。分別在沈1、281、301、321進行發(fā)酵，其它條件同(5)，分
4別在0，12，24，36,48,60, 72,84,96,108，120h取樣，測定蛋白酶活性和DPPH清除率。結果如圖5，在溫度為30°C發(fā)酵時，蛋白酶產(chǎn)量最高，產(chǎn)生的DPPH清除率也最高，因此選定發(fā)酵溫度為30°C。7、不同發(fā)酵時間對蛋白酶活性、平均肽鏈長度、蛋白水解度和DPPH清除率的影響綜合考慮各發(fā)酵因素對蛋白酶及多肽的影響，選取最佳發(fā)酵條件為直徑 1. 0-1. 5mm蛭石，蛭石含量為40 %，接種量選擇5 %，發(fā)酵pH 7. 5，含水率為55 %，發(fā)酵溫度為30 0C ο分別在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120h取樣，測定蛋白酶活性、水解度 (hydrolysis degree, HD) (Taylor et al. , 1957)、平均月太鏈長度(the average peptide length, APL) (Netto et al. , 1998)和DPPH清除率，結果如圖6。隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶產(chǎn)量增加，在7 達到最高；蛋白水解度逐漸增加，平均肽鏈長度逐漸降低。平均鏈長對DPPH清除率影響顯著，發(fā)酵時間為96h時，平均肽鏈長度為8，此時DPPH清除率最高，達到68.5%。因此選擇發(fā)酵時間為96h。本發(fā)明利用米曲霉Aspergillus oryzae發(fā)酵矛尾刺蝦虎魚蛋白，菌株分泌的蛋白酶將矛尾刺蝦虎魚蛋白水解為蛋白水解液。它避免了直接添加純化商品蛋白酶，降低了成本；另外，米曲霉Aspergillus oryzae固體發(fā)酵不需要大型發(fā)酵設備，單位體積的產(chǎn)量較液體發(fā)酵高，且產(chǎn)蛋白酶量高，速度快，利于蛋白水解，易于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明方法工藝參數(shù)設計合理，可操作性強，無需使用成品蛋白酶，成本低，能夠充分利用矛尾刺蝦虎魚資源， 具有良好的潛在經(jīng)濟效應。


圖1為接種量對蛋白酶和多肽的影響圖；圖中■，·，▲分別為接種量為5%， 10%，15%時蛋白酶活性；□，〇，Δ分別為接種量為5%，10%，15%時DPPH清除率；圖2為蛭石含量對蛋白酶和多肽的影響圖；圖中_,·,▲, ▼分別為蛭石量為 50%，40%，30%，20%時蛋白酶活性；□，〇，Δ，▽分別為蛭石量為50%，40%，30%，20% 時DPPH清除率；圖3為水分含量對蛋白酶和多肽的影響圖；·， ，▲分別為接種量為45%，55%， 65%時蛋白酶活性；□，〇，Δ分別為接種量為45%，55%，65%時DPPH清除率；圖4為發(fā)酵起始ρΗ對蛋白酶和多肽的影響圖；圖中■，·，▲, ▼分別為PH為 6. 5,7,7. 5,8時蛋白酶活性；□，〇，Δ，▽分別為ρΗ為6. 5,7,7. 5，8時DPPH清除率；圖5為發(fā)酵溫度對蛋白酶和多肽的影響圖；■，·，▲，▼分別為發(fā)酵溫度為 ^°C、28°C、30°C、32°C時蛋白酶活性；□，〇，Δ，▽分別為發(fā)酵溫度為、28°C、30°C、 32 °C時DPPH清除率；圖6為發(fā)酵時間對蛋白酶活性、水解度、平均肽鏈長度、DPPH清除率的影響圖；圖中■，蛋白酶活性；·平均肽鏈長度；▲，水解度；〇，DPPH清除率。
具體實施例方式以下進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發(fā)明，而不構成對其權利的限制。
實施例1，一種微生物固態(tài)發(fā)酵矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白制備抗氧化多肽的方法，它采用固態(tài)發(fā)酵形式，其具體步驟如下(1)矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白的制備取新鮮矛尾刺蝦虎魚，除去魚鱗、魚皮、內臟，清洗干凈，勻漿機勻漿，勻漿液80°C水浴保溫20min，使內源酶失活；10°C，SOOOg離心 20min，除去上層油脂后，置80°C烘干，得干燥肌肉蛋白；(2)制備發(fā)酵基質將干燥肌肉蛋白和直徑為1. 0-1. 5mm蛭石按照重量比60 40 混合攪拌混勻，用pH 7. 5，0. 2M的磷酸緩沖液調節(jié)含水率至55 %，得發(fā)酵基質，按V/V 50 % 將發(fā)酵基質裝于三角瓶中115°C滅菌20min備用；(3)微生物固態(tài)發(fā)酵將米曲霉Aspergillus oryzae菌種在PDA斜面培養(yǎng)基上活化，從活化后的菌種斜面上挑取孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基，300C、120rpm培養(yǎng)至菌體濃度達到107CFU/ml，得種子液；按V/W 5%接種量將種子液接種于滅菌過的發(fā)酵基質，30°C，發(fā)酵4d;(4)分離發(fā)酵結束后，加蒸餾水浸泡、攪拌、過濾，濾清液即為抗氧化多肽，或者將濾清液濃縮干燥制粉，得抗氧化多肽粉。為了確定實施例方法制得的水解多肽的抗氧化能力，將制得的濃縮至10mg/ml 的多肽液分別進行DPPH清除率、亞油酸脂質過氧化體系中的抗氧化能力和金屬絡合能力的測定，結果表明10mg/ml的多肽液的DPPH清除率、亞油酸脂質過氧化體系中的抗氧化能力和金屬絡合能力分別達到68. 5%，71. 6%和88. 3%。1、蛋白酶活性的測定采用國標SB/T 10317-1999進行蛋白酶活性測定，酶活力定義為在測定條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μ g酪氨酸的酶量(μ g/(mL -min))為1個酶活力單位⑶。2、DPPH測定抗氧化肽的自由基清除能力取:3ml 60 μ M溶于乙醇的DPPH，加入500 μ 1待測樣品，混勻后室溫避光靜止 60min，測定517nm下光吸收值。用500 μ 1 95%的乙醇替代待測樣品作為對照。對照和樣品的光吸收值分別記為Ac和As。根據(jù)公式(1)計算DPPH清除率。
清除率(％) = ^^χ οο(1)
Ac3、亞油酸脂質過氧化體系中的抗氧化能力試管中加入1. 5ml 0. IM pH7. O磷酸鈉緩沖液和1. 5mM亞麻酸的乙醇溶液，混合均勻后，加入2. Oml pH7. O待測樣品。采用2. OmMBHTO，6-二叔丁基對甲酚)的甲醇溶液作對照。60°C避光保溫48h。硫氰化鐵法測定保溫前后反應液的過氧化脂質。取100 μ 1保溫前后反應液加入4.5ml 75%乙醇，100 μ 1 30%硫氰酸銨水溶液，200 μ 1 1.0Ν鹽酸，100 μ 1 溶解于3. 5%鹽酸中的20mM氯化亞鐵溶液。5min后測定500nm光吸收值，保溫前后光吸收值分別記為Ac和As。根據(jù)公式(2)計算DPPH清除率。
抑制率(％) = ^Z^xl00(2)
Ac4、金屬絡合能力測定采用鐵離子絡合法測定多肽液的金屬絡合能力。取800μ 1待測樣品，加入10μ 12mM FeCl2溶液，20 μ 1 5mM菲洛嗪，混勻后室溫下靜止lOmin，測定526nm光吸收值。以去離子水為對照。樣品和對照光吸收值分別記為As和Ac。根據(jù)公式(3)計算DPPH清除率。
金屬絡合能力(％) = (l-f )xioo(3)
Ac
權利要求
1. 一種微生物固態(tài)發(fā)酵矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白制備抗氧化多肽的方法，其特征在于， 它采用固態(tài)發(fā)酵形式，其具體步驟如下(1)矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白的制備取新鮮矛尾刺蝦虎魚，除去魚鱗、魚皮、內臟，清洗干凈，勻漿機勻漿，勻漿液80°c水浴保溫20min，使內源酶失活；10°C，8000g離心20min，除去上層油脂后，置80°C烘干，得干燥肌肉蛋白；(2)制備發(fā)酵基質將干燥肌肉蛋白和直徑為1.0-1.5 mm蛭石按照重量比60:40混合攪拌混勻，用PH 7.5，0.2M的磷酸緩沖液調節(jié)含水率至55%，得發(fā)酵基質，按V/V 50%將發(fā)酵基質裝于三角瓶中115°C滅菌20min備用；(3)微生物固態(tài)發(fā)酵將米曲霉As/^r^/BmOr7^e菌種在PDA斜面培養(yǎng)基上活化，從活化后的菌種斜面上挑取孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基，300C、120rpm培養(yǎng)至菌體濃度達到 107CFU/ml，得種子液；按V/W 5%接種量將種子液接種于滅菌過的發(fā)酵基質，30°C，發(fā)酵4d ；(4)分離發(fā)酵結束后，加蒸餾水浸泡、攪拌、過濾，濾清液即為抗氧化多肽，或者將濾清液濃縮干燥制粉，得抗氧化多肽粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白制備抗氧化多肽的方法，屬于水產(chǎn)品加工及微生物生物技術交叉領域。本發(fā)明以矛尾刺蝦虎魚肌肉為原料，采用勻漿機將新鮮魚肌肉勻漿，80℃水浴保溫20min，10℃，8000g離心20min，除去上層油脂，80℃烘干。干燥樣品與蛭石混合均勻，調整好水分含量、pH，接種米曲霉進行固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵結束后，加蒸餾水浸泡、攪拌、過濾，濾液濃縮后可得肌肉多肽。本發(fā)明提供的矛尾刺蝦虎魚肌肉蛋白多肽有良好的抗氧化功能，本發(fā)明方法工藝參數(shù)設計合理，可操作性強，無需使用成品蛋白酶，成本低，能夠充分利用矛尾刺蝦虎魚資源，具有良好的潛在經(jīng)濟效應。
文檔編號C12R1/69GK102251002SQ201110171920
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權日2011年6月23日
發(fā)明者劉姝, 呂明生, 房耀維, 焦豫良, 王淑軍 申請人:淮海工學院