專利名稱：Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酸脫氫酶突變基因及其應(yīng)用，尤其涉及將來(lái)源于琉璃苣(Borage officinalis)的Δ-6脂肪酸脫氫酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因、含有該突變基因的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，本發(fā)明還涉及它們?cè)谥苽浠蜣D(zhuǎn)化Y-亞麻酸(GLA)中的應(yīng)用，屬于△-6脂肪酸脫氫酶突變基因及其應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Y-亞麻酸(y-Iinolenic acid, GLA, 18:3)是一種n_6多不飽和脂肪酸，具有廣泛的生物學(xué)功能，它與多種影響健康和慢性疾病的生理過(guò)程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，飲食中添加￥-亞麻酸出1^，18:3 n-6)可以抑制體內(nèi)平滑肌細(xì)胞增殖，推遲apoE敲除小鼠飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展(Fan YY, Ramos KS, Chapkin RS. Dietary gamma-Iinolenic acid suppresses aortic smooth muscle cell proliferation and modifies atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice. J Nutr 2001 ; 131 :1675-1681.),改變細(xì)胞表面的粘附分子從而抑制人腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)力和侵襲力(Jiang WG, Hiscox S，Hallett MB,Scott C,Horrobin DF,Puntis MC. Inhibition of hepatocyte growth factor-induced motility and in vitro invasion of human colon cancer cells by gamma-Iinolenic acid. Br. J Cancer 1995 ；71 :744-752.)。y-亞麻酸(GLA)還具有降低凝血反應(yīng)、預(yù)防血栓形成、抗癌、防止鈣流失等作用。GLA是人體和動(dòng)物飲食中具有營(yíng)養(yǎng)作用的重要的多不飽和脂肪酸。Δ-6脂肪酸脫氫酶最先在藍(lán)藻(Synechocystis)中克隆得到(Reddy AS, Nuccio ML, Gross LM, Thomas TL. Isolation of a delta 6—desaturase gene from the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803by gain-of-function expression in Anabaena sp. strain PCC 7120. Plant Mol. Biol. 1993 ;22 :293-300.)，隨后又相繼在琉璃苣(Borage officinalis) (Sayanova 0, Smith MA, Lapinskas P, Stobart AK, Dobson G, Christie WW, Shewry PR, Napier JA. Expression of a borage desaturase cDNA containing an N-terminal cytochrome b5 domain results in the accumulation of high levels of delta6-desaturated fatty acids in transgenic tobacco. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A 1997；94 :4211-4216.)> ^ ^ (Caenorhabditis elegans)(Napier JA, Hey SJ, Lacey DJ, Shewry PR. Identification of a Caenorhabditis elegans Delta6-fatty-acid-desaturase by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J 1998 ；330 (Pt 2) :611-614.) ,AM (Cho HP, Nakamura MT, Clarke SD.Cloning, expression, and nutritional regulation of the mammalian Delta-6 desaturase. J Biol.Chem. 1999 ；274 :471-477.)> 小鼠(Cho HP, Nakamura MT，Clarke SD.Cloning, expression, and nutritional regulation of the mammalian Delta-6 desaturase. J Biol. Chem. 1999 ；274 :471-477.)禾口大鼠(Aki T， Shimada Y, Inagaki K, Higashimoto H, Kawamoto S, Shigeta S, Ono K, Suzuki 0. Molecular cloning andfunctional characterization of rat delta-6 fatty acid desaturase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999 ；255 :575-579.)中用與 Synechocystis Δ-6 脂肪酸脫氫酶或其它脫氫酶的同源的序列克隆得到。Δ-6脂肪酸脫氫酶作用是在脂肪酸羧基端和已存在的雙鍵之間引入另一個(gè)雙鍵， 如催化亞油酸(LA，18:2 n-6)和α -亞麻酸(LNA，18:3 n_3)脫氫分別生成Y-亞麻酸 (GLA，18:3 n-6)和十八碳四烯酸(0ΤΑ，18:4 η-3)。Δ-6脂肪酸脫氫酶是動(dòng)物體內(nèi)將亞油酸轉(zhuǎn)化為Y-亞麻酸(GLA)的關(guān)鍵酶。其活性降低將導(dǎo)致GLA的含量減少，并隨之引起一系列健康問(wèn)題。目前，Y-亞麻酸(GLA)的主要來(lái)源是植物油，如琉璃苣(Borage officinalis, 20-26 % GLA)、月見(jiàn)草(Oenoethera biennis L，8-12 % GLA)、黑加侖(Ribes nigrum, 15-18%)等(Kapoor R,Huang YS. Gamma linolenic acid -.an antiinflammatory omega-6 fatty acid. Curr. Pharm. Biotechnol. 2006 ；7 :531-534.)。但這些天然來(lái)源的 GLA 作為食物補(bǔ)充，存在生產(chǎn)純化費(fèi)用高、口味氣味不佳、有效性波動(dòng)大等缺陷。從天然產(chǎn)生Y-亞麻酸的物種中(如從琉璃苣中)獲取其基因，將其密碼子優(yōu)化后轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)將具有重要意義。在分析Genebank上琉璃苣(Borago officinalis)的Δ-6脂肪酸脫氫酶基因的cDNA序列(U79010)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其使用的許多密碼子為哺乳動(dòng)物的稀有密碼子或中度使用頻率的密碼子，直接采用此序列可能對(duì)哺乳動(dòng)物表達(dá)不利。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子可以有多個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)物種具有密碼子偏愛(ài)性，即不同物種對(duì)密碼子的使用頻率是不同的，有些密碼子甚至從來(lái)不使用，那些不經(jīng)常使用甚至從不使用的密碼子稱為稀有密碼子或非偏愛(ài)型密碼子。非偏愛(ài)型密碼子形成的原因主要是細(xì)胞內(nèi)缺乏識(shí)別這些密碼子的tRNA。對(duì)于不同的表達(dá)系統(tǒng)，如畢赤酵母和大腸桿菌，其密碼子偏好性是不同的。若外源基因含有較多的宿主菌非偏愛(ài)型密碼子，尤其是連續(xù)出現(xiàn)的話，將會(huì)嚴(yán)重影響其在宿主菌中的表達(dá)量。為了消除稀有密碼子對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，可采用對(duì)異源基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化來(lái)實(shí)現(xiàn)，即在不改變外源基因氨基酸序列的情況下，將外源基因中的稀有密碼子替換為宿主常用的密碼子。該方法具有簡(jiǎn)單易行， 重復(fù)性好的特點(diǎn)，得到了廣泛的使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是將來(lái)源于琉璃苣(Borage officinalis)的Δ -6脂肪酸脫氫酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到一種適合在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高效表達(dá)的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因。本發(fā)明目的之二是將所獲得的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因應(yīng)用于制備Y-亞麻酸或提高人體或哺乳動(dòng)物體內(nèi)Y-亞麻酸的含量。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明將來(lái)源于琉璃苣(Borage officinalis)的Δ-6脂肪酸脫氫酶基因在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量的調(diào)整，不穩(wěn)定序列的刪除等影響因素，按照人的密碼子偏愛(ài)性將其改為高度或中度使用頻率的密碼子，此外，還在起始密碼子ATG上游添加了 kozak序列，更有利于突變基因在真核細(xì)胞中表達(dá)，優(yōu)化后所得到的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因(命名為Delta6基因)，其核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示(其編碼的多肽為SEQ ID N0:2所示)。密碼子優(yōu)化后的Delta6基因與原Δ-6脂肪酸脫氫酶基因編碼區(qū)進(jìn)行比對(duì)，其一致度達(dá)86. 7 %，原序列GC含量為39. 2 %，密碼子優(yōu)化后序列GC含量提高為51. 1%。此外，與SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸序列，并且該核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)也具有△-6脂肪酸脫氫酶的功能，那么該核苷酸序列也包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。含有SEQ ID NO. 1所示突變基因的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞株也當(dāng)然屬于本發(fā)明的保護(hù)范疇之列?？梢詫⒈景l(fā)明Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因(Delta6基因)與真核載體可操作性的相連接，構(gòu)建得到重組真核表達(dá)載體；為獲得突變基因的高水平表達(dá)，通常將所述突變基因亞克隆到含有用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子和(如果對(duì)于編碼蛋白的核酸而言)用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)載體。載體視情況包含含有至少一個(gè)獨(dú)立的終止子序列的一般表達(dá)盒、允許在真核生物中復(fù)制表達(dá)盒的序列(包括(但不限于) 穿梭載體)和用于真核生物系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。參看Giliman & Smith，Gene 8 :81(1979)； Roberts·入，Nature, 328 :731 (1987) ；Schneider, B.等)κ, Protein Expr. Purif. 6435 10(1995) ；Ausubel, Sambrook, Berger0作為本發(fā)明的一個(gè)較優(yōu)的實(shí)施方式，所述的重組真核表達(dá)載體可以是含有Δ-6 脂肪酸脫氫酶突變基因和綠色熒光蛋白基因序列的真核表達(dá)載體PIRES2-ACGFP1-Delta6， 其中，所述Delta6的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。將含有Delta6基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，即獲得含有Delta6基因的重組宿主細(xì)胞株；其中所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如HEK293細(xì)胞等)。可通過(guò)各種方式將Delta6基因?qū)氲秸婧思?xì)胞中，這些方法包括將受體細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、電穿孔法、拋射物轟擊以及病毒載體注射等。一旦建立了重組宿主細(xì)胞菌株(即，將表達(dá)構(gòu)載體引入了宿主細(xì)胞且分離具有合適表達(dá)構(gòu)筑體的宿主細(xì)胞)，則在適于產(chǎn)生△ -6脂肪酸脫氫酶的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞菌株。這些方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員是所熟知，培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞菌株的方法依賴于所用表達(dá)載體的性質(zhì)和宿主細(xì)胞本身。重組宿主菌株通常使用所屬領(lǐng)域眾所周知的方法培養(yǎng)。重組宿主細(xì)胞株通常培養(yǎng)于含有碳、氮和無(wú)機(jī)鹽的可吸收源和視情況含有維生素、氨基酸、生長(zhǎng)因子及其它所屬領(lǐng)域眾所周知的蛋白培養(yǎng)添加物的液體培養(yǎng)基中。用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有抗生素和抗真菌素以防止不希望的微生物生長(zhǎng)和/ 或包括(但不限于)抗生素的化合物以選擇含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。重組宿主細(xì)胞可以分批或連續(xù)方式培養(yǎng)，同時(shí)以分批或連續(xù)方式收集細(xì)胞(在其中hGH多肽累積于細(xì)胞中的情形下)或收集培養(yǎng)上清液。在添加底物亞油酸的條件下，本發(fā)明通過(guò)氣相色譜方法對(duì)所獲得的重組宿主細(xì)胞株進(jìn)行脂肪酸成分分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組宿主細(xì)胞中Y-亞麻酸(GLA)水平有顯著增加，這表明除了內(nèi)源性的△-6脫氫酶外，所轉(zhuǎn)入的密碼子優(yōu)化的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是有活性的，催化底物亞油酸生成Y-亞麻酸(GLA)。因此，通過(guò)基因工程技術(shù)在動(dòng)物細(xì)胞中引入本發(fā)明的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因，可以實(shí)現(xiàn)下游長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的調(diào)控或促進(jìn)Y-亞麻酸的生物轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因(即Delta6基因)可以有以下方面的應(yīng)用1、制備Δ-6脂肪酸脫氫酶構(gòu)建含有本發(fā)明Delta6基因的真核表達(dá)載體；將所構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，收集并純化所表達(dá)的蛋白。2、一種提高人或哺乳動(dòng)物體內(nèi)Y -亞麻酸的含量的方法，包括將本發(fā)明Delta6 基因?qū)氲饺嘶虿溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。定義本發(fā)明不限于本文中所述的特定方法、實(shí)驗(yàn)方案、細(xì)胞系和試劑。也應(yīng)了解本文中所用的方法是僅用于描述特定實(shí)施例的目的，且并不意欲限制本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的范疇將僅由隨附權(quán)利要求書所限制。除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞株”或“宿主細(xì)胞”意指包括外源性多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術(shù)語(yǔ)“核酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮口， 針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語(yǔ)適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語(yǔ)涵蓋任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其包括全長(zhǎng)蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”意指天然產(chǎn)生及非天然產(chǎn)生氨基酸，以及以類似于天然產(chǎn)生氨基酸的方式發(fā)揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬劑。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針將雜交到核酸的復(fù)合混合物(包括(但不限于)總細(xì)胞或文庫(kù)DNA 或RNA)中的其目標(biāo)子序列上，但并不雜交到復(fù)合混合物中的其它序列上。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中將有所不同。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)于 Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes, " Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中。PiSH牛ifi胃被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)(因?yàn)槟繕?biāo)序列過(guò)量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件其中在PH7. 0到8. 3下鹽濃度低于約1. OM鈉離子濃度，通常為約0. 01到 1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)而言為至少約30°C，而對(duì)于長(zhǎng)探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過(guò)加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下50%甲酰胺，5XSSC和SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)， 在0.2 X SSC中洗滌和在65°C下于0. 1% SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。術(shù)語(yǔ)“真核生物”意指屬于種系發(fā)生真核領(lǐng)域的有機(jī)體，諸如動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。


圖1 pIRES2-AcGFPl_Delta6真核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2表達(dá)綠色熒光蛋白的HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。圖3 Delta6基因在HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)的RT-PCR結(jié)果。圖4 Delta6基因在HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)的脂肪酸氣相色譜分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。說(shuō)明以下具體實(shí)施例中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來(lái)進(jìn)行，包括Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001) ;Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)； 禾口 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編，1994)。描述分子生物技術(shù)的一般文本包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning ；Techniques, Methods in Enzymology,第 152 卷，Academic Press, Inc. , San Diego, CA(Berger) ；Sambrook 等人’ Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (第 2 版)，第 1~3 卷.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989(" Sambrook")禾口 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人編，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley &Sons, Lie, (1999 年增補(bǔ))(〃 Ausubel “)。實(shí)施例1密碼子優(yōu)化的琉璃苣脂肪酸脫氫酶真核表達(dá)載體 pIRES2-AcGFPl-Delta6 的制備包括EcoRI和BioI酶切位點(diǎn)、kozak序列、密碼子優(yōu)化的琉璃苣脂肪酸脫氫酶 Delta-6編碼區(qū)的核苷酸序列由hvitrogen公司合成。骨架載體pIRES2_AcGFPl (購(gòu)自Clontech)載體通過(guò)EcoRlAhoI雙酶切得到線性化載體序列；同樣用EcoRlAhoI 雙酶切含目的片段的載體得到Delta6基因片段，切膠回收目的片段，T4 DNA Iigase 室溫連接池；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞；酶切和測(cè)序鑒定獲得正確的新質(zhì)粒 pIRES2-AcGFPl-Delta6(圖 1)。實(shí)施例2密碼子優(yōu)化的琉璃苣Delta6基因轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天，在M孔板上以1. 5X105/孔的比例接種昍以93(購(gòu)自ATCC) (0. 5mL/ 孔)，第二天細(xì)胞密度達(dá)到90%-95%后，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成無(wú)抗生素的培養(yǎng)基。將0. 8-1. 2 μ g 的 pIRES2-AcGFPl-Delta6 質(zhì)粒 DNA 稀釋到 50 μ L 無(wú)血清 0ΡΤΙ-ΜΕΜ 中；另將2 μ L脂質(zhì)體稀釋到50 μ L OPTI-MEM中。5分鐘后，將二者混合，室溫靜置20分鐘以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。再將形成的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。將培養(yǎng)板置37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后換新的含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，將細(xì)胞以至少1 10的比例稀釋后傳代，并在傳代后M小時(shí)加 0. 7mg/ml的G418篩選14天。再將GFP陽(yáng)性細(xì)胞從G418抗性細(xì)胞中分離出來(lái)，通過(guò)細(xì)胞正常傳代，獲得穩(wěn)定的陽(yáng)性細(xì)胞株(圖2)。以pIRES2-AcGFPl載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照。實(shí)施例3GFP陽(yáng)性細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)按照Trizol (Invitrogen)說(shuō)明書提取GFP陽(yáng)性細(xì)胞的總RNA。按照以下步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈1) DNase (Promega)處理 RNA 樣品A. RNase-free PCR管中加入表1所示的反應(yīng)體系表 權(quán)利要求
1. Δ -6脂肪酸脫氫酶突變基因，其特征在于，其核苷酸為以下(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO: 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸序列，該核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID N0:2所示。
2.含有權(quán)利要求1所述△-6脂肪酸脫氫酶突變基因的表達(dá)載體。
3.按照權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。
4.按照權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的真核表達(dá)載體是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
5.按照權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是 pIRES2-AcGFPl-Delta6 ；其中，所述Delta6的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
6.含有權(quán)利要求2-5任何一項(xiàng)所述表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞株。
7.按照權(quán)利要求6所述的重組宿主細(xì)胞株，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因在制備Δ-6脂肪酸脫氫酶中的應(yīng)用。
9.按照權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，包括構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述△-6脂肪酸脫氫酶突變基因的真核表達(dá)載體；將所構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)， 收集并純化所表達(dá)的蛋白，即得。
10.一種提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Y-亞麻酸含量的方法，包括構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述 Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體；將所構(gòu)建的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。本發(fā)明將來(lái)源于琉璃苣的Δ-6脂肪酸脫氫酶基因在不改變氨基酸序列的前提下，按照人的密碼子偏愛(ài)性將其密碼子改為高度或中度使用頻率的密碼子，此外，還在其起始密碼子ATG的上游添加了kozak序列，優(yōu)化后的突變基因核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。將本發(fā)明突變基因?qū)氲剿拗骷?xì)胞中，在添加底物亞油酸的條件下，通過(guò)氣相色譜方法對(duì)所獲得的重組宿主細(xì)胞株進(jìn)行脂肪酸成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組宿主細(xì)胞中γ-亞麻酸水平有顯著增加，本發(fā)明Δ-6脂肪酸脫氫酶突變基因能應(yīng)用于提高或改善哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的γ-亞麻酸含量。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102250928SQ20111017993
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者曹文廣, 陳青 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所