專(zhuān)利名稱(chēng)：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的方法，是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體PBI121上，然后轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，侵染黃瓜，進(jìn)而得到轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，屬于農(nóng)業(yè)高新技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
目前，應(yīng)用較廣泛的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉通道法、顯微注射法、基因槍法、 離子束介導(dǎo)法等等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少、 轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而備受科學(xué)工作者的青睞。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法主要以植物的分生組織和生殖器官作為外源基因?qū)氲氖荏w，通過(guò)真空滲透法、浸蘸法及注射法等方法使農(nóng)桿菌與受體材料接觸，以完成可遺傳細(xì)胞的轉(zhuǎn)化， 然后利用組織培養(yǎng)的方法培育出轉(zhuǎn)基因植株，并通過(guò)抗生素篩選和分子檢測(cè)鑒定轉(zhuǎn)基因植株后代。黃瓜高效再生體系是實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，但當(dāng)前黃瓜再生體系并不成熟，植物組織培養(yǎng)在黃瓜育種中的應(yīng)用遠(yuǎn)沒(méi)有在花卉、果樹(shù)等園藝植物中那么廣泛。對(duì)黃瓜組織培養(yǎng)的研究主要集中在外植體種類(lèi)、苗齡、接種方式等方面，已經(jīng)建立的再生體系存在再生頻率低、再生周期長(zhǎng)、遺傳穩(wěn)定差的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。本發(fā)明的目的是在建立一套完整高效的黃瓜再生體系基礎(chǔ)上，進(jìn)而建立高轉(zhuǎn)化率的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，為創(chuàng)建黃瓜新種質(zhì)提供新途徑。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前現(xiàn)有技術(shù)存在的黃瓜中基因轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題，建立高轉(zhuǎn)化率的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的方法，包括以下步驟
1)選取6 7d苗齡、兩片子葉張開(kāi)呈豎直狀態(tài)的無(wú)菌黃瓜幼苗，切取連帶下胚軸2 mm 子葉，去除生長(zhǎng)點(diǎn)，從下胚軸處縱切為二，切除子葉末端1/3部分，并切除葉緣得到外植體子葉節(jié)；將子葉節(jié)平鋪于分化培養(yǎng)基[MS + 1.5 1. 7 mg -Γ1 6-芐基腺膘呤(6-BA)]上置于黑暗中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2 d；
2)把經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的子葉節(jié)浸沒(méi)在農(nóng)桿菌懸浮液中15 20min ；侵染結(jié)束后用無(wú)菌紙吸干子葉節(jié)表面殘留的菌液，將子葉節(jié)置于分化培養(yǎng)基(MS + 1.5 1. 7 rng-L-1 6_BA)上于黑暗中進(jìn)行共培養(yǎng)纊3 d；
3)共培養(yǎng)結(jié)束后，用含有250mg · L—1羧芐青霉素(Cb)的液體MS培養(yǎng)基洗凈子葉節(jié)表面農(nóng)桿菌，用無(wú)菌紙吸干子葉節(jié)表面的液體；
4)將上述處理好的子葉節(jié)接種到分化及選擇培養(yǎng)基(MS+ 1.5 1. 7 mg · Γ1 BA +100^150 mg · L—1 Kan + 250 mg · L—1 Cb)上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)不定芽；待不定芽長(zhǎng)至1. 5 2 cm高時(shí)，將其從子葉節(jié)基部切下，接種到生根培養(yǎng)基(MS + 50mg · Γ1 Kan)上進(jìn)行生根培養(yǎng)。當(dāng)不定芽基部產(chǎn)生大量須根，逐步開(kāi)啟封口膜，煉苗一周后移栽入土。緩苗后，長(zhǎng)出2 3片新葉時(shí)，提取所得黃瓜幼苗新葉的DNA和RNA，進(jìn)行PCR鑒定，再通過(guò)RT-PCR檢測(cè)所得株系的表達(dá)情況，進(jìn)一步確定獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株。鑒定結(jié)果表明使用本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法所得轉(zhuǎn)基因黃瓜幼苗植株轉(zhuǎn)化率高達(dá)4. 8%。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)
1.外植體易得本發(fā)明所用外植體為黃瓜無(wú)菌苗子葉節(jié)，材料易得。2.再生頻率高本發(fā)明條件下，以子葉節(jié)為外植體，其再生頻率高達(dá)94. 3%;上胚軸再生頻率為21 %;而下胚軸、子葉、真葉不能產(chǎn)生不定芽。3.轉(zhuǎn)化體系步驟簡(jiǎn)單本發(fā)明條件下，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染及共培養(yǎng)、選擇及分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等步驟，不必經(jīng)過(guò)啟動(dòng)培養(yǎng)、芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)等步驟，簡(jiǎn)化了程序，操作簡(jiǎn)單。4.轉(zhuǎn)化效率高本發(fā)明條件下，使用150 mg · L^Kan (卡那霉素)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因株系篩選，所得轉(zhuǎn)基因黃瓜幼苗植株轉(zhuǎn)化率高達(dá)4. 8%。

圖1為外植體子葉節(jié)獲得流程圖
圖中(1)6 7 d苗齡、兩片子葉張開(kāi)呈豎直狀態(tài)的無(wú)菌黃瓜幼苗，1子葉，2生長(zhǎng)點(diǎn)，3 下胚軸；(2)切取大部分下胚軸，上留2 mm下胚軸3 ； (3)切取連帶下胚軸2 mm子葉；(4) 去除生長(zhǎng)點(diǎn)2 ;(5)從下胚軸處縱切為二；(6)切除子葉末端1/3部分；(7)切除子葉末端 1/3部分后的子葉節(jié)；(8)切除葉緣；(9)切除葉緣后的子葉節(jié)圖2為pBI121載體結(jié)構(gòu)示意3為轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖
圖中泳道1-12為轉(zhuǎn)基因黃瓜植株；泳道N為未轉(zhuǎn)基因植株，作為陰性對(duì)照；泳道M為 DL 2, 000ΤΜ DNA Marker ；泳道P為質(zhì)粒pBI121的質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果，作為陽(yáng)性對(duì)照
圖4為轉(zhuǎn)基因植株磷脂酶Da基因的相對(duì)表達(dá)量示意圖
圖中橫坐標(biāo)Control為未轉(zhuǎn)基因黃瓜植株；T1-T5為轉(zhuǎn)基因黃瓜植株
(五)具體實(shí)施方案
實(shí)施例1 依照發(fā)明步驟
1.挑選成熟飽滿(mǎn)的‘新泰密刺’黃瓜種子用70-75% (V:V)乙醇浸泡消毒30 s，再用 4 %(V:V)NaaO浸泡消毒20 min，無(wú)菌水沖凈后播種于大量元素和蔗糖含量減半的1/2 MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為每天光照16 h，光照強(qiáng)度1600-1800 lux，培養(yǎng)溫度為(25士 1) °C;
2.選取6 7d苗齡、兩片子葉張開(kāi)呈豎直狀態(tài)的無(wú)菌黃瓜幼苗(1)，切取連帶下胚軸2 mm子葉(2)，去除生長(zhǎng)點(diǎn)(3)，從下胚軸處縱切為二(4)，切除子葉末端部分的1/3 (5，6)，并切除葉緣(7)，得外植體子葉節(jié)(8)，平鋪到添加分化培養(yǎng)基(MS+1. 5 mg 6-ΒΑ)上，置于黑暗中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2 d，預(yù)培養(yǎng)溫度為(25士 1) 0C ；
3.農(nóng)桿菌懸浮液制備所用農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404，質(zhì)粒為pBI121。LBA4404具有利福平(Rifampicin，Rif )和鏈霉素(St印tomycin，Stre)抗性。pBI121中包含篩選基因NPT II，具有Kan抗性，長(zhǎng)977 bp的cuPLD α基因反向插入35S啟動(dòng)子的下游(圖 2)。農(nóng)桿菌每次使用前活化，取1 ml農(nóng)桿菌菌液加入Rif >Stre濃度均為50 mg-L"1的 LB培養(yǎng)基中，37 0C下10(Tll0 rpm震蕩過(guò)夜，農(nóng)桿菌菌液濃度達(dá)到0D_ = 0. Ο. 6時(shí)停止震蕩，將農(nóng)桿菌菌液置于滅菌的離心管中，10000 r/min離心3 min，濾去上清液，用與上清液相同體積的MS液體培養(yǎng)基溶解附著于離心管壁上的農(nóng)桿菌制成農(nóng)桿菌懸浮液。4.把預(yù)培養(yǎng)的外植體子葉節(jié)浸沒(méi)在上述農(nóng)桿菌懸浮液中15 20 min，侵染結(jié)束后用無(wú)菌紙吸干外植體表面殘留的菌液，將外植體子葉節(jié)置于分化培養(yǎng)基(MS+1. 5 mg · L—1 6-BA)上，放于黑暗中進(jìn)行共培養(yǎng)2 3 d；
5.共培養(yǎng)結(jié)束后，用含有250mg 羧芐青霉素(Cb)的液體MS培養(yǎng)基洗凈外植體表面農(nóng)桿菌，用無(wú)菌紙吸干外植體表面的液體。將處理好的外植體接種到分化及選擇培養(yǎng)基(MS + 1. 5 mg · Γ1 6-ΒΑ +150 mg · Γ1 Kan + 250 mg · Γ1 Cb)上，進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，每 10 15 d繼代一次，大約需要25 30 d；
6.當(dāng)不定芽長(zhǎng)至1.5 2cm高時(shí)，將其從外植體基部切下，接種到生根培養(yǎng)基(MS + 50 mg · L-I Kan)上，進(jìn)行生根培養(yǎng)，大約需要20 25d ；
7.當(dāng)不定芽基部產(chǎn)生大量須根，逐步開(kāi)啟封口膜，煉苗一周后移栽入土。8.緩苗后，幼苗長(zhǎng)出2 3片新葉時(shí)，提取所得黃瓜幼苗新葉的DNA和RNA，進(jìn)行PCR 鑒定，再進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)所得株系的表達(dá)情況，進(jìn)一步確定獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，轉(zhuǎn)化率高達(dá)4. 8%ο實(shí)施例2 該實(shí)施例中，其轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例1，不同的是預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)分化培養(yǎng)基為 MS+1. 5 mg · L—1 6-BA，分化及選擇培養(yǎng)基為 MS + 1. 5 mg · L—1 6-BA +100 mg · L—1 Kan + 250 mg · L-1 Cb0實(shí)施例3 該實(shí)施例中，其轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例1，不同的是預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)分化培養(yǎng)基為 MS+1. 67 mg · L—1 6-BA，分化及選擇培養(yǎng)基為 MS + 1. 67 mg · L—1 6-BA +100 mg · L—1 Kan + 250 mg · L-1 Cb0實(shí)施例4 該實(shí)施例中，其轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例1，不同的是預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)分化培養(yǎng)基為 MS+1. 5 mg · L—1 6-BA，分化及選擇培養(yǎng)基為 MS + 1. 5 mg · L—1 6-BA +120 mg · L—1 Kan + 250 mg · L-1 Cb0
采用本發(fā)明獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，不必經(jīng)過(guò)啟動(dòng)培養(yǎng)、芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)等步驟，簡(jiǎn)化了程序，操作簡(jiǎn)單；以子葉節(jié)為外植體，其再生頻率高達(dá)94. 3%;上胚軸再生頻率為21 %;使用 150 mg · L-1Kan進(jìn)行轉(zhuǎn)基因株系篩選，所得轉(zhuǎn)基因黃瓜幼苗植株轉(zhuǎn)化率高達(dá)4. 8%。
權(quán)利要求
1. 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的方法，其特征在于包括以下步驟1)選取6 7d苗齡、兩片子葉張開(kāi)呈豎直狀態(tài)的無(wú)菌黃瓜幼苗，切取連帶下胚軸2 mm 子葉，去除生長(zhǎng)點(diǎn)，從下胚軸處縱切為二，切除子葉末端1/3部分，并切除葉緣得到外植體子葉節(jié)；將子葉節(jié)平鋪于分化培養(yǎng)基MS + 1.5^1.7 rng-L-1 6-BA上置于黑暗中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng) 2 d ；2)把經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的子葉節(jié)浸沒(méi)在農(nóng)桿菌懸浮液中15 20min ；侵染結(jié)束后用無(wú)菌紙吸干子葉節(jié)表面殘留的菌液，將子葉節(jié)置于分化培養(yǎng)基MS + 1.5^1.7 rng-L-1 6-BA上置于黑暗中進(jìn)行共培養(yǎng)纊3 d；3)共培養(yǎng)結(jié)束后，用含有250mg - Γ1 Cb的液體MS培養(yǎng)基洗凈外植體表面農(nóng)桿菌， 用無(wú)菌紙吸干子葉節(jié)表面的液體；4)將上述處理好的子葉節(jié)接種到分化及選擇培養(yǎng)基MS+ 1.5^1.7 mg · Γ1 BA +100^150 mg · L—1 Kan + 250 mg · L—1 Cb上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)不定芽；待不定芽長(zhǎng)至1. 5 2 cm高時(shí)，將其從子葉節(jié)基部切下，接種到生根培養(yǎng)基MS + 50mg -L"1 Kan上進(jìn)行生根培養(yǎng)； 當(dāng)不定芽基部產(chǎn)生大量須根，逐步開(kāi)啟封口膜，煉苗一周后移栽入土。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的方法，是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI121上，然后轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，侵染黃瓜，進(jìn)而得到轉(zhuǎn)基因黃瓜植株。主要包括以下步驟外植體準(zhǔn)備、預(yù)培養(yǎng)、侵染及共培養(yǎng)、選擇及分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等步驟，通過(guò)PCR鑒定所得株系是否呈陽(yáng)性，再通過(guò)RT-PCR檢測(cè)所得株系的表達(dá)情況，進(jìn)一步確定獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株。本發(fā)明是針對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，具有外植體易得、再生和轉(zhuǎn)化頻率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為創(chuàng)建黃瓜新種質(zhì)提供新途徑。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102260706SQ20111017794
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者史慶華, 張守杰, 楊鳳娟, 潘玲玲, 王秀峰, 王靜, 魏珉 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)