專利名稱：一種編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子wrky蛋白的基因及其表達(dá)載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因及其表達(dá)載體與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在長期的進(jìn)化過程中，形成了復(fù)雜而精巧的抗病防衛(wèi)機(jī)制。植物防衛(wèi)過程的激活大多涉及宿主基因表達(dá)的時(shí)序調(diào)控，且調(diào)控多數(shù)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件特異結(jié)合，從而調(diào)節(jié)特定基因的時(shí)空表達(dá)。表達(dá)譜分析、突變體和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)都證明了轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。因此，分離和鑒定抗病信號(hào)途徑中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)組分對(duì)闡明植物防衛(wèi)反應(yīng)的分子機(jī)理至關(guān)重要。WRKY蛋白是主要存在于植物中的一類轉(zhuǎn)錄因子(Olker and Somssich，2004)。 高等植物的WRKY構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子超家族，水稻中有100個(gè)以上成員(Wu et al，2005)。它們共同的結(jié)構(gòu)特征是含有1-2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域包含大約60個(gè)氨基酸殘基，N端的七肽WRKYGQK十分保守，其后緊接一個(gè)C2H2或C2HC的鋅指紋。根據(jù)WRKY保守域的數(shù)目和鋅指紋的類型，將WRKY蛋白分成3個(gè)組(Eulgem et al，2000)。WRKY蛋白的主要功能是參與植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)節(jié)(Pandey and Somssich, 2009)。證據(jù)表明，一些水稻W(wǎng)RKY基因參與抗病信號(hào)的傳遞與調(diào)節(jié)。0sWRKY03、71作用于 SA依賴的抗病信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)下游基因OsNPRl和I3Rlb的表達(dá)(Liu et al.，2005，2007)。 0sffRKY13作為SA信號(hào)途徑的激活蛋白和JA信號(hào)途徑的抑制蛋白，介導(dǎo)水稻對(duì)白葉枯病和稻瘟病的抗性O(shè)liu et al. ,2007)；進(jìn)一步的分析表明，0sWRKY13通過激活谷胱甘肽氧化 /還原系統(tǒng)和類黃酮生物合成途徑，以監(jiān)測細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和刺激植保素合成，從而在抗病反應(yīng)中發(fā)揮作用Oliu et al.，2008)。同樣，0sWRKY45的功能研究也較深入，超表達(dá)植株對(duì)稻瘟病的抗性增強(qiáng)，RNA干涉抑制表達(dá)植株則對(duì)這種病害的抗性減弱，該轉(zhuǎn)錄因子作用于SA介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑，但不依賴于NHl (Shimono et al.，2007)。另外一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)0sWRKY45的擬南芥植株對(duì)丁香假單胞菌和干旱、高鹽的抗性均增強(qiáng)Oiiu and Yu, 2009)，提示它在生物和非生物脅迫信號(hào)途徑的整合中發(fā)揮作用。有趣的是，來源于秈稻的0sWRKY45-2與粳稻的等位基因0sWRKY45-l僅有10個(gè)氨基酸的差異，然而它們?cè)谒九c白葉枯菌、細(xì)菌性條紋病菌的互作中表現(xiàn)出相反的調(diào)節(jié)效應(yīng)前者是抗病反應(yīng)的正調(diào)節(jié)子，后者是負(fù)調(diào)節(jié)子，這可能是由于它們介導(dǎo)不同的信號(hào)途徑的緣故(Tao et al.，2009)。 Wang et al. O007)的實(shí)驗(yàn)表明，超表達(dá)0sWRKY89的水稻植株對(duì)稻瘟菌的抗性增強(qiáng)，抑制表達(dá)的植株則表現(xiàn)出相反的表型，這種調(diào)節(jié)作用是通過改變?nèi)~片表面蠟質(zhì)代謝和排列分布實(shí)現(xiàn)的。Peng et al. (2008)報(bào)道，0sWRKY62在植物先天性免疫中扮演一個(gè)負(fù)調(diào)控因子的角色，超表達(dá)株系中防衛(wèi)基因的活化受到抑制，對(duì)白葉枯病的基礎(chǔ)抗性和介導(dǎo)的抗性均有所減弱。另外，0sWRKY53、31和23在植物抗病反應(yīng)中的調(diào)節(jié)功能也得到了不同程度的解析(Chujo et al.，2007 ；Zhang et al.，2008 Jing et al. ,2009)
WRKY還參與植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答和某些發(fā)育、代謝過程。如參與對(duì)低溫、高鹽、干旱、氧化脅迫等非生物脅迫的應(yīng)答；參與衰老、表皮毛的形態(tài)構(gòu)建和種子大小的控制； 參與糖代謝、倍半萜烯合成和脫落酸(ABA)等植物激素介導(dǎo)的信號(hào)途徑。WRKY還與植物對(duì) UV-B的抗性有關(guān)。水稻是單子葉植物研究的模式植物，是基因組最小、進(jìn)化程度最低的禾本科植物， 與其它禾本科植物如小麥、玉米、高梁、甘蔗基因組間存在共線性(colineariy)。因此， 水稻基因組結(jié)構(gòu)與功能的研究對(duì)其它禾本科植物的相關(guān)研究具有很大的借鑒意義。水稻又是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是世界半數(shù)以上人口的主要食物來源，其基因組全序列測定的完成 (International Rice Genome Sequencing Pro ject, 2005)為水稻功能基因組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)，從水稻基因組中挖掘有用的基因，用于提高產(chǎn)量、改善品種、提高抗逆性，是目前植物功能基因組學(xué)和農(nóng)業(yè)高技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因。該基因?yàn)槿缦?a)或(b)或(C)或(d)所述的核苷酸序列(a)序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列；(b)編碼序列表中SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列的核苷酸序列；(c)與序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；(d)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID No=I限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IXSSPE或0. 1XSSC、0. 1 % SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。所述SEQ ID No 1核苷酸序列，具體如下AATACTGAATAGGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCTAATTAAGCATCAGACAGAAACTAG60
AMGAGCGAGCACGCCACTATGGATATGATGGAGGAGGAGGCTGCCAACGCCGCCACTGC120
TCAAGCTGCTGCTGCTGGCGACCTCGCCGACGTCGTGGCCCGTGCCAATGCACGCGCATT180
CCTCGTCTCCACCCCTCACCATCACCCCTCACCTCTGCATCCTCTTCCTCCTCCTCCCAT240
GCCTCAGGCGCCTCACCAATACTATCCCGCCCCCCAGATCACCATCCCTTACCACCACCA300
CCACCACGGAGAGCTTCGGCGCCCTACCACCATCGCTTACACCGACGCACCTGTGCCGTT360
CGAGACGGCGGGGCCGCCATCCACGGTCGTCGACTCATACCACCACCTCACACCCGGCGA420
CGCCGGCTACGGGATGCCGCGGCCGCTTGCTCTCCAGATCTCCCAGCACGCCCTCTGTGG480
CGGCGGCGACGTGGTGATGGGCGGCGGAGGCGCAGGCGCTGCCGATGATGGAGMGAAGC540
CATCAGGATCTCGCCACTGACGCCGTCTGCTCATCATCAAATGATGAAAAGGAAGAATGA600
GGTGAAGAAAGTGGTGTGCATCCCGGCGCCGCCAGCGACGAGTAGCCGTGGAGGTGGAGG660
AGAGGTGATCCCGTCTGATCTATGGGCATG GAGGMGTACGGCCAGAAACCCATCAAAGG720
CTCTCCTTATCCACGGGGTTACTACAGATGCAGCAGCTCAAAGGGATGTATGGCGAGGM780
GCAGGTGGAGCGCAGCCGCAGCGACCCCAACATGCTGGTGATCACCTACGCGGCGGAGCA840
CMCCACCCATGGCCGATGCMCGTMTGTGCTCGCCGGATATGCCCGTTCTCATCACAG900
TACTCATGCTACTGCCTCCAGCAGCCGCCA CAAGCAACAG CAGCAGCAGC AGACCAACCA960
GCTGCAGCCTGCACTGATCACMGCTCATCGTCTTCTTCC TCCTCCCCATTCMTCTCTA1020
CGCCGACGTCGTGCTCGGTGGCCMCAGGCCMCATGATG ATGACGACGGAGGGCGCCGG1080
CGCTGGACTTGGCATCCMCCTTCAGCAGCTGATGAGGTC TTTGCAGAGCTGGAGGAGTT1140
GGAGCCTGATMTCCTACTATGATCMTGCAMCATGCAG GTGTACTCCACCACCAGCAG1200
GCCAGGGGTAAGCAGCTATGATCATCAGTGGCACMGTTC TMTMTTMACCATGCAGT1260
ACCTATATATATATATATCAGMCTTCMTATTCGAGAGA GGAGATCAGAGGAMTTGM1320
TTCTAGCACGTACMTTMTACATCATGACTATGCAAMT TTACATATATATGATATGAT1380
GGTCGCCTGTGCGATTATTAGTGACCAMTTAMGATTGT CAGAGATATAGGCGTGTACT1440
TACGCTTATATGTATCACGCTGAGGTATACTGTATTTACA AGMGATAMTAAMTATCC1500
ATATC1505
其中，序列表SEQ ID No:1從茉莉酸甲酯處理的水稻幼苗葉RNA中通過RT-PCR的
所述SEQ ID No :2氨基酸殘基序列，具體如下
ifet Asp Met Met Glu Glu Glu Ala Ala Asn Ala Ala Thr Ala Gln
方法克隆，由1505個(gè)脫氧核苷酸組成，包含長1164bp的開放讀碼框，推測編碼有387個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。自5'端第1位至第79位為5'未翻譯區(qū)序列，第80位至1240位脫氧核苷酸為編碼序列，第1241位至1243位為終止密碼子，第1244位到1505位為3'未翻譯區(qū)序列。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種上述基因編碼的水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白，該蛋白為以下(a)或(b)所述的氨基酸殘基序列(a)序列表中SEQ ID No 2所述的氨基酸殘基序列；(b)將(a)中的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加而形成的具有水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白功能的由(a)衍生的氨基酸殘基序列；所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
5
Asp Leu Ala Asp Val 25
His His Pro Ser Pro 45
Tyr Tyr Pro Ala Pro 65
Arg Pro Thr Thr lie 85
Ser Thr Val Val Asp 105
Arg Pro Leu Ala Leu 125
Gly Gly Gly Gly Ala
10
Val Ala Arg Ala Asn 30
Leu His Pro Leu Pro 50
Gln lie Thr lie Pro 70
Ala Tyr Thr Asp Ala 90
Ser Tyr His His Leu 110
Gln lie Ser Gln His 130
Gly Ala Ala Asp Asp
15
Ala Arg Ala Fhe Leu 35
Pro Pro Pro ifet Pro 55
Tyr His His His His 75
Pro Val Pro Fhe Glu 95
Thr Pro Gly Asp Ala 115
Ala Leu Cys Gly Gly 135
Gly Glu Glu Ala lie
Ala Ala Ala Ala Gly 20
Val Ser Thr Pro His 40
Gln Ala Pro His Gln 60
His Gly Glu Leu Arg 80
Thr Ala Gly Pro Pro 100
Gly Tyr Gly Met Pro 120
Gly Asp Val Val ifet 140
Arg lie Ser Pro Leu



145
Thr Pro Ser Ala His 165
lie Pro Ala Pro Pro 185
Leu Trp Ala Trp Arg 205
Tyr Tyr Arg Cys Ser 225
Ser Asp Pro Asn Met 245
Gln Arg Asn Val Leu 265
Ser Ser Arg His Lys 285
Thr Ser Ser Ser Ser 305
Gly Gln Gln Ala Asn 325
Pro Ser Ala Ala Asp 345
ifet lie Asn Ala Asn 365
Asp His Gln Trp His 385
150
His Gln ifet Met Lys 170
Ala Thr Ser Ser Arg 190
Lys Tyr Gly Gln Lys 210
Ser Ser Lys Gly Cys 230
Leu Val lie Thr Tyr 250
Ala Gly Tyr Ala Arg 270
Gln Gln Gln Gln Gln 290
Ser Ser Ser Ser Pro 310
Met Met ifet Ihr Ihr 330
Glu Val Fhe Ala Glu 350
Met Gln Val Tyr Ser 370
Lys Phe 387
155
Arg Lys Asn Glu Val 175
Gly Gly Gly Gly Glu 195
Pro lie Lys Gly Ser 215
Met Ala Arg Lys Gln 235
Ala Ala Glu His Asn 255
Ser His His Ser Thr 275
Gln Thr Asn Gln Leu 295
Phe Asn Leu Tyr Ala 315
Glu Gly Ala Gly Ala 335
Leu Glu Glu Leu Glu 355
Thr Thr Ser Arg Pro 375
160
Lys Lys Val Val Cys 180
Val lie Pro Ser Asp 200
Pro Tyr Pro Arg Gly 220
Val Glu Arg Ser Arg 240
His Pro Trp Pro ifet 260
His Ala Ihr Ala Ser 280
Gln Pro Ala Leu lie 300
Asp Val Val Leu Gly 320
Gly Leu Gly lie Gln 340
Pro Asp Asn Pro Thr 360
Gly Val Ser Ser Tyr 380
其中，序列表SEQ ID No 2由387個(gè)氨基酸殘基組成，含一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域(自氨
基端的第200至256位氨基酸殘基)和-
-個(gè)C2H2鋅指紋，歸類為WRKY第三組。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明基因在水稻根、莖、葉、花、穗等組織中有表達(dá)。根、花中表達(dá)豐度最高，其次為莖、葉，穗中的豐度低。本發(fā)明基因受茉莉酸、乙烯和水稻紋枯病菌誘導(dǎo)，而水楊酸則抑制其表達(dá)。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供上述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供上述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因的工程菌。本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供上述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因在培育抗逆性植物中的應(yīng)用。更具體地說，所述抗逆性植物為水稻。本發(fā)明的水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
本發(fā)明的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的T2代水稻植株對(duì)紋枯病的抗性增強(qiáng)，表明該基因介導(dǎo)了水稻對(duì)病害的防衛(wèi)反應(yīng)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例基因編碼的蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性分析圖組。圖2為本發(fā)明實(shí)施例基因在激素處理和紋枯病菌接種后的表達(dá)圖組。圖3為本發(fā)明實(shí)施例基因的超表達(dá)載體構(gòu)建和T2代超表達(dá)水稻植株的Northern 分析圖組。圖4為本發(fā)明實(shí)施例基因的T2代超表達(dá)水稻植株抗紋枯病分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)驗(yàn)過程中涉及到的限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，參照使用說明書使用。一、本發(fā)明基因的cDNA序列的分離水稻栽培種秀水11三葉期幼苗用100 μ M茉莉酸甲酯噴霧，取處理后1、6和12小時(shí)的葉片提取RNA，等量混合RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄(RT)后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94°C的溫度下預(yù)變性3分鐘，再94°C下30秒，56°C下30秒，72°C下1分40秒，30個(gè)循環(huán)，最后在 72°C下延伸10分鐘。擴(kuò)增得到1505bp的cDNA片段。PCR產(chǎn)物純化后，連接到pUCmT載體上,測序驗(yàn)證，即得序列表中的SEQ ID Ns:l。引物為5，-AATACTGAATAGGCAGCAGCAACA-3， 禾口 5，-GCACAGGCGACCATCATATCATAT-3，。二、本發(fā)明基因編碼的蛋白的轉(zhuǎn)錄激活分析參見圖1，圖1的A部分為酵母轉(zhuǎn)化子的生長情況的示意圖組。A部分的中間圖是分區(qū)接種示意圖1表示pCLl (正對(duì)照)載體，2表示PGBKT7 (pBD,負(fù)對(duì)照)載體，3表示 PBD-WRKY載體，4表示pBD-WRKY Δ C載體。載體的構(gòu)建及含義見下述“具體實(shí)驗(yàn)過程”。A部分的左圖表示上述四種載體的轉(zhuǎn)化子在SD-Trp培養(yǎng)基上均生長。A部分的右圖表示的是pCLl、pBD-WRKY和pBD_WRKY Δ C轉(zhuǎn)化子在選擇培養(yǎng)基 SD-Trp-Ade-His上生長，而pBD轉(zhuǎn)化子不生長。圖1的B部分為轉(zhuǎn)化子的α-半乳糖苷酶的相對(duì)活性圖表，含pCLl (正對(duì)照)的轉(zhuǎn)化子的α -半乳糖苷酶活性定義為100%。α -半乳糖苷酶活性用試劑盒(購自Clotech 公司)測定，按供應(yīng)商說明書進(jìn)行。具體實(shí)驗(yàn)過程如下以引物 5，-GGAATTCCATATGTATGGATATGATGGAGGAGGAGG-3，(下劃線為 Nde I 位點(diǎn)) 與 5，-CGGGATCCGAACTTGTGCCACTGATGATCATAG-3'(下劃線為 BamHI 位點(diǎn))擴(kuò)增本發(fā)明基因的整個(gè)編碼區(qū)域(自SEQ ID Na 1的79位至1216位)，以引物5，-GGAATTCCATATGGCA ACAGCAGCAGCAGCAGA-3，(下劃線為 NdeI 位點(diǎn))和 5，-CGGGATCCGAACTTGTGCCACTGATGATCAT AG-3’ (下劃線為BamHI位點(diǎn))擴(kuò)增本發(fā)明基因的缺失C端102個(gè)氨基酸殘基的編碼區(qū)域(自SEQ ID No :1中的934至1216位)，PCR產(chǎn)物分別連接到pGBKT7載體的GAL4DNA結(jié)合域(BD)上，構(gòu)建pBD-WRKY和pBD_WRKY Δ C載體，分別以pCLl (編碼全長GAL4)和空載體 PGBKT7 (pBD)作為正負(fù)對(duì)照，轉(zhuǎn)化AH109酵母株。轉(zhuǎn)化子在SD培養(yǎng)基和SD-Trp-Ade-His選擇培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)3天，觀察生長情況，發(fā)現(xiàn)pCLl、pBD-WRKY和pBD-WRKY Δ C轉(zhuǎn)化子能夠在上述選擇培養(yǎng)基上較好地生長，而攜帶空載體pBD的轉(zhuǎn)化子不能生長，如圖1的A部分所示，說明本發(fā)明基因編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活的活性。PBD-WRKYAC的α-半乳糖苷酶活性為pBD-WRKY的觀.9% (圖1的B部分所示)，說明C-端102個(gè)氨基酸殘基負(fù)責(zé)本發(fā)明基因編碼的蛋白的大部分轉(zhuǎn)錄激活活性。三、本發(fā)明基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析(1)水稻培養(yǎng)與病原菌接種、激素處理水稻品種秀水11種子在37°C下浸泡1天，露白后催芽1天，然后播種在加有營養(yǎng)液的蛭石中，在溫室中培養(yǎng)。28 V (晝)/25°C (夜)，光周期14/10h，光照強(qiáng)度ΙΟΟμπιοΙ HT2s-1,相對(duì)濕度為85%。三葉期苗用于各種處理，于不同時(shí)間取樣，取葉片提取RNA。紋枯病菌⑶118從國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(nyhyZX3-16)水稻紋枯病防治協(xié)作組獲得。接種物制備將浸泡2天的稻谷粒裝入培養(yǎng)皿中，121°C滅菌30分鐘，冷卻后，將3天菌齡的紋枯菌菌絲塊接種于已滅菌的稻谷粒，于高濕度環(huán)境下暗培養(yǎng)3天。 將兩顆攜帶菌絲的接種物靠于稻株基部，左右各一顆。接種后的水稻于室溫下培養(yǎng)，保持濕度在85%左右。以未攜帶菌絲的接種物模擬接種為對(duì)照。分別于0、l、6、12、24h后取葉片提取總RNA。激素處理用100 μ mol Γ1茉莉酸甲酯(MeJA)、2mmol Γ1水楊酸(SA)和Immol Γ1乙烯利(ET)噴施三葉期水稻幼苗，分別于0、l、6、12、24h取葉片提取總RNA。其中茉莉酸甲酯先溶于少量甲醇，再用ddH20溶，甲醇終濃度為0. (體積百分含量)。(2) RNA提取、Northern雜交和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分析采用Promega 公司的 PureYield RNA Midiprep System,從 3 葉期水稻(秀水 11)的葉中提取總RNA提取，按使用說明書進(jìn)行。本發(fā)明基因的特異性探針的擴(kuò)增引物為 5，-CAATGCACGCGCATTCCTCG-3，和 5，-CGTCAGTGGCGAGATCCTGA-3，。此探針用于 Northern 雜交分析。10 μ g總RNA在1. 2%甲醛變性瓊脂糖膠中電泳分級(jí)，然后轉(zhuǎn)移至Hybond-N+尼龍膜上，與[a-32P]-標(biāo)記的基因特異性探針在65°C下雜交。65°C下，用2XSSC加0. 1%SDS洗 5分鐘，在同樣溫度下用IX SSCWO. SDS再洗5分鐘。膜壓磷屏(Amersham Pharmacia, UK)。以2 μ g總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用hvitrogen公司的Supei^criptreverse transcriptase II，按使用說明書操作。實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 采用 ARI PRISM7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)，按以下條件進(jìn)行94°C預(yù)變性 2 分鐘；94°C變性 5秒，54"C退火10秒；72°C延伸20秒，40個(gè)循環(huán)。水稻Actinl (AK071586)用作內(nèi)標(biāo)。擴(kuò)增本發(fā)明基因的特異性引物為5，-AACAGCAGCAGCAGCAGA-3，和5，-GTCGGCGTAGAGATTGAATGG-3，。 Actinl 的擴(kuò)增引物為5，-GGCACCACACCTTCTACAATGAG-3，和 5，-ACACCATCACCAGAGTC AAGCA-3，。結(jié)果如圖2所示，圖2的A部分為本發(fā)明基因在紋枯病菌、茉莉酸甲酯和乙烯利處理下表達(dá)的Northern分析，圖2的B部分為水楊酸處理下本發(fā)明基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析?？梢?，本發(fā)明基因受紋枯病菌接種、茉莉酸和乙烯利誘導(dǎo)表達(dá)，而不受水楊酸誘導(dǎo)，說明該基因可能參與茉莉酸/乙烯介導(dǎo)的抗病防衛(wèi)信號(hào)途徑中。四、本發(fā)明基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的抗病分析參見圖3，A部分為本發(fā)明基因的超表達(dá)載體示意圖，WRKY指本發(fā)明基因的全長編碼序列(自SEQ ID No 1中的第80至1240位)，LB和RB分別指pCambial301載體的左、 右邊界，T7 terminator指T7終止子⑴bi指玉米u(yù)biquitin基因的啟動(dòng)子。B部分為超表達(dá)水稻植株(T2代)中本發(fā)明基因的Northern分析圖，其中WT指野生型對(duì)照，1-7、3-9、 9-8、10-2、11-6、12-2和16-1表示7個(gè)代表性的T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株。具體實(shí)驗(yàn)過程如下將本發(fā)明基因cDNA的全長編碼序列插入至一改建的pCambia1301載體中，置于玉米u(yù)biquitin基因啟動(dòng)子的控制之下，構(gòu)建超表達(dá)載體(ubiquitin::WRKY)，見圖3，然后將超表達(dá)載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入水稻(秀水11)的愈傷組織中。具體方法為成熟水稻種子用70%的乙醇進(jìn)行表面消毒1分鐘后，用20% (ν/ν)的次氯酸鈉消毒30分鐘， 在NBI培養(yǎng)基上培養(yǎng)(MS添加0. 5g L-1谷氨酰胺，0. 5g L-1脯氨酰胺，2. Omg L、4-D ；pH 5. 8)，約14天后長出愈傷，將愈傷組織剝下，置新的NBI培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4天后即可侵染；將含有ubiquitin: :WRKY的農(nóng)桿菌液均勻涂在固體YEP平板上培養(yǎng)2_3天，用無菌藥匙從平板上刮菌于液體共培養(yǎng)基(MS+2g廠1肌醇+0. 3g Γ1酪蛋白水解物+100 μ M乙酰丁香酮) 中至細(xì)胞濃度為3 X IO9Cfu mL—1，將愈傷放入菌中侵染20分鐘，將愈傷倒在干凈濾紙上吸干表面的菌液，移到Nbco培養(yǎng)基上培養(yǎng)(NBI培養(yǎng)基加ΙΟΟμΜ乙酰丁香酮)；培養(yǎng)2天后，將愈傷轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基NBs上培養(yǎng)(NBI培養(yǎng)基加500mg L—1頭孢霉素，30mg L—1潮霉素)； 等到愈傷出綠點(diǎn)后(約30天)移至分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基中添加2. Omg L—1 6_BAP、0. 5mg Γ1萘乙酸、30g Γ1山梨醇和30mg Γ1潮霉素)上培養(yǎng)。獲得的小苗即TO代轉(zhuǎn)基因植株種于溫室，TO代轉(zhuǎn)基因植株自交所得的種子長成的植株為Tl代，Tl代轉(zhuǎn)基因植株自交所得的種子長成的植株為Τ2代。Northern分析表明，T2代植株中本發(fā)明基因的表達(dá)較野生型明顯增強(qiáng)，如圖3的B部分所示。本發(fā)明基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的抗病評(píng)價(jià)采用T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株。圖4是本發(fā)明基因的超表達(dá)水稻植株(T2代)抗紋枯病分析圖，圖中WT指野生型對(duì)照，#3-9和 #10-2表示2個(gè)代表性的T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株。由圖4可見，超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)紋枯病菌的抗性菌明顯增強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因，其特征在于為如下(a)或(b)或(c)或(d) 所述的核苷酸序列(a)序列表中SEQID No 1的核苷酸序列；(b)編碼序列表中SEQID No 2的氨基酸殘基序列的核苷酸序列；(c)與序列表中SEQID No :1的核苷酸序列90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；(d)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID No 1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IXSSPE或0. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。
2.一種水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白，為以下(a)或(b)所述的氨基酸殘基序列(a)序列表中SEQID No 2所述的氨基酸殘基序列；(b)將(a)中的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白功能的由(a)衍生的氨基酸殘基序列；所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因的重組表達(dá)載體。
4.一種含有如權(quán)利要求1所述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.一種含有如權(quán)利要求1所述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因的工程菌。
6.一種如權(quán)利要求1所述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因在培育抗逆性植物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因在培育抗逆性植物中的應(yīng)用，其特征在于所述抗逆性植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子WRKY蛋白的基因及其表達(dá)載體與應(yīng)用。本發(fā)明基因在水稻根、莖、葉、花、穗等組織中有表達(dá)，根、花中表達(dá)豐度最高，其次為莖、葉，穗中的豐度低。本發(fā)明基因受茉莉酸、乙烯和水稻紋枯病菌誘導(dǎo)，而水楊酸則抑制其表達(dá)。本發(fā)明基因編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的T2代水稻植株對(duì)紋枯病的抗性增強(qiáng)，表明該基因是植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子，可以應(yīng)用于水稻等作物的抗病分子育種工程。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102260683SQ20111017510
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者何艷, 周平蘭, 唐新科, 彭喜旭, 王海華, 胡耀軍, 謝宗華, 鄧小波 申請(qǐng)人:湖南科技大學(xué)