專利名稱：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本誘導(dǎo)方法能利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)定向分化為肝細(xì)胞。
背景技術(shù)：
目前多應(yīng)用胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞。但胚胎干細(xì)胞存在培養(yǎng)擴(kuò)增難度大，成瘤性強(qiáng)，并存在倫理問題等；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源受限，擴(kuò)增難度大，而且對供者存在一定的損傷。因此誘導(dǎo)后的肝細(xì)胞來應(yīng)用受限，無法滿足大量需求，比如用于替代治療肝臟疾病，以及進(jìn)行細(xì)胞藥物的篩選。目前的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向肝細(xì)胞分化的技術(shù)存在一定的缺陷和不足，比如分化成本過高，分化效率不高等等，不利于細(xì)胞分化過程的產(chǎn)業(yè)化、將來的藥物篩選和臨床使用。本分化方法通過對現(xiàn)有的階段誘導(dǎo)法的誘導(dǎo)培養(yǎng)順序和培養(yǎng)體系的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)不需要應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長因子，只用表皮生長因子聯(lián)合肝細(xì)胞生長因子，即可將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，大大降低了分化成本。而且經(jīng)過本方法的分化培養(yǎng)，間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的效率能達(dá)到99%以上， 非常有利于后續(xù)的分化后的細(xì)胞的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決用來誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的干細(xì)胞密切相關(guān)的問題，例如安全性、增殖能力、細(xì)胞來源，本方法采用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)作為誘導(dǎo)培養(yǎng)的干細(xì)胞，包括人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和誘導(dǎo)兩部分。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來自于遺棄的臍帶，不存在倫理問題；利用不同于傳統(tǒng)酶消化法的細(xì)胞爬片方法分離得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多潛能性、增殖性強(qiáng)；低免疫原性； 易產(chǎn)業(yè)化和臨床使用。不采用消化酶的一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離方法，其不采用消化酶，避免了 MSCs分離過程中，消化酶對臍帶MSCs引入動物源蛋白和動物源病原物的污染風(fēng)險(xiǎn)，且最大限度的保持了干細(xì)胞原有的生物特性和活性，細(xì)胞生長速度快，有利于其在后期研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更明顯穩(wěn)定的作用。正常的情況下，動物組織器官內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)組織器官受到損傷后，大量的炎性因子的釋放，會激活間充質(zhì)干細(xì)胞，促使其活化、增殖、趨化聚集到損傷部位，釋放大量的細(xì)胞因子，發(fā)揮修復(fù)和再生的作用。本發(fā)明利用此原理，將臍帶組織粉碎成小塊，就會產(chǎn)生細(xì)胞損傷，釋放炎性因子，從而活化臍帶組織內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞，促使間充質(zhì)干細(xì)胞趨化聚集到組織小塊的周圍，通過培養(yǎng)，可獲得大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，而且細(xì)胞的生物特性和活性保持良好。與現(xiàn)有的酶消化法相比，本方法的優(yōu)點(diǎn)為操作簡單快捷，避免了分離過程中膠原酶對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的損傷作用以及動物源膠原酶中引入動物源蛋白和病原物的污染風(fēng)險(xiǎn)。還避免了酶消化過程中消化時間過長影響破壞細(xì)胞的活性，消化時間過短影響細(xì)胞得率這一問題。本發(fā)明中，臍帶被均勻粉碎為直徑1-1. 5mm的小塊，使得每小塊臍帶在相同的條件下，獲得的MSCs均衡一致，利用本發(fā)明的方法，每根臍帶被分成大量均一小塊臍帶，每個培養(yǎng)皿中接種14至16小塊，可接種多個培養(yǎng)皿，五天后每個培養(yǎng)皿中的MSCs會大量繁殖增生，在培養(yǎng)皿中臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融合。對比現(xiàn)有的酶消化法，同樣數(shù)量的臍帶，本發(fā)明可獲得更多的MSCs。本發(fā)明的方法對比現(xiàn)有的酶消化法，不用選擇消化酶，不用控制消化時間，操作更簡便，保持了細(xì)胞原有活性及生長狀態(tài)，大大提高了 MSCs得率，并能夠長時間保存而不失其活性，解決此類資源得不到高效利用的現(xiàn)狀，保證了臨床應(yīng)用中干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。通過爬片方法從臍帶中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)記， 傳代培養(yǎng)至第3代。使用階段誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MSC向肝細(xì)胞分化首先使用含2%的!^etal bovin serum (FBS) U0"8mol/L 的地塞米松(DXM)、50ng/ml 的 HGF (肝細(xì)胞生長因子)、IOng/ ml的EGF(表皮生長因子)、1% ITSQ5g/L胰島素、25g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、25mg/L亞硒酸鈉)的 DMEM-F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2周；然后，使用含2%的FBS、20ng/ml的OSM (抑瘤素)、10_6mOl/ L的DXM、1 % ITS的DMEM-F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。以含10 % FBS的DMEM-F12培養(yǎng)的MSC 作為陰性對照。本誘導(dǎo)方法能充分高效的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化，解決大量應(yīng)用所需誘導(dǎo)后的肝細(xì)胞來源問題。


圖IhUC-MSCs在向肝細(xì)胞分化的過程中形態(tài)變化。㈧沒開始分化的hUC-MSCs的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(40X) ； (B)分化培養(yǎng)的一周后，hUC-MSCs的形態(tài)開始發(fā)生變化(40X)； (C)分化培養(yǎng)三周后，部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞變成圓形或者橢圓形G0X) ； (D)分化培養(yǎng)第四周，hUC-MSCs的形態(tài)變?yōu)榈湫偷母渭?xì)胞樣，圓形或者橢圓形(100X)。圖2免疫熒光檢測法分別比較人Albumin (ALB)和CK-19的表達(dá)情況。在常規(guī)培養(yǎng)條件下臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)CK19 (A)和ALB (C)，但經(jīng)兩階段誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后的細(xì)胞則可見CK19(B)和ALB (D)的表達(dá)。圖3流式細(xì)胞儀檢測ALB表達(dá)明確誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的分化率，接近100%。A圖為在常規(guī)培養(yǎng)條件下的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞ALB表達(dá)情況；B圖為經(jīng)兩階段誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后的表達(dá)ALB的細(xì)胞比例。圖4分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的hUC-MSCs和未分化的hUC-MSCs，低密度脂蛋白吸收實(shí)驗(yàn)。(A)未分化的hUC-MSCs不能吸收LDL，而(B) hUC-MSCs在分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞后可以吸收LDL。圖5誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)2周以及誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后的間充質(zhì)干細(xì)胞流式檢測HLA-DR表達(dá)情況，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞均低水平表達(dá)HLA-DR。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1爬片分離技術(shù)獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取新生兒臍帶，通過下述步驟分離獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(1)將8g的NaCl、0. 2g 的KC1、1. 15g的Na2HP04、0. 2g的KH2P04用水定容為1L，制成磷酸緩沖液，以緩沖液反復(fù)沖洗臍帶，去除殘留的血液，獲得干凈臍帶；( 將干凈的臍帶粉碎，獲得大量臍帶組織塊； (3)再將獲得的臍帶組織塊濾過孔徑1. 5mm的粗濾網(wǎng)，收集粗濾網(wǎng)下的臍帶組織塊，去掉不符合要求的大臍帶組織塊，獲得直徑小于等于1. 5mm的小臍帶組織塊；(4)再將獲得的小臍組織帶塊濾過200目濾網(wǎng)，收集200目濾網(wǎng)上的臍帶組織塊，去掉不符合要求的過小的臍帶塊，獲得直徑為1-1. 5mm多個臍帶組織塊；( 直徑為1_1. 5mm臍帶塊在200目濾網(wǎng)上浙干液體后，將200目濾網(wǎng)上臍帶塊接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中；(6)不加培養(yǎng)液，直接放置于5% C02、 37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置三小時；(7)然后加入含20%牛血清、lOng/mL EGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液 5mL，置于5% C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，五天后，在培養(yǎng)皿中臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融合；(8)胰酶消化先用磷酸緩沖液清洗培養(yǎng)皿兩次，每次用量5mL，吸棄洗液， 吸取ImL的含0. 25%胰酶和0. 1 % EDTA的磷酸緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3_5分鐘，再將5mL含了 20%牛血清、lOng/mL EGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化液中；(9)消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，去掉臍帶塊，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的濾液；(10)將濾液在900rpm下離心5分鐘，去除上清，使用3mL的 D-MEM/F12培養(yǎng)液重新懸浮均勻細(xì)胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。所述的步驟O)中，粉碎采用剪切裝置粉碎。所述的剪切裝置為剪刀。所述的步驟(5)中，培養(yǎng)皿的規(guī)格為90mmX 16mm，每個培養(yǎng)皿中接種14至16個臍
帶塊，接種多個培養(yǎng)皿。所述的步驟(7)中，培養(yǎng)液D-MEM/F12中培養(yǎng)基D-MEM與營養(yǎng)成分F12的比例是 1 I0將通過爬片方法從臍帶中分離獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)記，確定其屬于間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將通過爬片方法從臍帶中分離獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代培養(yǎng)至第3代。使用階段誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MSC向肝細(xì)胞分化首先使用含2%的狗切1 bovin serum(FBS)、10_8mOl/L的地塞米松(DXM)、50ng/ml的HGF (肝細(xì)胞生長因子)、lOng/ml的EGF (表皮生長因子)、1 % ITS(25g/L胰島素、25g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、25mg/L亞硒酸鈉)的DMEM-F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2周， 然后，使用含 2% 的 FBS、20ng/ml 的 OSM(抑瘤素)、l(T6mol/L 的 DXM, 1 % ITS 的 DMEM-F12 培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。以含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)的MSC作為陰性對照。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞G09163在向肝細(xì)胞分化的過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了一系列變化。未分化的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；而誘導(dǎo)培養(yǎng)三周后， 部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)變成圓形或者橢圓形；隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的增加，更多的圓形細(xì)胞出現(xiàn)；分化培養(yǎng)四周后，間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)變?yōu)榈湫偷母渭?xì)胞樣，圓形或者橢圓形 (參見圖1)。肝樣細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測使用免疫熒光檢測法分別比較人Albumin(ALB)和 CK-19在間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)前后表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)Albumin和CK-19在誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞中有明顯表達(dá)，而在常規(guī)培養(yǎng)條件下臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中不表達(dá)(參見圖幻。此外，我們通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞表面ALB的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后，幾乎所有的細(xì)胞均表達(dá)ALB (參見圖3)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞后，低密度脂蛋白受體的表達(dá)是其標(biāo)志之一。因此，我們進(jìn)行了低密度脂蛋白(LDL)吸收檢測試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞可吸收低密度脂蛋白，具有肝細(xì)胞的功能；而未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞則不具備吸收低密度脂蛋
5白的功能(參見圖4)。 此外，我們還以流式細(xì)胞術(shù)檢測了誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)2周以及誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后的間充質(zhì)干細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞均低水平表達(dá)HLA-DR，說明間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后仍然具有低免疫原性水平。
權(quán)利要求
1.一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)方法，包括以細(xì)胞爬片技術(shù)提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并加入表皮生長因子、地塞米松、肝細(xì)胞生長因子、抑瘤素將所述細(xì)胞分階段定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其中所述分離培養(yǎng)的具體步驟為(1)將8g 的 NaCUO. 2g 的 KCl、1. 15g 的 Na2HP04、0. 2g 的 KH2P04 用水定容為 1L，制成磷酸緩沖液，以緩沖液反復(fù)沖洗臍帶，去除殘留的血液，獲得干凈臍帶；(2)將干凈的臍帶粉碎，獲得大量臍帶組織塊；(3)再將獲得的臍帶組織塊濾過孔徑1.5mm的粗濾網(wǎng)，收集粗濾網(wǎng)下的臍帶組織塊，去掉不符合要求的大臍帶組織塊，獲得直徑小于等于1. 5mm的小臍帶組織塊；(4)再將獲得的小臍組織帶塊濾過200目濾網(wǎng)，收集200目濾網(wǎng)上的臍帶組織塊，去掉不符合要求的過小的臍帶塊，獲得直徑為1-1. 5mm多個臍帶組織塊；(5)直徑為1-1.5mm臍帶塊在200目濾網(wǎng)上浙干液體后，將200目濾網(wǎng)上臍帶塊接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中；(6)不加培養(yǎng)液，直接放置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置三小時；(7)然后加入含20%牛血清、10ng/mLEGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液5mL，置于5% C02、37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，五天后，在培養(yǎng)皿中臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融合；(8)胰酶消化先用磷酸緩沖液清洗培養(yǎng)皿兩次，每次用量5mL，吸棄洗液，吸取ImL的含0. 25%胰酶和0. 1 % EDTA的磷酸緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3_5分鐘，再將5mL含了 20%牛血清、lOng/mL EGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化液中；(9)消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，去掉臍帶塊，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的濾液；(10)將濾液在900rpm下離心5分鐘，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培養(yǎng)液重新懸浮均勻細(xì)胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2所述的誘導(dǎo)方法，其中所述分階段定向誘導(dǎo)的具體步驟為(1)使用含2%的 Fetal bovin serum(FBQ、10_8mol/L 的地塞米松(DXM)、50ng/ml 的 HGF (肝細(xì)胞生長因子)、10ng/ml的EGF (表皮生長因子)1 % ITS (25g/L胰島素、25g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、25mg/L亞硒酸鈉)的DMEM-F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2周；(2)使用含2% 的 FBS、20ng/ml 的 OSM(抑瘤素)、lO—mol/L 的 DXM、1 % ITS 的 DMEM-F12 培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。更具體的，本發(fā)明提供了一種將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的方法。更具體的，本發(fā)明涉及一種以細(xì)胞爬片技術(shù)從遺棄的臍帶中提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并通過添加表皮生長因子、地塞米松、肝細(xì)胞生長因子、抑瘤素等，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分階段定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的方法。
文檔編號C12N5/071GK102250829SQ20111017953
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者劉廣洋, 劉擁軍, 朱德琳, 王漢裕, 趙婷婷 申請人:天津和澤干細(xì)胞科技有限公司