專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新型熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miRNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及ー種新型熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miRNA的方法。
背景技術(shù)：
MicroRNA (miRNA)是ー類(lèi)長(zhǎng)度在22個(gè)核苷酸(nt)左右的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA。越來(lái)越多的相關(guān)研究也同樣清楚地顯示miRNAs表達(dá)與多種人類(lèi)惡性腫瘤相關(guān)，提 示miRNAs代表著ー種新型癌癥生物標(biāo)記信號(hào)。成熟miRNA片段小,沒(méi)有poly (A)尾巴,家族成員之間如let_7等通常只有一至少數(shù)幾個(gè)堿基的差別，并且在細(xì)胞中的表達(dá)水平普遍較低，這些特性給miRNA定量檢測(cè)方法的建立帶來(lái)了困難和挑戰(zhàn)。盡管如此，科研工作者還是開(kāi)發(fā)出多種檢測(cè)miRNA的方法，如Northern blotting，微陣列法，以及基于酶擴(kuò)增的方法如基于PCR反應(yīng)的檢測(cè)方法，基于滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling Circle Amplification,)的檢測(cè)方法,基于連接酶反應(yīng)的方法,恒溫指數(shù)擴(kuò)增。Northern blot是驗(yàn)證和確認(rèn)miRNA的重要方法,但該方法繁瑣并且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測(cè)。芯片技術(shù)(miCToarray)檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量的檢測(cè)。目前已有多種類(lèi)型的miRNA檢測(cè)芯片可以選用。但是基因芯片檢測(cè)方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性比較差，一般多用于初篩，對(duì)獲得的結(jié)果通常需要采用Northern blot和實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證?；跐L環(huán)擴(kuò)增、連接酶反應(yīng)和恒溫指數(shù)擴(kuò)增是近幾年興起的檢測(cè)方法。也具有較好的靈敏度和特異性。在這些方法中，熒光定量PCR方法無(wú)疑是目前檢測(cè)miRNA表達(dá)的最常用方法。常規(guī)的熒光定量檢測(cè)方法中有基于莖-環(huán)的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)以及基于PolyA加尾的RT-PCR方法。stem-loop RT-PCR的反轉(zhuǎn)引物是由可以自身呈環(huán)莖狀的特異序列+6到8個(gè)miRNA3’端反向互補(bǔ)堿基組成。polyA加尾的RT-PCR的反轉(zhuǎn)引物由特異序列+(T) 20左右+兼并堿基V或VN組成。所有miRNA可以公用ー個(gè)Oligod(T)的RT引物。這兩種方法雖然有較好的靈敏度高和特異性，但仍有不足。對(duì)于stem-loop RT-PCR,一條miRNA特異對(duì)應(yīng)ー個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)引物，因此在檢測(cè)多種miRNA時(shí)，需要對(duì)該樣品進(jìn)行多次反轉(zhuǎn)。而對(duì)于PolyA加尾的RT-PCR方法，則需要在反轉(zhuǎn)錄前進(jìn)行末端Poly (A)加尾。由于這兩組方法需要多次的反轉(zhuǎn)或加尾，使得這兩種方法操作復(fù)雜且費(fèi)用昂貴。因此獲得高效，簡(jiǎn)單，以及經(jīng)濟(jì)適用的檢測(cè)miRNA方法仍然需要分析專(zhuān)業(yè)研究者的進(jìn)ー步研究和開(kāi)發(fā)。堿基堆積雜交(Base Stacking Hybridization, BSH)是指當(dāng)2條或多條連續(xù)的寡核苷酸鏈與一條長(zhǎng)的互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA雜交后,這些短的寡核苷酸鏈可以獲得額外的穩(wěn)定性。Mirzabekov' s實(shí)驗(yàn)室最早提出了堿基堆積雜交技術(shù),他們把微陣列固定于凝膠上，并主要應(yīng)用于雜交測(cè)序。2001年，他們課題組通過(guò)檢測(cè)堆積雜交形成雙鏈后熔解溫度的提高，從而來(lái)檢測(cè)堆積雜交的作用。Maldonado-Rodriguez等人把這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于單堿基突變位點(diǎn)的檢測(cè)。Rangel-Lopez等人基于堆積作用發(fā)展了一種寡核苷酸陣列，用以檢測(cè)TP53基因的9個(gè)突變位點(diǎn)。他們的結(jié)果顯示用這種方法可以很特異的在多種DNA來(lái)源的樣品中鑒定出TP53基因常見(jiàn)的突變位點(diǎn)。鑒于miRNA在生物檢測(cè)和醫(yī)學(xué)臨床上重要的應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明利用miRNA的堿基堆積カ幫助兩條只有少數(shù)幾個(gè)堿基配對(duì)的引物互補(bǔ)，在PCR的熱循環(huán)下，互補(bǔ)的兩條引物相互延伸，而無(wú)目標(biāo)miRNA則由于在退火溫度下無(wú)法穩(wěn)定結(jié)合，因而難以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，可以通過(guò)熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，達(dá)到定量檢測(cè)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種新型熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miRNA的方法。根據(jù)本發(fā)明的新型熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miRNA的方法，該方法，利用miRNA、通用引物和特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，其中I)設(shè)計(jì)靶標(biāo)miRNA的通用引物和特異性引物，其中特異性引物包括直鏈和 莖環(huán)引物；2)以miRNA提供堿基堆積力，幫助特異性引物和通用引物結(jié)合，利用DNA聚合酶延伸特異性引物；3)以上述延伸的DNA鏈為模板繼續(xù)延伸通用引物；4)根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果判斷檢測(cè)樣品中是否含有靶標(biāo)miRNA。根據(jù)本發(fā)明的miRNA的熒光定量PCR的方法，可以根據(jù)所檢測(cè)的靶標(biāo)miRNA設(shè)計(jì)特異性直鏈引物或莖環(huán)引物，然后結(jié)合通用引物進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。如圖I所示，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，所述直鏈或莖環(huán)引物首先與miRNA退火雜交，然后直鏈或莖環(huán)引物再與通用引物雜交，并完成第一鏈的合成，進(jìn)而以第一鏈為模板合成第ニ鏈。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述通用引物可與所有miRNA特異性的直鏈引物或頸環(huán)引物反應(yīng)。通用引物長(zhǎng)度一般為15 60bp，可以人工設(shè)計(jì)序列并合成。在設(shè)計(jì)上該通用引物的3'端與特異直鏈或莖環(huán)引物有少數(shù)幾個(gè)(4-7)堿基互補(bǔ)。5'端的序列可在避免與特異性的直鏈引物或頸環(huán)引物在其他區(qū)域上互補(bǔ)或通用引物自身的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)上自由設(shè)計(jì)。5'端引物的設(shè)計(jì)有一定程度的隨機(jī)性。熒光定量PCR是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。根據(jù)本發(fā)明的方法，使用熒光染料可包括SYBR GREEN、ResoLight, LCGreen與EverGreen等熒光染料。也可使用熒光標(biāo)記的引物如Taqman，LUX 熒光引物等。根據(jù)本發(fā)明的方法，由于不完全互補(bǔ)的序列提供的堿基堆積カ要遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于完全互補(bǔ)的序列，尤其是在堿基堆積的端頭上，僅單個(gè)堿基的錯(cuò)配也會(huì)強(qiáng)烈的影響PCR的反應(yīng)效率。因此用該方法可以很好的區(qū)分少數(shù)幾個(gè)或單堿基錯(cuò)配。本發(fā)明利用miRNA的堿基堆積力幫助兩條只有少數(shù)幾個(gè)堿基配對(duì)的引物互補(bǔ)，在PCR的熱循環(huán)下，互補(bǔ)的兩條引物相互延伸，而無(wú)目標(biāo)miRNA則由于在退火溫度下無(wú)法穩(wěn)定結(jié)合，因而難以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。堿基堆積原理應(yīng)用于miRNA的熒光定量檢測(cè)的巧妙之處在于并非傳統(tǒng)的PCR方法擴(kuò)增模板，而是利用miRNA的幫助使得只有少數(shù)堿基互補(bǔ)的兩條引物的相互擴(kuò)增從而達(dá)到檢測(cè)的目的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)確定本發(fā)明的方法的靈敏度和特異性。在本發(fā)明中，通過(guò)檢測(cè)稀釋成不同濃度的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定該方法的靈敏度；檢測(cè)特異性主要包括兩個(gè)方面a)miRNA成熟體與前體的區(qū)分；b)miRNA基因家族的區(qū)分。在本發(fā)明的實(shí)施例中，還使用本發(fā)明的方法檢測(cè)細(xì)胞、組織以及體液中的miRNA，最后通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)現(xiàn)有定量檢測(cè)miRNA方法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法可以檢測(cè)500ng級(jí)別的樣品(靈敏度)、以及區(qū)分單堿基差異的序列(特異性)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，將本發(fā)明的方法用于細(xì)胞、組織以及體液中miRNA的檢測(cè)，并比較正常芯片、傳統(tǒng)熒光檢測(cè)方法以及本發(fā)明的方法的一致性，系統(tǒng)評(píng)估該方法的應(yīng)用范圍。本發(fā)明的方法在整個(gè)操作過(guò)程中既無(wú)需反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，也無(wú)需熒光標(biāo)記探針，且操作簡(jiǎn)單，因此可以大大提高檢測(cè)效率、縮短檢測(cè)周期、降低檢測(cè)成本，適用于早期診斷和臨床檢測(cè)。此外，本項(xiàng)目的成功實(shí)施也可廣泛的應(yīng)用于生物等其它領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景和顯著的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。


圖I本發(fā)明的方法的原理圖。圖2為分析本發(fā)明的熒光實(shí)時(shí)定量PCR的靈敏度的結(jié)果圖。圖3為利用本發(fā)明的方法區(qū)分miRNA基因家族的結(jié)果圖。圖4為顯示本發(fā)明的熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA前體和成熟體的結(jié)果圖。圖5為使用本發(fā)明的方法分析正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中miRNA表達(dá)的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I分析本發(fā)明的熒光實(shí)時(shí)定量PCR的靈敏度靈敏度分析采用本發(fā)明的方法檢測(cè)梯度稀釋的let_7d miRNA，引物序列如下特異性引物5' -AACTATGCAACCTACTACCTCTAGCGA-3'通用引物5' -CAGAGACAGACACATACTCGCT-3'let-7d5' -AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU-3'熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μ L PCR 反應(yīng)體系包括12. 5μ L 2 X RT-PCR Master Mix ;1· 2 μ M 通用引物；I. 2 μ M特異性引物；I μ L目標(biāo)miRNA熒光定量PCR反應(yīng)條件使用儀器ROCHR 480反應(yīng)程序95 0C 3 分鐘，950C 10 秒；55°C 10 秒；72°C 10 秒；40 個(gè)循環(huán)72 °C延伸5分鐘實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法檢測(cè)范圍較寬(見(jiàn)圖2)，能達(dá)5個(gè)數(shù)量級(jí)(5amol to500fmol.)，且有較好的線(xiàn)性關(guān)系(R2 = O. 995)，能準(zhǔn)確的定量。實(shí)施例2特異性分析miRNA基因家族的區(qū)分
miRNA中有許多家族，而家族中的成員通常序列非常相近，有些甚至為單堿基的區(qū)別，如le-7家族(表I)，這些成員中l(wèi)et_7f與let_7a僅相差I(lǐng)個(gè)堿基；le-7家族4個(gè)成員的序列l(wèi)et-7a 5' -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3,let-7b 5' -UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU—3,let-7d 5' -AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3'let-7f 5' -UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU-3,設(shè)計(jì)特異性引物以及通用引物序列Let-7f 5' -AACTATACAATCTACTACCTCAAGCGA-3'
Let-7a 5' -AACTATACAACCTACTACCTCAAGCGA-3'Let-7b 5' -AACCACACAACCTACTACCTCAAGCGA-3'Let-7d 5' -AACTATGCAACCTACTACCTCTAGCGA-3'通用引物5' -CAGAGACAGACACATACTCGCT-3'熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μ L PCR 反應(yīng)體系包括12. 5μ L 2 X RT-PCR Master Mix ; 12 μ M 通用引物；12 μ M特異性引物；I μ L目標(biāo)miRNA熒光定量PCR反應(yīng)條件使用儀器ROCHR 480反應(yīng)程序95で，3 分鐘，950C 10 秒；55°C 10 秒；72°C 10 秒；40 個(gè)循環(huán)72 °C延伸5分鐘當(dāng)設(shè)定完全匹配的效率為100%吋，當(dāng)堿基錯(cuò)配的效率僅為I. 27%，而兩個(gè)堿基左右錯(cuò)配的效率則更低(結(jié)果如圖3所示)。根據(jù)以上結(jié)果表明本發(fā)明的方法有著非常好的特異性。實(shí)施例3用本發(fā)明的方法區(qū)別miRNA前體和成熟體成熟體與前體miRNA的序列mir-215' -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3,5' -UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACPre-mir-21 CAGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3;設(shè)計(jì)特異性引物以及通用引物序列mir-215' -AACTATACAACCTACTACCTCA AGCGA-3'通用引物5' -CAGAGACAGACACATACTCGCT-3'熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μ L PCR 反應(yīng)體系包括12. 5μ L 2 X RT-PCR Master Mix ;1· 2 μ M 通用引物；I. 2 μ M特異性引物；I μ L目標(biāo)miRNA熒光定量PCR反應(yīng)條件使用儀器ROCHR 480反應(yīng)程序
95°C，3 分鐘，95°C 10 秒；55°C 10 秒；72°C 10 秒；40 個(gè)循環(huán)72 °C延伸5分鐘結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明的方法能清楚的區(qū)分miRNA的前體和成熟體。實(shí)施例4用本方法評(píng)估分析正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中miRNA表達(dá)分析擬選取人體肺癌細(xì)胞A549以及正常的肺成纖維細(xì)胞HLF作為研究対象，分析其miRNA表達(dá)的差異。I)細(xì)胞的培養(yǎng)以及RNA的提取細(xì)胞根據(jù)其生長(zhǎng)不同需求，采用各自適宜的方式培養(yǎng)。在其生長(zhǎng)狀態(tài)最佳時(shí)，采用Trizol法提取總RNA
2)選擇多組 miRNA 為研究對(duì)象mir21,mir 29b, mir-23a, let-7, let7f3)采用ROCHE Lightcyler 480熒光定量PCR儀高通量(384孔板)檢測(cè)miRNA在不同細(xì)胞系中的表達(dá)譜，并以U6為內(nèi)參。設(shè)計(jì)特異性引物以及通用引物序列mir-23a 5' -GGAAATCCCTGGCAATGTGATAGCGA-3'mir-29b 5' -AACACTGATTTCAAArGGTGCTAAGCGA_3'106a5' -CTACCTGCACTGTAAGCACTTTTAGCGA-3'Let-7b5' -AACCACACAACCTACTACCTCAAGCGA-3'Let-7f 5' -AACTATACAATCTACTACCTCAAGCGA-3'U6-15' -TGTGCTGCCGAAGCGAGCACAGCGA-3'通用引物5' -CAGAGACAGACACATACACGCT-3'熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μ L PCR 反應(yīng)體系包括12. 5μ L 2 X RT-PCR Master Mix ;1· 2 μ M 通用引物；I. 2 μ M特異性引物；200ng總RNA熒光定量PCR反應(yīng)條件使用儀器ROCHR 480反應(yīng)程序95で，3 分鐘，950C 10 秒；55°C 10 秒；72°C 10 秒；40 個(gè)循環(huán)72 °C延伸5分鐘這個(gè)miRNA表達(dá)譜的分析與芯片以及其它文獻(xiàn)報(bào)道中的趨勢(shì)是一致的(見(jiàn)圖5)，表明這種與其它方法具有一致性。
權(quán)利要求
1.一種新型檢測(cè)miRNA熒光定量PCR方法，其特征在于，利用miRNA、通用引物和特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，其中， 1)設(shè)計(jì)靶標(biāo)miRNA的通用引物和特異性引物，其中特異性引物包括直鏈和莖環(huán)引物； 2)以miRNA提供堿基堆積力，幫助特異性引物和通用引物結(jié)合，利用DNA聚合酶延伸特異性引物； 3)以上述延伸的DNA鏈為模板繼續(xù)延伸通用引物； 4)根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果判斷檢測(cè)樣品中是否含有靶標(biāo)miRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述miRNA為成熟miRNA或miRNA前體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述miRNA為來(lái)自同一基因家族的miRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新型熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miRNA的方法。根據(jù)本發(fā)明的新型熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)miRNA的方法包括，所述方法利用miRNA、通用引物和特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增1)設(shè)計(jì)靶標(biāo)miRNA的特異性引物，包括直鏈和莖環(huán)引物，以及通用引物；2)以miRNA提供堿基堆積力，幫助特異性引物和通用引物結(jié)合，利用DNA聚合酶延伸特異性引物；3)以上述延伸的DNA鏈為模板繼續(xù)延伸通用引物；4)根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果判斷檢測(cè)樣品中是否含有靶標(biāo)miRNA。本發(fā)明的方法在整個(gè)操作過(guò)程中既無(wú)需反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，也無(wú)需熒光標(biāo)記探針，且操作簡(jiǎn)單，因此可以大大提高檢測(cè)效率、縮短檢測(cè)周期、降低檢測(cè)成本，適用于早期診斷和臨床檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851352SQ20111017452
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者李烔, 呂卓璇, 段德民, 曹榕, 姜麗, 沈葉, 惠利省, 顧唯兵, 鄭克孝, 趙轉(zhuǎn) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所