專利名稱：一種浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA 的提取方法。
背景技術(shù)：
浮游動(dòng)物是食物鏈的次級(jí)生產(chǎn)者，在海洋食物網(wǎng)中處于承上啟下的樞紐位置，是海洋生物泵的主要驅(qū)動(dòng)者，對(duì)生源要素的生物地球化學(xué)循環(huán)作用顯著。因此，開展其攝食生態(tài)學(xué)研究對(duì)了解海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能，量化物質(zhì)和能量沿食物鏈的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，探討海域生物生產(chǎn)力水平及其變化規(guī)律具有重要意義。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，可突破“培養(yǎng)”環(huán)節(jié)，直接研究自然環(huán)境中浮游動(dòng)物的腸道食物組成及其攝食效率，明確其相應(yīng)功能反應(yīng)，準(zhǔn)確構(gòu)建現(xiàn)場(chǎng)浮游食物網(wǎng)的定性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而解析區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的功能和效率。這些研究都要以獲取高質(zhì)量浮游動(dòng)物腸道內(nèi)含物基因組DNA為前提。但是由于浮游動(dòng)物體表常附著有其他生物，因此要準(zhǔn)確獲得浮游動(dòng)物攝食狀況，首先要保證其體表無其他生物污染；要獲取高質(zhì)量的腸道DNA樣品，必須保證浮游動(dòng)物組織破碎完全，并且還許保證DNA裂解液能夠完全裂解浮游動(dòng)物的組織及其腸道內(nèi)含物，從而獲得高質(zhì)量的DNA。CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，具有沉淀核酸的特性；SDS使細(xì)胞裂解，使與DNA雙鏈緊密相連的組蛋白分開和變性；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，可抑制核酸酶的活性；蛋白酶K 水解蛋白質(zhì)，在SDS中穩(wěn)定，不受EDTA的抑制，反應(yīng)溫度一般為50-55°C，可以用于消化各種蛋白；Tri-HCl提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使核酸充分溶解，存在于液相中。氯仿去除變性的蛋白質(zhì)及多糖、脂類等雜質(zhì)。目前，尚無浮游動(dòng)物及腸道內(nèi)含物總基因組DNA提取方法的專利報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能從浮游動(dòng)物中提取浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA，并能最大限度的減少浮游動(dòng)物的腸道內(nèi)含物DNA量的損耗的浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA的提取方法。本發(fā)明的浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA的提取方法，包括以下步驟(a)將浮游動(dòng)物用中性魯格氏液固定，再將同一種類的固定好的浮游動(dòng)物分在一起，然后將固定好的同一種類的浮游動(dòng)物用無菌、且經(jīng)過0. 2 μ m濾膜過濾的海水反復(fù)沖洗浮游動(dòng)物的體表，直至體表無其他生物附著；取出浮游動(dòng)物，再用無菌超純水清洗，取出將水吸干，冰凍成塊，再研磨破碎；(b)將研磨破碎的浮游動(dòng)物用DNA裂解液裂解，55°C裂解2 48h，然后用常規(guī)方法提取裂解后溶液中的DNA，所得到的DNA即為浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA ；所述的DNA 裂解液為 Tris-HCl 10 50mM，SDS 5 10g/L，EDTA lOOmM，蛋白酶 K 200 500μ g/mL，其余為水，pH8. 0。提取得到的浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA可以通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，確保后續(xù)使用的是高質(zhì)量的DNA。所述的步驟(a)中的將浮游動(dòng)物冰凍成塊，優(yōu)選用液氮或低溫將其冰凍成塊，更優(yōu)選用用-80°C的超低溫冰凍，因?yàn)?. 5ml離心管用液氮冷凍的話，操作起來不方便，而且為了減少工作人員的危險(xiǎn)性，優(yōu)先選用-80冷凍。所述的步驟(b)將研磨破碎的浮游動(dòng)物用DNA裂解液裂解，優(yōu)選在55°C裂解48h， 所述的 DNA 裂解液為 iTris-HCl IOmM, SDS 5g/L, EDTA lOOmM，蛋白酶 K 200yg/mL，其余為水，pH8.0。該裂解液不但在此裂解條件下能夠很好的裂解浮游動(dòng)物組織及其腸道內(nèi)含物， 而且其用量少，并且不需要NaCl，因此比較經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明的中性魯格氏液屬于現(xiàn)有技術(shù)中的物品，其按照以下方法制備的每 IOOml的中性魯格氏液的配方碘5g，碘化鉀IOg和超純水100ml。分別稱取碘5g與碘化鉀10g，加入80ml超純水中，攪拌溶解后，定容至100ml。本發(fā)明將浮游動(dòng)物用中性魯格氏液固定，可以使浮游動(dòng)物的腸道內(nèi)含物不會(huì)排空和損失，從而保護(hù)腸道內(nèi)含物受到最小量的損耗，為提取浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物的總基因組DNA奠定了基礎(chǔ)，從而能真實(shí)的反應(yīng)浮游動(dòng)物的腸道內(nèi)含物的狀況。中性魯格氏液能夠很好的固定浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物并且不會(huì)對(duì)后續(xù)的DNA提取造成影響，而本發(fā)明人用甲醛固定浮游動(dòng)物后再提取DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA提取失敗。本發(fā)明用無菌的、且經(jīng)過0. 2 μ m濾膜過濾的海水反復(fù)輕柔沖洗浮游動(dòng)物體表，一般要沖3次以上，主要是為了將浮游動(dòng)物體表附著的其他生物沖洗掉，再用顯微鏡檢查，確保體表無其他生物附著，這是為了防止體表附著生物對(duì)腸道內(nèi)含物造成污染。無菌的海水用0. 2 μ m濾膜過濾，其作用不僅是除菌，還去除海水中所有大于0. 2 μ m的雜質(zhì)，包括細(xì)菌、 微藻、顆粒物、碎屑等，避免對(duì)提取DNA造成干擾。本發(fā)明用無菌的超純水沖洗經(jīng)無菌、且經(jīng)過0.2μπι濾膜過濾的海水將體表附著的其生物清洗干凈的浮游動(dòng)物，是為了確保浮游動(dòng)物身上的無菌過濾海水被沖洗干凈，以降低無菌過濾海水中鹽離子對(duì)DNA提取的影響。本發(fā)明用液氮或低溫將浮游動(dòng)物冰凍成塊，研磨破碎，其主要目的是為了將浮游動(dòng)物組織及其腸道內(nèi)含物充分破碎，使細(xì)胞在DNA裂解液中充分裂解，減少由于研磨不充分造成DNA產(chǎn)量的損耗。應(yīng)用本發(fā)明的DNA裂解液，經(jīng)合適的溫度和合適的時(shí)間，能夠有效的裂解破碎后的浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物，使核酸游離出來，然后再經(jīng)常規(guī)方法就可以從裂解液中提取出DNA。SDS可以在55°C 65°C下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；蛋白酶 K在SDS中穩(wěn)定，反應(yīng)溫度一般為50-55°C，可以用于消化各種蛋白；EDTA抑制DNA酶的活性，Tri-HCl提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。裂解溫度為55°C，裂解時(shí)間為2 48小時(shí)，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)DNA造成損傷，時(shí)間過短則使細(xì)胞裂解不完全。本發(fā)明根據(jù)浮游動(dòng)物的生理特征，利用中性魯格氏液固定浮游動(dòng)物，使得浮游動(dòng)物的腸道內(nèi)含物不會(huì)損失，再利用無菌、且經(jīng)過0. 2 μ m濾膜過濾的海水反復(fù)輕柔沖洗浮游動(dòng)物體表，去除浮游動(dòng)物體表附著的其他生物，從而避免體表附著的其他生物對(duì)浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物DNA的污染，然后再利用無菌超純水清洗浮游動(dòng)物，從而降低無菌過濾海水中鹽離子對(duì)DNA提取可能造成的影響，經(jīng)過充分的破碎后，用本發(fā)明的DNA裂解液裂解， 使得浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物中的DNA釋放游離于裂解液中，然后再經(jīng)常規(guī)方法，從裂解液中提取出DNA，即為浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物的總基因組DNA。因此本發(fā)明成功的實(shí)現(xiàn)了對(duì)浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物的總基因組DNA的提取，該方法可以最大限度的減少浮游動(dòng)物腸道內(nèi)含物DNA量的損耗，為準(zhǔn)確構(gòu)建現(xiàn)場(chǎng)浮游食物網(wǎng)的定性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而解析區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的功能和效率提供了高質(zhì)量的腸道內(nèi)含物DNA樣品。


圖1是實(shí)施例1用本發(fā)明的方法提取亞強(qiáng)真哲水蚤及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA 的電泳圖，其中1為Marker，2和3都為通過本發(fā)明的方法提取的亞強(qiáng)真哲水蚤及其腸道內(nèi)含物總基因組的DNA ；圖2是以實(shí)施例1用本發(fā)明的方法提取的亞強(qiáng)真哲水蚤及其腸道內(nèi)含物總基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中1為Marker，2為陰性對(duì)照，3是以亞強(qiáng)真哲水蚤及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的電泳圖，4是陽(yáng)性對(duì)照，是以三角褐指藻基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；圖3是實(shí)施例2中應(yīng)用本發(fā)明的方法提取的肥胖軟箭蟲(Flaccisagitta enflata)及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA電泳圖，其中1為Marker，2為肥胖軟箭蟲及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA;圖4是以肥胖軟箭蟲(Flaccisagitta enflata)及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA為模板進(jìn)行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中1為Marker，2為陰性對(duì)照，3是以肥胖箭蟲及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的電泳圖，4是陽(yáng)性對(duì)照，是以三角褐指藻基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 于2011年3月，用浮游動(dòng)物I型網(wǎng)在三亞珊瑚礁海區(qū)水平方向拖取浮游動(dòng)物，將浮游動(dòng)物用中性魯格氏液固定后，在體式顯微鏡下，用一次性塑料吸管進(jìn)行浮游動(dòng)物分選， 將相同種類分別放入1. 5ml滅菌離心管中，中性魯格氏液固定，4°C保存?zhèn)溆?。取固定好?0只亞強(qiáng)真哲水蚤Eucalanus subcrassus放到直徑3. 5cm的培養(yǎng)皿中，用經(jīng)過0. 2 μ m Mi 11 ipore膜過濾后的滅菌海水反復(fù)輕柔沖洗浮游動(dòng)物體表，顯微鏡檢查，確保體表無其他生物附著；取出浮游動(dòng)物，再用滅菌超純水清洗，以降低無菌過濾海水中鹽離子對(duì)DNA提取的影響，將浮游動(dòng)物轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，并將水吸干。將離心管置于_80°C超低溫冰箱中冷凍，IOmin后取出，立即用杵棒進(jìn)行碾磨破碎Ι-aiiin，重復(fù)以上操作3次；向離心管中加入 400 μ 1 DNA 裂解液(IOmMTris-HCl pH 8. 0,5g/L SDS，IOOmM EDTA ρΗ8· 0，200 μ gmL-1 proteinase K，其余為水，pH8. 0)，同時(shí)將杵棒的附作物進(jìn)行洗脫。然后在55°C水浴48h， 期間輕搖離心管3-5次；向離心管中加入66 μ 1 5MNaCl溶液；混勻后再加入66 μ 1經(jīng)56°C 預(yù)熱后的10% (質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的CTAB溶液，漩渦儀上振蕩混勻后，56°C水浴IOmin ；然后加入等體積的氯仿，混勻，12000rpm離心IOmin ；將上清轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中；用 Zymo DNA concentrator (購(gòu)自ZYMO RESEARCH公司，貨號(hào)為No :D4034)試劑盒進(jìn)行純化 (按照其說明書操作)，將純化后的DNA溶解于50 μ ITris-HCl (IOmM, pH8)中，-20°C保存。取4μ IDNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，其電泳圖如圖1所示，其中2和3的點(diǎn)樣孔中是本實(shí)施例提取獲得的DNA，由此可見，通過本發(fā)明的方法能從浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物中提取得到DNA。以提取到的DNA為模板，用18S rDNA通用引物(18SrDNA comFl GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGC ；18SrDNA comRl :CACCTACGGMACCTTGTTACGAC)，序列分別如 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2所示。對(duì)提取得到的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μ 1 :17. 375 μ 1 ddH20 ；2. 5 μ 1 Taq buffer ；2 μ IdNTP ；0. 125 μ 1 ExTaq ；引物 Fl 和 Rl 各 1 μ 1 ；模板 DNAl μ 1。擴(kuò)增條件為 94 0C 3min ；5 X (94 °C 20s ；52 °C 30s ；72 °C Imin) ；30 X (94 °C 20s ；56 °C 30s ；72 °C Imin)； 720C 7min ； 15°C forever ；擴(kuò)增片段為1. 81Λ。取4 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2所示， 其中2為陰性對(duì)照，3是以亞強(qiáng)真哲水蚤及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，4是陽(yáng)性對(duì)照，是以三角褐指藻基因組DNA為模板，以上述引物和體系進(jìn)行擴(kuò)增后，擴(kuò)增的產(chǎn)物的電泳圖。從圖中可以看出，用本實(shí)施例的方法可以成功提取得到亞強(qiáng)真哲水蚤及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA。實(shí)施例2 于2011年5月，用浮游動(dòng)物I型網(wǎng)在大亞灣海區(qū)水平方向拖取浮游動(dòng)物，將浮游動(dòng)物用中性魯格氏液固定后，在體式顯微鏡下，用一次性塑料吸管進(jìn)行浮游動(dòng)物分選，將相同種類分別放入1. 5ml滅菌離心管中，中性魯格氏液固定，4°C保存?zhèn)溆谩Ｈ」潭ê玫?20只肥胖軟箭蟲(Flaccisagitta enflata)放到直徑3. 5cm的培養(yǎng)皿中，用經(jīng)過0. 2 μ m Millipore膜過濾后的滅菌海水反復(fù)輕柔沖洗浮游動(dòng)物體表，顯微鏡檢查，確保體表無其他生物附著；取出浮游動(dòng)物，再用滅菌超純水清洗，以降低無菌過濾海水中鹽離子對(duì)DNA 提取的影響，將浮游動(dòng)物轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，并將水吸干。將離心管置于_80°C超低溫冰箱中冷凍，IOmin后取出，立即用杵棒進(jìn)行碾磨破碎l-2min，重復(fù)以上操作3次；向離心管中加入 500μ1 DNA 裂解液(50mM Tris-HCl pH8. 0，10g/L SDS, IOOmM EDTApH8. 0， 500 μ gmL-lproteinase K，其余為水，pH8. 0)，同時(shí)將杵棒的附作物進(jìn)行洗脫。然后在55°C 水浴池，期間輕搖離心管3-5次；冷卻aiiin后，加入氯仿-異戊醇04 1)至滿管，輕搖 2 3min，使兩者混合均勻；IOOOOrpm離心lOmin，與此同時(shí)，將600 μ 1的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；將上清夜轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30s，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；IOOOOrpm離心Imin后，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；60s后，直立離心管，加入720 μ 1 的體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇及80 μ 15Μ的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，用手指彈管尖，使沉淀與管底的 DNA塊狀物浮游于液體中；放置30min，使DNA塊狀物的不純物溶解；IOOOOrpm離心Imin后， 倒掉液體，再加入800 μ 1體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇，將DNA再洗30min ； IOOOOrpm離心30s后， 立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA(自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干)；加入50 μ 1 0. 5 X TE (含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37°C恒溫箱約 15h，使RNA消解；-20°C保存。取4 μ IDNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，其電泳圖如圖3所示，其中2點(diǎn)樣孔中是本實(shí)施例提取獲得的DNA，由此可見，通過本發(fā)明的方法能從浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物中提取得到DNA。用18S rDNA 通用引物(18SrDNA comFl GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGC ； 18SrDNAcomRl CACCTACGGAAACCTTGTTACGAC)對(duì)提取得到的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μ 1 17. 375 μ 1 ddH20 ；2. 5 μ 1 Taq buffer ；2 μ 1 dNTP ；0. 125 μ 1 ExTaq ；弓I 物 Fl 禾口 Rl 各 1 μ 1 ；模板 DNAl μ 1。擴(kuò)增條件為94 "C 3min ；5 X (94 "C 20s ；52 "C 30s ；72 "C Imin)； 30X (940C 20s ；56°C 30s ；72°C Imin) ；72°C 7min ；15°C forever ；擴(kuò)增片段理論為 1. 8bp，取 4μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖4所示，其中2為陰性對(duì)照，3是以肥胖箭蟲及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，4是陽(yáng)性對(duì)照，是以三角褐指藻基因組DNA為模板經(jīng)上述18s rDNA通用引物擴(kuò)增的產(chǎn)物的電泳圖。從圖中可以看出，用本實(shí)施例的方法可以成功提取得到肥胖箭蟲及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA。
權(quán)利要求
1.一種浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將浮游動(dòng)物用中性魯格氏液固定，再將同一種類的固定好的浮游動(dòng)物分在一起，然后將固定好的同一種類的浮游動(dòng)物用無菌、且經(jīng)過0. 2 μ m濾膜過濾的海水反復(fù)沖洗浮游動(dòng)物的體表，直至體表無其他生物附著；取出浮游動(dòng)物，再用無菌超純水清洗，取出將水吸干，冰凍成塊，再研磨破碎；(b)將研磨破碎的浮游動(dòng)物用DNA裂解液裂解，55°C裂解2 48h，然后用常規(guī)方法提取裂解后溶液中的DNA，所得到的DNA即為浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA ；所述的 DNA裂解液為 Tris-HCl 10 50mM，SDS 5 10g/L，EDTA lOOmM，蛋白酶K200 500μ g/mL，其余為水，pH8. 0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述的步驟(a)中將浮游動(dòng)物冰凍成塊，是用液氮或低溫將其冰凍成塊。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述的用低溫將浮游動(dòng)物冰凍成塊是用_80°C的超低溫冰凍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述的步驟(b)將研磨破碎的浮游動(dòng)物用DNA裂解液裂解，是在55°C裂解48h，所述的 DNA 裂解液為 iTris-HCl IOmM, SDS 5g/L, EDTA lOOmM，蛋白酶 K 200 μ g/mL，其余為水， ρΗ8· 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物總基因組DNA的提取方法。它是利用中性魯格氏液固定浮游動(dòng)物使得腸道內(nèi)含物不會(huì)損失，再利用無菌且經(jīng)過0.2μm濾膜過濾的海水沖洗其體表去除體表附著的其他生物，避免其對(duì)浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物DNA的污染，再用無菌超純水清洗降低海水中鹽離子對(duì)DNA提取造成的影響，經(jīng)破碎后用DNA裂解液裂解，使得浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物中的DNA釋放游離于裂解液中，然后再經(jīng)常規(guī)方法提取出浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物的總基因組DNA。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)浮游動(dòng)物及其腸道內(nèi)含物的總基因組DNA的提取，最大限度的減少浮游動(dòng)物腸道內(nèi)含物DNA量的損耗，為準(zhǔn)確構(gòu)建現(xiàn)場(chǎng)浮游食物網(wǎng)的定性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而解析區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的功能和效率提供了高質(zhì)量的DNA樣品。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102250882SQ201110175350
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者劉勝, 李濤, 林森杰, 胡思敏, 郭志靈 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所