專利名稱：人胸腔積液中中期因子熒光定量pcr檢測試劑盒的開發(fā)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明揭示中期因子在肺癌引起的惡性胸腔積液中的重要作用，闡明中期因子可以作為惡性胸腔積液的輔助診斷指標(biāo)，以及中期因子的表達(dá)水平在惡性胸腔積液化學(xué)治療中的作用。
背景技術(shù)：
惡性胸腔積液是肺癌的常見臨床表現(xiàn)，其出現(xiàn)常提示預(yù)后不良。目前診斷惡性胸腔積液的標(biāo)準(zhǔn)方法仍然是基于細(xì)胞病理學(xué)檢查。然而，即使重復(fù)的胸腔穿刺取樣可在一定程度上提高病理檢出率，通常情況下該方法診斷的敏感性只有50% -70%。在細(xì)胞學(xué)診斷陰性的情況下，隨機(jī)胸膜活檢在約7%的伴發(fā)胸水的病人中可提高其檢出率，然而卻有很高的手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥的危險(xiǎn)，難以得到廣泛應(yīng)用。在臨床中，我們常常遇到反復(fù)病理學(xué)檢查陰性而臨床表現(xiàn)高度懷疑為惡性體腔積液的病人；甚至在有些小量積液的情況下不能滿足反復(fù)病理送檢的要求而使得積液的性質(zhì)難以明確。此外，以藥物遺傳學(xué)為平臺檢測藥物療效相關(guān)基因的表達(dá)及變異情況在惡性腫瘤化療藥物選擇上有著極大的指導(dǎo)潛力。因此，如何充分利用惡性胸腔積液中的分子生物學(xué)信息以利于患者的診斷和治療吸引了越來越多的關(guān)注。中期因子(Midkine，MK)屬于肝素結(jié)合生長因子家族中的一員，是一種重要的生長分化因子。近年研究發(fā)現(xiàn)MK基因及蛋白可在多種惡性實(shí)體瘤中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)。這種高度組織分布特異性決定了其在腫瘤早期診斷中的重要價(jià)值。MK的表達(dá)與腫瘤發(fā)展的進(jìn)程及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，MK可能通過誘發(fā)瘤細(xì)胞的發(fā)生、促纖溶和細(xì)胞趨化、促進(jìn)腫瘤血管的形成及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性等機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最近的研究表明，MK分子的表達(dá)與化療藥物Imatinib的療效密切相關(guān)。然而相關(guān)的研究均局限在實(shí)體瘤水平。MK作為一種可分泌的因子，在腫瘤患者的尿液和血液中均可檢出，而在胸腔積液這一體液中尚未明確MK的具體作用，也未有研究報(bào)道其與惡性胸腔積液診斷和治療的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供中期因子基因檢測的方法和用途，用于作為肺癌引起的惡性胸腔積液的輔助診斷指標(biāo)，或者作為惡性腫瘤治療藥物篩選的靶點(diǎn)。本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種檢測良惡性胸腔積液上清中中期因子基因表達(dá)的方法，其特征在于，可從Iml胸腔積液上清中檢測出中期因子mRNA的表達(dá)水平，敏感性高，
可重復(fù)性強(qiáng)。本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種中期因子基因的用途，用于作為惡性胸腔積液的輔助診斷指標(biāo)；其特征在于，利用胸腔積液中中期因子和癌胚抗原的聯(lián)合檢測提高診斷惡性胸腔積液的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種惡性胸腔積液個(gè)體化治療的方法，其特征在于，利、用惡性胸腔積液中中期因子的水平預(yù)測化療藥物順鉬的療效。


圖一惡性胸腔積液患者積液上清中MK的表達(dá)量顯著高于良性積液患者；圖二惡性胸腔積液患者積液上清中CEA的表達(dá)量顯著高于良性積液患者；圖三CEA (A)和MK⑶診斷價(jià)值的ROC曲線；圖四CEA和MK診斷性指標(biāo)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性；圖五肺癌細(xì)胞系中MK表達(dá)與藥物敏感性的關(guān)系A(chǔ). MK mRNA在三株肺癌細(xì)胞系的表達(dá)水平；B.順鉬、健擇和多西紫杉醇對三株肺癌細(xì)胞系的藥物敏感性；圖六順鉬(A)、多西紫杉醇⑶和健擇(C)對惡性胸腔積液中原代腫瘤細(xì)胞的抑制率與MK表達(dá)水平的相關(guān)性分析。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明經(jīng)過廣泛的研究，首次證明了中期因子基因與惡性胸腔積液密切相關(guān)，并且中期因子基因可以作為惡性胸腔積液的一個(gè)輔助診斷指標(biāo)。另外，本發(fā)明還研究了中期因子在惡性腫瘤個(gè)體化治療藥物篩選中的作用，從而為治療惡性腫瘤提供了一個(gè)藥物靶點(diǎn)。在上述基礎(chǔ)上發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明還涉及定性及定量檢測所述中期因子基因的水平，從而鑒別診斷良惡性胸腔積液的方法，這些方法是本領(lǐng)域所熟知的，它包括(但不限于)游離RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄cDNA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。所述中期因子基因的特異性引物也包含在本發(fā)明內(nèi)，它們用于檢測中期因子基因的表達(dá)水平?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，所述中期因子基因有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)I.用于制備惡性腫瘤臨床檢測的試劑盒；2.用于作為惡性胸腔積液臨床診斷的輔助指標(biāo)；3.用于篩選防治惡性胸腔積液的藥物；4.用于評估藥物對于惡性胸腔積液的治療效果、預(yù)后分析以及治療手段的挑選；5.直接用其單克隆抗體對惡性胸腔積液進(jìn)行治療。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于I.首次證明中期因子基因與惡性胸腔積液的相關(guān)性，使其可以成為惡性胸腔積液臨床診斷的檢測指標(biāo),為該疾病的防治提供了祀點(diǎn)；2.分析了大量惡性胸腔積液患者中中期因子基因的表達(dá)水平，并與良性積液相比較,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。材料及方法I.研究對象本發(fā)明共收集168例胸腔積液，均來自南京市胸科醫(yī)院門診與病房患者，其中惡性胸腔積液為107例，患者的原發(fā)腫瘤均為肺腺癌IV期；良性胸腔積液為61例，均為肺結(jié)核患者。168例患者中，男性113例，女性55例;< 60歲的89例，> 60歲的79例。
2.標(biāo)本的采集和處理為提取標(biāo)本中的游離RNA，在無菌條件下行胸腔穿刺術(shù)，最初的200ml液體棄去后再收集液體，以避免導(dǎo)管內(nèi)、皮膚表面的RNA酶污染；以滅菌一次性空針抽取胸水10ml，注入事先加入0. 5ml 3. 8%拘緣酸鈉的無RNA酶管中；4000g，4°C離心10分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移至新管；4000g，4°C再次離心10分鐘，吸取上2/3的上清至新管，以去除殘存細(xì)胞可能；將上清Iml/管分裝，-80°C凍存留待提取RNA用，每個(gè)分裝物只能凍融一次。3.胸腔積液標(biāo)本的生化檢測胸水標(biāo)本的生化指標(biāo)由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生化室檢測并報(bào)告，檢測 指標(biāo)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC, X IO9)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(Neutrophil, %)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(Lymphocyte % )、總蛋白(Total protein, g/1)、乳酸脫氫酶(LDH, U/1)、腺苷酸脫氫酶(ADA, U/1)。4.胸腔積液標(biāo)本的腫瘤標(biāo)記物CEA檢測采用ELISA試劑盒檢測胸水中的CEA表達(dá)水平，具體步驟如下取出96孔板，在相應(yīng)孔中加入50 u I標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本；每孔加100 u I酶結(jié)合物，混勻30秒，37°C放置60分鐘；倒出孔內(nèi)混合液；每孔加350 u I洗滌液洗5次，并去除殘余水珠；每孔加TMB 100 U 1，混勻10秒，37°C避光放置15分鐘；每孔加100 ill反應(yīng)中止液；混勻30秒，在30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測450nm的OD值；用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CEA的表達(dá)水平(單位ng/ml)。5.游離RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄取Iml上清，融化后加入3ml Trizol LS，室溫震蕩15分鐘；12000g，4°C離心15分鐘；棄沉淀，吸取上清至新管，加入3. 2ml氯仿，劇烈震蕩后室溫放置15分鐘；12000g，4°C離心15分鐘；取上層無色水相，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，輕輕顛倒混勻10次，-200C過夜；12000g，4°C離心15分鐘；除上清，用Iml 75%的乙醇洗滌RNA沉淀，用7500g的速度在4°C離心5分鐘，除上清后干燥15分鐘；用不含RNA酶(RNase free)的水溶解RNA，60°C水浴10分鐘，重溶RNA，用核酸定量儀定量。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，體系為5XExScript Buffer 4 U I> dNTP MixtureI U I、Random 6mers I u I、ExScriptTM Rtase 0. 5 u 1> RNase Inhibitor 0. 5 u I、總 RNAI U g、ddH20 12 ill。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下42°C 15分鐘；95°C 2分鐘。cDNA于_20°C保存。6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR加樣體系為SYBRGreen Master Mix 10yl、引物(上游 I ii 1，下游 I U I)、稀釋好的模板cDNA 2iil、ddH20 6 u I0每個(gè)樣設(shè)3個(gè)復(fù)孔并設(shè)定P-actin作為內(nèi)參。RealTime PCR循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性10分，95°C變性15秒，60°C 30秒，72°C 30秒，40個(gè)循環(huán)。熔融曲線的循環(huán)參數(shù)95°C I分鐘，從55°C到95°C以0. 1°C/秒升溫。根據(jù)公式2_AAeHf算目的基因mRNA的表達(dá)。7.引物設(shè)計(jì)本發(fā)明引物根據(jù)Genebank提供的cDNA序列，利用Lasergene軟件設(shè)計(jì)如下了引物MK普通PCR引物上游5，ATG CAG CAC CGA GGC TTC CT 3，SEQ ID 2下游5，ATC CAG GCT TGG CGT CGT CTA GT 3，SEQ ID :3
MK實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物上游5，TGCCCTGCAACTGGAAGAA 3，SEQ ID 4下游5，CTTGGTGACGCGGATGGT 3，SEQ ID :5引物由Invitrogen公司合成。8.原代腫瘤細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
無菌條件下行胸腔穿刺術(shù)，消毒留置導(dǎo)管接口后接引流袋，控制引流速度，收集液體總量至200 800ml ;將收集的胸腔積液分裝至50ml離心管中，1500rpm離心10分鐘，棄上清(留少量上清重懸細(xì)胞)；在151111離心管中將7ml細(xì)胞懸液小心加至7ml Ficoll之上，2200rpm離心25分鐘；吸取中間白膜層至新管；加入40ml D_Hank’s洗漆細(xì)胞，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清；如沉淀中含有較多的紅細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液20ml，輕輕吹打后4°C靜置5分鐘后IOOOrpm離心10分鐘，血性標(biāo)本需重復(fù)2 3次；用含抗生素的RPMI 1640洗漆細(xì)胞，IOOOrpm離心10分鐘,棄上清；加入洗漆液30ml,輕輕吹打，1500rpm離心10分鐘，棄上清；細(xì)胞沉淀用含抗生素的RPMI 1640重懸，臺盼蘭染色計(jì)算細(xì)胞活力；細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為I X 105/ml用于CCK8法藥物敏感性測定，并留取適量細(xì)胞用于后續(xù)RNA抽提。9. CCK8法藥物敏感性測定取I. 0 X 105/ml上述原代細(xì)胞接種于96孔U型懸浮培養(yǎng)板中，每孔100 U I細(xì)胞懸液；加入含藥物的培養(yǎng)液(每組濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔)100 u 1，并同時(shí)設(shè)立等量細(xì)胞不加藥物的對照組和不含細(xì)胞的空白組?？瞻捉M和對照組加入等量培養(yǎng)液；將細(xì)胞置于37°C、5%二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育72小時(shí)后取出；每孔加入10 u I的含WST-8的CCK8顯色劑，繼續(xù)孵育4小時(shí)；置于自動(dòng)酶標(biāo)儀上，自動(dòng)酶標(biāo)儀以490nm波長測定各孔的吸光度(OD)值，用復(fù)孔吸光度平均值進(jìn)行比較；用測定的吸光度(OD)值進(jìn)一步計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率)。抑制率(Inhibition Rate, IR)=(對照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/ (對照孔A值-空白孔A值)X100%。實(shí)施例I :惡性胸腔積液患者積液上清中MK的表達(dá)量顯著高于良性積液患者；本發(fā)明取了 107例肺腺癌患者和61例肺結(jié)核患者的胸腔積液標(biāo)本，離心取積液上清，利用Trizol提取出總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了 MK的mRNA的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，惡性胸腔積液中MK的mRNA水平要顯著良性積液(圖I)。實(shí)施例2 :惡性胸腔積液患者積液上清中CEA的表達(dá)量顯著高于良性積液患者；將上述168例良惡性胸腔積液標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)胸水生化檢測(包括白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、總蛋白、乳酸脫氫酶和腺苷酸脫氫酶)，良惡性標(biāo)本沒有明顯差異。將上述168例良惡性胸腔積液標(biāo)本離心，取積液上清，用ELISA法檢測腫瘤標(biāo)記物CEA的水平。結(jié)果表明，惡性胸腔積液中CEA的水平要顯著良性積液(圖2)。實(shí)施例3 =CEA(A)和MK⑶診斷價(jià)值的ROC曲線；我們進(jìn)一步用ROC曲線及曲線下面積來分析MK在良惡性胸腹腔積液中的診斷價(jià)值。ROC(receive operating characteristic curve)曲線，全稱受試者工作特征曲線，是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，是用構(gòu)圖法揭示敏感性和特異性的相互關(guān)系。它通過將連續(xù)變量設(shè)定出多個(gè)不同的臨界值，從而計(jì)算出一系列敏感性和特異性，再以敏感性為縱坐標(biāo)、(I-特異性)為橫坐標(biāo)繪制成曲線，曲線下面積越大，診斷準(zhǔn)確性越高。我們以168例標(biāo)本中CEA和MK的表達(dá)水平分別繪制了 ROC曲線。CEA的ROC曲線下面積為 0. 88(95% Cl = 0. 82 0. 94) ,MK 的 ROC 曲線下面積為 0. 92(95% Cl = 0. 85 0. 97)，高于CEA?？梢奀EA和MK的表達(dá)均可用于良惡性胸腔積液的診斷(圖3)。 實(shí)施例4 =CEA和MK診斷性指標(biāo)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性；ROC曲線的另一個(gè)潛在的作用是檢測的最佳閾值。我們進(jìn)一步取ROC曲線的最左上方點(diǎn)為臨界值(Cut-off value)評估CEA和MK的各項(xiàng)診斷指標(biāo)。CEA的臨界值為12. 5ng/ml, MK的臨界值為0. 05。在此臨界值下，CEA的敏感性為72. 9%，特異性為90. 2%，陽性預(yù)測值92.9%,陰性預(yù)測值65.5%,準(zhǔn)確性為79. 2%0 MK的敏感性為77.5%,特異性為 88. 5%,陽性預(yù)測值92. 2%,陰性預(yù)測值69. 2%,準(zhǔn)確性為81.5%。將CEA和MK兩者聯(lián)合敏感性為86. 9%，特異性91. 8%，準(zhǔn)確性為88. 7% (圖4)。與CEA相比，MK作為診斷指標(biāo)具有較高的敏感性和較低的特異性。而將兩個(gè)分子聯(lián)合檢測，無論是診斷的敏感性、特異性還是準(zhǔn)確性都顯著提高。實(shí)施例5 :肺癌細(xì)胞系中MK表達(dá)與藥物敏感性的關(guān)系；本發(fā)明為證實(shí)MK表達(dá)水平與藥物敏感性的關(guān)系，首先在三株肺癌細(xì)胞系中用RT-PCR方法檢測了 MK基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MK在A549細(xì)胞中表達(dá)最高，在SPC-Al細(xì)胞中其次，在LTEP-A2細(xì)胞中表達(dá)最低(圖5A)。將臨床三種常見的化療藥物順鉬、多西紫杉醇和健擇分別作用于三株腫瘤細(xì)胞48h后，分析藥物對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(IC50)。結(jié)果表明，順鉬對三株細(xì)胞的IC5tl值與MK表達(dá)水平趨勢一致，而多西紫杉醇和健擇對細(xì)胞的作用與MK表達(dá)水平無關(guān)(圖5B)。實(shí)施例6 :化療藥物對惡性胸腔積液中原代腫瘤細(xì)胞的抑制率與MK表達(dá)水平的相關(guān)性分析。本發(fā)明進(jìn)一步在惡性胸腔積液原代細(xì)胞中驗(yàn)證了 MK表達(dá)水平與藥物作用的相關(guān)性。取46例惡性胸腔積液的細(xì)胞懸液，用密度梯度離心法取白膜層的混合細(xì)胞，利用無血清培養(yǎng)法和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法獲取腫瘤細(xì)胞，CCK-8法測定化療藥物對原代腫瘤細(xì)胞的抑制率，并與MK表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，MK的表達(dá)水平與順鉬的抑制率呈顯著負(fù)相關(guān)(R = -0. 72，P < 0. 01)，而與多西紫杉醇或健擇的抑制率無相關(guān)性。根據(jù)這些實(shí)施例，本發(fā)明證明了中期因子與惡性胸腔積液的密切關(guān)系，在肺腺癌患者的惡性胸腔積液中，能夠檢測到高水平的MK基因表達(dá)，這揭示了其可以作為惡性胸腔積液的一個(gè)輔助診斷指標(biāo)。本發(fā)明還通過腫瘤細(xì)胞系和原代腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明了 MK表達(dá)水平與化療藥物順鉬的作用顯著相關(guān)，這也使得MK基因成為了惡性胸腔積液治療中預(yù)測化療藥物療效的一個(gè)靶點(diǎn)。在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附的權(quán)利要求書所限定的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測胸腔積液上清中中期因子基因表達(dá)方法，其特征在于，可從Iml胸腔積液上清中檢測出中期因子mRNA的表達(dá)水平。所述的中期因子具有SEQID 1所示的序列。
2.一種用于胸腔積液中中期因子的熒光PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒含有0. 5ml3. 8%拘緣酸鈉的無RNA酶管、3ml Trizol LS、異丙醇、75%的乙醇、RNA保存液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、正常人對照cDNA、SYBR Green Master Mix以及權(quán)利要求I中的引物。
3.—種良惡性胸腔積液鑒別診斷的方法，其特征在于，利用胸腔積液中中期因子和癌胚抗原的聯(lián)合檢測診斷惡性胸腔積液。其中，中期因子基因檢測采用權(quán)利要求2所述的方法。
4.一種惡性胸腔積液個(gè)體化治療的方法，其特征在于，利用惡性胸腔積液中中期因子的水平預(yù)測化療藥物順鉬的療效。其中，中期因子基因檢測采用權(quán)利要求2所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種中期因子mRNA在胸腔積液游離上清中的檢測方法及其試劑盒。其方法特征在于，從GenBank中找出已知的人中期因子的mRNA全序列，設(shè)計(jì)一對熒光定量PCR引物，利用熒光PCR儀對胸腔積液中中期因子的mRNA含量進(jìn)行檢測。本發(fā)明還提供了基于本方法的試劑盒對胸腔積液中期因子游離mRNA進(jìn)行檢測，并結(jié)合癌胚抗原的檢測對惡性胸腔積液進(jìn)行診斷。本方法及試劑盒診斷的敏感性(86.9％)、特異性(91.8％)和準(zhǔn)確性(88.7％)，并可對順鉑的個(gè)體化用藥起指導(dǎo)作用。
文檔編號C12Q1/68GK102634570SQ20111017393
公開日2012年8月15日 申請日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者侯亞義, 呂明明, 王婷婷 申請人:南京大學(xué)