專利名稱：成品煙煙絲總dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙絲技術(shù)領(lǐng)域，尤其是成品煙煙絲總DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
在實際生產(chǎn)中，由于年景的不同，煙葉會受到氣候等因素的影響，某些地區(qū)的煙葉質(zhì)量會發(fā)生波動，造成卷煙質(zhì)量也發(fā)生波動。卷煙企業(yè)就會根據(jù)煙葉變化情況對葉組配方進行調(diào)整，即進行煙葉臨時替代。在煙葉臨時替代過程中，煙葉品種的變化對卷煙感官品質(zhì)有重要影響。通過提取得到卷煙煙絲中DNA，建立卷煙產(chǎn)品的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，將卷煙配方 DNA指紋圖譜與卷煙感官評吸相結(jié)合，能對卷煙市場產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢查提供更科學(xué)的依據(jù)， 如通過對卷煙煙絲DNA的分析，能從根本上鑒別出卷煙的真?zhèn)危痪頍熥鳛橐环N轉(zhuǎn)基因的模式植物，為杜絕進出口卷煙中的轉(zhuǎn)基因成分，對卷煙進行出口前檢測是必不可少的工作環(huán)節(jié)。因此，研究一種簡單、快速的卷煙煙絲中DNA的提取方法對卷煙質(zhì)量的監(jiān)控、卷煙真?zhèn)舞b別和卷煙轉(zhuǎn)基因檢測都有重要意義。然而卷煙是一種深加工食品，而加工程度越深， DNA的提取難度就越大。成品卷煙煙絲已經(jīng)不能提取得到完整的基因組DNA。因為成品煙絲與新鮮煙葉的不同在于其經(jīng)過初烤、復(fù)烤、切絲、烘絲等工序中的高溫、高壓、高濕、機械加工剪切以及加香加料后制成煙絲，不但增加了 DNA提取過程中的污染物，還使基因組DNA 嚴重降解，成為小于IOOObp的小片段。由于煙草植物中次生代謝產(chǎn)物多酚類化合物可介導(dǎo) DNA降解，而多糖的污染也是影響煙草DNA純度最常見的問題。朱生偉等利用改良后SDS法提取得到新鮮煙葉中可用煙草育種，較純凈、高產(chǎn)率、 大分子量的基因組DNA?？苕嗟韧ㄟ^對比研究表明二次選擇法得到的高分子量DNA總量更高，同時二次選擇法得到的純度更高，可以用于制備煙草BAC文庫。任如意等以改良CTAB法提取復(fù)烤煙葉DNA，經(jīng)U-3000紫外分光光度計測定，所獲 DNA呈典型的吸收曲線，且0擬60/0D280在1. 7 1. 9之間；對煙草葉綠體不編碼序列進行 PCR擴增，獲得理想條帶。國際煙草科學(xué)研究中心介紹了提取新鮮煙葉基因組DNA的堿裂解法、改良后的 CTAB法和酚/氯仿抽提法，同時指出，煙絲DNA的提取還需進一步研究。國內(nèi)外關(guān)于煙草DNA的提取技術(shù)研究都是基于新鮮煙葉或者復(fù)烤煙葉，而對成品卷煙煙絲的DNA提取技術(shù)研究，國內(nèi)外鮮見相關(guān)文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對不足，提出一種成品煙煙絲總DNA的提取方法，減少成品煙煙絲中的雜質(zhì)，提高煙絲總DNA的提取效率，便于后續(xù)的成品煙品牌鑒定和轉(zhuǎn)基因檢測等。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種成品煙煙絲總DNA的提取方法，包括以下步驟
①、用65% 80%的乙醇水溶液浸泡成品煙煙絲，室溫下7 9小時；過濾取濾 液，40°C 50°C烘干；②、向步驟①烘干產(chǎn)品中加入2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩沖液，充分混勻， 于 60°C 70°C保溫 20 40min ；③、步驟②反應(yīng)產(chǎn)物降溫至室溫，加入與步驟②提取緩沖液相同體積的氯仿/異 戊醇混合液，混勻后離心，取上清液；④、步驟③上清液中加入用量與步驟②提取緩沖液相同體積的2X十六烷基三乙 基溴化銨提取緩沖液，以及用量與步驟②提取緩沖液相同體積的氯仿/異戊醇混合液，混 勻；離心，取上清液；⑤、向步驟④上清液中加入1 2倍體積的十六烷基三乙基溴化銨沉淀緩沖液，混 勻，靜置；離心，得沉淀物；⑥、向步驟⑤的沉淀物中加入1. 2 1. 5mol/L NaCl溶液，攪拌溶解；離心取上清 液；⑦、向步驟⑥得到的上清液中加入2 4倍體積經(jīng)-20°C _30°C預(yù)冷的無水乙 醇，混勻，靜置；離心，得沉淀物。優(yōu)選的，步驟③、④、⑤、⑥或⑦中離心的條件為12000 15000r/min，10 15min。優(yōu)選的，所述步驟②或④中2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩沖液由下述組分構(gòu)
成
100腿ol/L三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，PH為8.0
2Ommol /L乙ニ胺四乙酸
1.4mmol/LNaCl
2wt %十六坑基三乙基溴化銨
4 Ommo 1 / L p-疏基乙醇。優(yōu)選的，所述步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉淀緩沖液由下述組分構(gòu)成
50匪ol/L三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，pH為8.0
IOmmol /L乙ニ胺四乙酸
Iwt %十六坑基三乙基溴化銨
2Ommot /L 疏基乙醇。優(yōu)選的，步驟②中的2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩沖液為在65°C預(yù)熱過的。優(yōu)選的，步驟①中用的乙醇水溶液為70%。優(yōu)選的，步驟①中浸泡時間為8小吋。優(yōu)選的，步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉淀緩沖液的用量為上清液體積的2倍。優(yōu)選的，步驟⑤中靜置為0.8 2小吋。
優(yōu)選的，步驟⑦中靜置為20°C下靜置30min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明根據(jù)煙絲中的外加香精香料，如單糖等，大部分是水溶性或醇溶性混合物，以及DNA在一定濃度(65% 80%)的乙醇水溶液中溶解度最小，利用乙醇水溶液處理成品煙煙絲，處理掉部分雜質(zhì)，而又不溶出部分煙絲斷面細胞中的DNA。本發(fā)明的提取方法與傳統(tǒng)的十六烷基三乙基溴化銨法(CTAB法)相比，將傳統(tǒng) CTAB法在DNA沉淀時使用的等體積CTAB沉淀緩沖液，增加直至2. 0倍體積CTAB沉淀緩沖液，提高了 DNA的沉淀效率，降低DNA提取難度。


圖1是本發(fā)明實施例1產(chǎn)品的煙絲總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；圖2是本發(fā)明實施例2產(chǎn)品的煙絲總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測
1 為 DNA 標樣；M 為 250bp DNA ladder marker。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對本發(fā)明的保護范圍有任何的限制作用。實施例1從成品煙的煙絲中提取總DNA的方法，包括以下步驟1)將購于鄭州某品牌卷煙一支成品煙的煙絲取出，用70%的乙醇水溶液浸泡煙絲，室溫放置8小時；2)吸出浸泡之后的溶液，40 0C，30分鐘烘干；3)轉(zhuǎn)至研缽中，用液氮冷卻研磨，將煙末分裝置6個1. 5mL離心管中。4)向盛有樣品的1.5ml離心管中，加入750 μ L 65°C預(yù)熱的2XCTAB提取緩沖液， 充分混勻；5)于65°C溫育30min，期間顛倒混勻離心管4_5次；6)冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混勻后，12000r/min離心 IOmin ；7)取上清，加入等體積的2 X CTAB提取緩沖液和氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min 離心IOmin ；8)加入2. 0倍體積CTAB沉淀緩沖液，顛倒混勻后，室溫靜置lh，使沉淀生成；9) 10000r/min 離心 lOmin，棄去上清液；10)沉淀用 800 μ L 1. 2mol/L NaCl 溶液溶解；11) 12000r/min 離心 lOmin，棄不溶物；12)轉(zhuǎn)移上層水相至1. 5mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇(_20°C預(yù)冷)，顛倒混勻后，于20°C下靜置30min ；13) 12000r/min離心20min，小心棄去上清液；14)沉淀溶于40 μ L超純水中，4°C保存?zhèn)溆?。實施?從成品煙的煙絲中提取總DNA的方法，包括以下步驟
1)將購于鄭州某品牌A卷煙一支成品煙的煙絲取出，用70%的乙醇水溶液浸泡煙絲，室溫放置8小時；2)吸出浸泡之后的溶液，40 0C，30分鐘烘干；3)轉(zhuǎn)至研缽中，用液氮冷卻研磨，將煙末分裝置6個1. 5mL離心管中。4)向盛有樣品的1.5ml離心管中，加入750 μ L 65°C預(yù)熱的2XCTAB提取緩沖液， 充分混勻；5)于65°C溫育30min，期間顛倒混勻離心管4_5次；6)冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混勻后，12000r/min離心 IOmin ；7)取上清，加入等體積的2 X CTAB提取緩沖液和氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min 離心IOmin ；8)加入1. 0倍體積CTAB沉淀緩沖液，顛倒混勻后，室溫靜置lh，使沉淀生成；9) 10000r/min 離心 lOmin，棄去上清液；10)沉淀用 800 μ L 1. 2mol/L NaCl 溶液溶解；11) 12000r/min 離心 lOmin，棄不溶物；12)轉(zhuǎn)移上層水相至1. 5mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇(_20°C預(yù)冷)，顛倒混勻后，于20°C下靜置30min ；13) 12000r/min離心20min，小心棄去上清液；14)沉淀溶于40 μ L超純水中，4°C保存?zhèn)溆谩嵤├?和實施例2中，采用相同的某品牌卷煙，不同的是實施例1中DNA沉淀 (步驟8)采用的是2XCTAB沉淀緩沖液。對實施例1和2的產(chǎn)品進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1和2所示。在DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析中，DNA與溴化乙錠結(jié)合后，在紫外透射的情況下顯紅色，瓊脂糖顯淡藍色，但是在文獻、著作中常采用黑白圖片。DAN分子通過具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的瓊脂糖凝膠時會受到阻力，大分子物質(zhì)在泳動時受到的阻力大，因此，在相同時間相同電壓下，DNA片段越大，位移越小，DNA片段越小，位移越大。此外，DNA片段濃度越大，在瓊脂糖凝膠上顯示的亮度越亮。如圖2，在250bp DNA ladder marker條帶中，IOOObp條帶到點樣孔的距離比500bp條帶小。IOOObp條帶DNA片段量為150ng，而500bp條帶DNA片段量為50ng (參照250bp DNA ladder marker使用說明書每次取5 μ L 250bp DNA ladder marker電泳時，每條帶的DNA量為50ng，其中IOOObp 的DNA片段量為150ng，顯示亮帶)，因此IOOObp條帶比500bp條帶亮。本發(fā)明中，提取得到的成品煙煙絲總DNA是大小不一的DNA片段，在瓊脂糖凝膠上顯示白色涂帶。圖1中樣品DNA在IOOObp以下都出現(xiàn)亮帶，說明圖1中樣品DNA最大片段為lOOObp，同理在圖2中樣品DNA最大片段為500bp，且圖1中樣品DNA明顯比圖2中樣品 DNA亮，說明圖1中樣品DNA濃度比圖2中樣品DNA大。 因此，本發(fā)明中采用的2. 0倍體積CTAB沉淀緩沖液，不但能提高DNA的濃度，而且能獲得煙絲中更大片段DNA(IOOObp)。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種成品煙煙絲總DNA的提取方法，包括以下步驟①、用65% 80%的乙醇水溶液浸泡成品煙煙絲，室溫下7 9小時；過濾取濾液， 40°C 50°C烘干；②、向步驟①烘干產(chǎn)品中加入2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩沖液，充分混勻，于 60°C 70°C保溫 20 40min ；③、步驟②反應(yīng)產(chǎn)物降溫至室溫，加入與步驟②提取緩沖液相同體積的氯仿/異戊醇混合液，混勻后離心，取上清液；④、步驟③上清液中加入用量與步驟②提取緩沖液相同體積的2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩沖液，以及用量與步驟②提取緩沖液相同體積的氯仿/異戊醇混合液，混勻 ’離心，取上清液；⑤、向步驟④上清液中加入1 2倍體積的十六烷基三乙基溴化銨沉淀緩沖液，混勻， 靜置；離心，得沉淀物；⑥、向步驟⑤的沉淀物中加入1.2 1. 5mo 1/L NaCl溶液，攪拌溶解；離心取上清液；⑦、向步驟⑥得到的上清液中加入2 4倍體積經(jīng)_20°C -30°C預(yù)冷的無水乙醇，混勻，靜置；離心，得沉淀物。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟③、④、⑤、⑥或⑦中離心的條件為 12000 15000r/min，10 15min。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟②或④中2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩沖液由下述組分構(gòu)成100腿ol/L 三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，PH為8.02Ommol /L 乙二胺四乙酸1.4mmol/L NaCl2wt %十六坑基三乙基溴化銨4 Ommo 1 / L ρ-疏基乙醇。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉淀緩沖液由下述組分構(gòu)成50匪ol/L 三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，pH為8.0IOmmol /L 乙二胺四乙酸Iwt %十六坑基三乙基溴化銨2Ommot /L 疏基乙醇。
5.如權(quán)利要求1或3所述的提取方法，其特征在于步驟②中的2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩沖液為在65°C預(yù)熱過的。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟①中用的乙醇水溶液為70%。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟①中浸泡時間為8小時。
8.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉淀緩沖液的用量為上清液體積的2倍。
9.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟⑤中靜置為0.8 2小時。
10.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟⑦中靜置為20°C下靜置30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種成品煙煙絲總DNA的提取方法，改良了傳統(tǒng)的CTAB法提取DNA方法，事先采用70％乙醇水溶液對樣品的前處理，加大CTAB沉淀緩沖液體積，解決了成品煙煙絲中DNA提取難度大的難題，為各類卷煙的總DNA提取提供了一套穩(wěn)定、完整、可行的方法。本發(fā)明的提取方法提高了DNA的沉淀效率，降低DNA提取難度。
文檔編號C12N15/10GK102286461SQ20111017218
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者于海順, 崔成哲, 樸永革, 李元實, 王春利, 金哲, 馬林 申請人:吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司, 鄭州輕工業(yè)學(xué)院