專利名稱：一種通過(guò)同源重組敲除nagE的高產(chǎn)氨基葡萄糖工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基葡萄糖(Glucosamine, 2-amino-2-deoxy-D-glucose)是葡萄糖的一個(gè)輕基被氨基取代后的化合物。幾乎存在與所有有機(jī)體中，包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、植物以及動(dòng)物體，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要組成成分。氨基葡萄糖能特異性地作用于關(guān)節(jié)軟骨，恢復(fù)軟骨細(xì)胞正常的代謝功能，能刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生具有正常多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白多糖，抑制損傷軟骨的酶，延緩骨性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程和疾病的進(jìn)展，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)，緩解疼痛。因此，臨床上多用于治療骨關(guān)節(jié)炎。此外，氨基葡萄糖還具有肝腎解毒，發(fā)揮抗炎、護(hù)肝的作用；刺激嬰兒腸道中雙歧桿菌的增生；在醫(yī)藥上作為抗菌消炎藥物，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和胃潰瘍疾病。在食品中，是嬰兒配方乳中添加的一種重要微量糖類成分，還是合成VB6和核黃素中間體的起始原料，此外也可用于化妝品和飼料添加劑中。甲殼素水解法是我國(guó)目前生產(chǎn)氨基葡萄糖的主要方法，甲殼素水解法轉(zhuǎn)化效率低，產(chǎn)生大量酸性廢水，因而產(chǎn)品成本高、污染嚴(yán)重。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)生物法生產(chǎn)氨基葡萄糖的報(bào)道較少，發(fā)酵產(chǎn)量也較低，尚未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。在發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)碳源葡萄糖濃度較低時(shí)，氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以被細(xì)胞當(dāng)作碳源利用。氨基葡萄糖依靠甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(marmose PTS，IIMan，由manXYZ 操縱子編碼)和葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(glucose PTS, IIg1c,由pstG基因編碼)對(duì)其進(jìn)行磷酸化后從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，而N-乙酰氨基葡萄糖在從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，依靠IIMan和乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(GlcNAc PTS, IInag,由基因nagE編碼)對(duì)其進(jìn)行磷酸化后進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，要想在胞外積累高濃度的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖，就必須對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)行阻斷，減弱氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖從胞外到胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌，所述重組菌為是克隆E. coli BL21(DE3)基因組中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和釀酒酵母 S. cerevisiae S288C基因組中氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因，同時(shí)敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)nagE基因和甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)manX基因構(gòu)建而成的重組大腸桿菌。所述氨基葡萄糖合成酶的基因來(lái)源于GenBank No. CP001509. 3基因組中g(shù)lmS 片斷，氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因來(lái)源于GenBank NC_001138,大腸桿菌為E. coli K-12(ATCC25947)。將氨基葡萄糖合成酶編碼基因glmS和氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因gnal連接到載體 pET-28a(+)上。
本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建高產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌的方法，用限制性內(nèi)切酶 Sac I和Hind III對(duì)glmS基因片斷和pET48a(+)進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將glmS基因片斷插入質(zhì)粒pET48a(+)的Mc I和Hind III位點(diǎn)之間；用限制性內(nèi)切酶Not I和Xho I對(duì)gnal基因片斷和pET48a(+)進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將gnal基因片斷插入質(zhì)粒 pET-28a(+)的Not I 和 Xho I 位點(diǎn)之間得到重組質(zhì)粒pET_28a(+) -glmS-gnal。敲除Ε. coli ATCC 25947基因組中nagE基因片段，得到nagE基因失活的菌株E. coli-Δ nagE,再將攜帶有g(shù)lmS和gnal基因片段的質(zhì)粒pET18a (+)-glmS-gnal轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli-Δ nagE中得至Ij重組菌 E. coli-glmS-gnal-Δ nagE。所述重組菌培養(yǎng)環(huán)境條件培養(yǎng)時(shí)間為12h，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，待OD6tltl達(dá)到0. 6時(shí)，按照10%濃度加入乳糖(使發(fā)酵液中終濃度為5g/L)誘導(dǎo)glmS和gnal基因的表達(dá)。 所述重組菌培養(yǎng)基組成為種子培養(yǎng)基蛋白胨12g，酵母膏Mg，甘油細(xì)1，按照50μ g/ml加入卡那霉素，pH 自然；發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨12g，酵母膏Mg，葡萄糖10g，按照50 μ g/ml加入卡那霉素， PH自然。本發(fā)明采用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖，具有發(fā)酵時(shí)間短，生產(chǎn)強(qiáng)度高，生產(chǎn)成本低，對(duì)環(huán)境污染小，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。生產(chǎn)得到的氨基葡萄糖可以廣泛用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式1.重組質(zhì)粒 pET18a(+)-glmS-gnal 的構(gòu)建用于擴(kuò)增glmS基因的引物上游5，-CGA GCT CAT GTG TGG AAT TGT TGG C-3，(下劃線序列表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)Me I)下游5，-CCCAAG CTT TTA CTC AAC CGT AAC CGA-3，(下劃線序列表示限制性酶切位點(diǎn)Hind III)。氨基葡萄糖合成酶基因glmS是利用E. coli BL21 (DE3)基因組(GenBank No. CP001509. 3)作為模版進(jìn)行PCR得到的。用限制性內(nèi)切酶Sac I和Hind III對(duì)glmS基因片斷和pET48a(+)進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將glmS基因片斷插入質(zhì)粒pET48a(+)的 Sac I和Hind III位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pET48a(+)-glmS。用于擴(kuò)增gnal基因的引物上游5，-AAGGAGATAAGAATGCGGCCGCATGAGCTTAC-3，(下劃線序列表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)Not I)下游5，-CCGCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3'(下劃線序列表示限制性酶切位點(diǎn)》ιο I)。氨基葡萄糖乙?；富騡nal是利用釀酒酵母S.cerevisiae基因組 (GenBank NC_001138)作為模版進(jìn)行PCR得到的。用限制性內(nèi)切酶Not I和Xho I對(duì) gnal基因片斷和pET18a(+)-glmS進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將gnal基因片斷插入質(zhì)粒pET-28a (+) -glmS 的 Not I 和 Xho I 位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒 pET_28a (+) -glmS-gnal。2.nagE基因的敲除根據(jù)Ε. coli JW0665_1(該菌購(gòu)自麻省理工學(xué)院，其nagE基因已經(jīng)被kan插入失活)基因組序列設(shè)計(jì)上游引物5，-TACGAGAAGCCAGAGAAGACGC-3，下游引物5，-GGTGTTCAGCAAATTTAATACGG-3，該菌株信息詳見(jiàn):http //cgsc. biology, yale. edu/Mutation. php ？ ID = 101996擴(kuò)增該菌nagE基因座及上下游約SOObp片段，將該片段轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒pKD46的 E. coliK-12，利用Red同源重組技術(shù)敲除E. coli K-12基因組nagE基因片段，再轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 PCP20，去除kan片段后得到nagE基因失活菌株E. coli-AnagE。將重組質(zhì)粒pET_28a (+) -glmS-gnal轉(zhuǎn)化E. coli-Δ nagE,得到重組大腸桿菌 E. coli_glmS_grial_ Δ nagE。4.發(fā)酵用LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌E. coli-glmS-gnal-AnagE，培養(yǎng)1 后用接種環(huán)取1環(huán)接入裝有20mL種子培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基蛋白胨12g，酵母膏Mg，甘油細(xì)1，按照50yg/ml加入卡那霉素，pH自然。培養(yǎng)時(shí)間為12h，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。再以5%的接種量接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml的三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。 發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨12g，酵母膏Mg，葡萄糖10g，同時(shí)按照50μ g/ml加入卡那霉素，pH自然。培養(yǎng)時(shí)間為12h，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，待OD600達(dá)到0. 6時(shí)，按照10%濃度加入乳糖誘導(dǎo)glmS和gnal基因的表達(dá)。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中氨基葡萄糖濃度可以達(dá)到70g/L。5.氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的檢測(cè)方法；氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確稱取氨基葡萄糖0. 0100g，加入20. Oml蒸餾水， 配制成0. 5000g/l的氨基葡萄糖溶液，然后分別稀釋成濃度為0. 2500g/l，0. 1250g/l, 0. 0625g/l，0. 0313g/l的溶液。分別取相應(yīng)濃度氨基葡萄糖溶液0. 5mL于玻璃塞試管中，加入乙酰丙酮試劑1.0ml，90°C水浴處理lh，冷卻至室溫，慢慢加入96% (ν/ν)乙醇 10. OmL (勿攪動(dòng))，然后加入DMAB試劑1. OmL,混合均勻。因反應(yīng)體系由堿性變?yōu)樗嵝?，需注意有大量二氧化碳?xì)怏w產(chǎn)生?；旌虾笫覝胤胖肐h穩(wěn)定，530nm比色，以試樣濃度為橫坐標(biāo)， OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨基葡萄糖的檢測(cè)取發(fā)酵液5.0ml加入5mL離心管中，8000rpm離心8min，取 0. 5mL于玻璃塞試管中，加入乙酰丙酮試劑1. 0ml，90°C水浴處理lh，冷卻至室溫，慢慢加入 96% (ν/ν)乙醇10. OmL (勿攪動(dòng))，然后加入對(duì)二甲胺基苯甲醛(DMAB)試劑1. OmL，混合均勻，混合后室溫放置Ih穩(wěn)定，530nm比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GlcN產(chǎn)量。乙酰氨基葡萄糖的檢測(cè)用HPLC檢測(cè)，安捷倫1200，RID檢測(cè)器，C18柱，內(nèi)徑 4. 6mm,柱長(zhǎng)250mm，流速0. 7ml/min,柱溫30°C，流動(dòng)相70%乙腈。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種氨基葡萄糖基因工程菌，是克隆E. coli BL21(DE!3)基因組中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和釀酒酵母S. cerevisiae S288C基因組中氨基葡萄糖乙?；竒nal基因，同時(shí)敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)nagE基因構(gòu)建而成的重組大腸桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖合成酶的基因來(lái)源于GenBankNo. CP001509. 3基因組中g(shù)lmS片斷，氨基葡萄糖乙?；竒nal基因來(lái)源于 GenBank NC_001138。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，將氨基葡萄糖合成酶編碼基因glmS 和氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因gnal連接到載體pET48a(+)上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，大腸桿菌為E.coli ATCC 25947。
5.一種權(quán)利要求1所述基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下1)用限制性內(nèi)切酶SacI和Hind III對(duì)glmS基因片斷和pET-28a(+)進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將glmS基因片斷插入質(zhì)粒pET48a(+)的Mc I和Hind III位點(diǎn)之間；2)用限制性內(nèi)切酶NotI和Xho I對(duì)gnal基因片斷和pET-28a(+)進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將gnal基因片斷插入質(zhì)粒pET48a(+)的Not I和Bio I位點(diǎn)之間得到重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-glmS-gnal ；3)通過(guò)Red同源重組技術(shù)敲除重組菌Ε.coli ATCC 25947基因組中nagE基因片段，得到nagE基因失活的菌株E. coli-Δ nagE ；4)將質(zhì)粒pET18a(+)-glmS-gnal轉(zhuǎn)化E.coli-ΔnagE，得到基因工程菌 E. coli_glms_grial_ Δ nagE。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌及其應(yīng)用，是將氨基葡萄糖合成酶的基因(glmS)和氨基葡萄糖乙?；富?gna1)導(dǎo)入大腸桿菌E.coli K-12，并敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)編碼基因nagE，得到的基因工程菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE，該菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖，具有發(fā)酵時(shí)間短，生產(chǎn)強(qiáng)度高，生產(chǎn)成本低，對(duì)環(huán)境污染小，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)得到的氨基葡萄糖可以廣泛用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102268399SQ201110174249
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者何菊, 劉龍, 堵國(guó)成, 李江華, 陳堅(jiān), 陳欣 申請(qǐng)人:江南大學(xué)