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轉(zhuǎn)基因大豆子葉rna和dna的同步抽提方法

文檔序號:526215閱讀:260來源:國知局
專利名稱:轉(zhuǎn)基因大豆子葉rna和dna的同步抽提方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因大豆子葉的RNA和DNA的同步分離純化,具體說是使用不同蛋白變性劑和氯化鋰(LiCl)同步抽提轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA的方法。
背景技術(shù)
大豆是極重要的一種經(jīng)濟作物,富含優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、鈣質(zhì)和保健因子。 除了直接食用外,大豆還可以制成豆腐、豆油、醬油、豆瓣醬、大豆蛋白和磷脂等加工品。隨著食用油和植物蛋白需求量的不斷增加和大豆應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴大,大豆栽培和加工已逐步成為重要的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,在分子生物學領(lǐng)域開展大豆品質(zhì)、產(chǎn)量及功能性食品的研發(fā)等相關(guān)研究顯得尤為重要。核酸抽提是上述研究的必要且重要的一步,因為核酸質(zhì)量對后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄、PCR、限制性內(nèi)切酶酶切、Northern雜交、文庫構(gòu)建等諸多實驗都有顯著影響。在核酸抽提上已有一些相關(guān)的技術(shù)報道,例如在DNA抽提技術(shù)上有CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法、SDS (十二烷基磺酸鈉)-蛋白酶K法、LiCl法等,在RNA抽提技術(shù)上有CTAB法、異硫氰酸胍法以及改進的TRIZOL法等。不同生物或不同組織的細胞組分和次級代謝產(chǎn)物不盡相同,因此不同材料需要不同的核酸抽提方法。目前尚無轉(zhuǎn)基因大豆子葉 RNA和DNA同步抽提方法的報道。通常轉(zhuǎn)基因大豆的分子檢測是以葉片為材料,分別獨立抽提轉(zhuǎn)基因大豆葉片的 RNA和DNA,需要較多樣品、試劑和工序,而同步抽提RNA和DNA既能節(jié)約材料又能節(jié)約時間。以子葉代替葉片做核酸分析還能提早對轉(zhuǎn)基因大豆是否獲得外源基因以及外源基因是否表達進行檢測。所以有必要研發(fā)適合轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA同步抽提的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA同時抽提的方法, 實驗簡便、省時、省料,實驗結(jié)果理想。獲得的高純度的核酸可以用于PCR、RT-PCR、N0rthern 雜交、限制性內(nèi)切酶酶切、文庫構(gòu)建等后續(xù)實驗。經(jīng)過多次實驗探索,得出符合此目的的實驗方法,各種方法及其具體步驟如下
(1)使用含蛋白變性劑(如SDS、異硫氰酸胍或CTAB中的一種或多種試劑)的偏堿性 (pH范圍7. 0 8. 5)裂解液裂解樣品;
(2)加入等體積的Tris飽和苯酚/氯仿(體積比=1 1),混勻,離心后取上清;
(3)加入等體積氯仿,混勻,離心后取上清;
(4)加入LiCl(終濃度為1 3mol/L),離心后RNA沉淀在管底;
(5)轉(zhuǎn)移第(4)步的上清至新管,加入乙醇(終濃度為65% 70%(體積比)),離心后得到DNA沉淀;
(6)DNA沉淀經(jīng)漂洗后,溶于含RNase A水中;[7]RNA溶液中加入DNase I處理,然后常規(guī)苯酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,沉淀經(jīng)漂洗后, 于適量RNase-free水中溶解,此步為可選做步驟。
具體實施例方式方案一 SDS裂解與LiCl選擇沉淀
(1)IOOmg 新鮮樣品液氮研磨,加入 ImLSDS 裂解液(0. lmol/LTris-Cl (ρΗ8· 0),0. 5mol/ LNaCl,0. 05mol/L EDTA, 1. 5% (w/v) SDS),室溫放置 IOmin ;
(2)加入等體積的Tris飽和酚(PH8.0)與氯仿混合液(體積比=1 1)混勻, 12000rpm離心5min后取上清;
(3)加入等體積的氯仿并混勻,12000rpm離心5min后取上清;
(4)加入1/4 體積 IOmol/L LiCl,靜置 30min, 12000rpm 離心 IOmin 后 RNA 沉淀在管
底;
(5)轉(zhuǎn)移第(4)步的上清至新管,加入2倍體積的無水乙醇,12000rpm離心5min后得到DNA沉淀;
(6)RNA和DNA沉淀分別用75%乙醇漂洗,室溫干燥;
(7)RNA沉淀溶于適量RNase-free水,_70°C保存,備用;
(8)DNA沉淀溶于含RNaseA水中,37°C溫浴30min,-20°C保存,備用;
(9)經(jīng)1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA,電泳條帶清晰完整,無明顯拖帶,點樣孔無明顯殘留;通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的沈0/230 = 2. 0 2. 4,26(^280 =1. 8 2. 0,RNA 的 260/230 = 2. 0 2. 5,260/280 = 1. 9 2. 0。方案二 異硫氰酸胍裂解與LiCl選擇沉淀
(1)IOOmg新鮮樣品液氮研磨,加入ImL異硫氰酸胍裂解液(0. lmol/L Tris-Cl (pH8. 0),0. 5mol/L NaCl,0. 05mol/L EDTA,lmol/L 異硫氰酸胍),室溫放置 IOmin ;
(2)加入等體積的Tris飽和酚(PH8.0)與氯仿混合液(體積比=1 1)混勻, 12000rpm離心5min后取上清;
(3)加入等體積的氯仿并混勻,12000rpm離心5min后取上清;
(4)加入1/4 體積 IOmol/L LiCl,靜置 30min, 12000rpm 離心 IOmin 后 RNA 沉淀在管
底;
(5)轉(zhuǎn)移第(4)步的上清至新管,加入2倍體積的無水乙醇,12000rpm離心5min后得到DNA沉淀;
(6)RNA和DNA沉淀分別用75%乙醇漂洗,室溫干燥;
(7)RNA沉淀溶于適量RNase-free水,_70°C保存,備用;
(8)DNA沉淀溶于含RNaseA水中,37°C溫浴30min,-20°C保存,備用;
(9)經(jīng)1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA,電泳條帶清晰完整,無明顯拖帶,點樣孔無明顯殘留;通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的沈0/230 = 2. 0 2. 4,26(^280 =1. 8 2. 0,RNA 的 260/230 = 2. 0 2. 5,260/280 = 1. 9 2. 0。方案三CTAB裂解與LiCl選擇沉淀
(I)IOOmg 新鮮樣品液氮研磨,加入 ImL CTAB 裂解液(0. lmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 1. 4mol/LNaCl,0. 05mol/L EDTA, 2% (w/v) CTAB),室溫放置 IOmin ;(2)加入等體積的Tris飽和酚(PH8.0)與氯仿混合液(體積比=1 1)混勻, 12000rpm離心5min后取上清;
(3)加入等體積的氯仿并混勻,12000rpm離心5min后取上清;
(4)加入1/4 體積 IOmol/L LiCl,靜置 30min, 12000rpm 離心 IOmin 后 RNA 沉淀在管
底;
(5)轉(zhuǎn)移第(4)步的上清至新管,加入2倍體積的無水乙醇,12000rpm離心5min后得到DNA沉淀;
(6)RNA和DNA沉淀分別用75%乙醇漂洗,室溫干燥;
(7)RNA沉淀溶于適量RNase-free水,加入DNase I處理;
(8)常規(guī)苯酚/氯仿抽提,取上清;加入0.1倍體積2mol/LNaCl和2倍體積的無水乙醇,12000rpm離心IOmin后獲得RNA沉淀;
(9)RNA沉淀用75%乙醇漂洗,室溫干燥,適量RNase-free水溶解沉淀,_70°C保存,備
用;
(10)DNA直接溶于含RNaseA水中,37°C溫浴30min,-20°C保存,備用;
(11)經(jīng)1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA,電泳條帶清晰完整,無明顯拖帶,點樣孔無明顯殘留;通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的沈0/230 = 2. 0 2. 4,26(^280 =1. 8 2. 0,RNA 的 260/230 = 2. 0 2. 5,260/280 = 1. 85 2. 0。
權(quán)利要求
1.大豆子葉總RNA和DNA同步抽提試劑中主要包括蛋白變性劑、環(huán)境PH緩沖劑、DNase 活性抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸抽提試劑,其特征在于蛋白變性劑分別為SDS(十二烷基磺酸鈉)、異硫氰酸胍或CTAB (十六烷基三乙基溴化銨),各成分在各方案中的用量依次為 1 2% (w/v)、0· 5 1. 5mol/L、l 2% (w/v)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸抽提試劑,其特征在于環(huán)境PH緩沖劑為Tris-Cl,防止核酸被破壞,其PH值為7. 0 8. 5,濃度為0. 05 0. 2mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸抽提試劑,其特征在于DNase活性抑制劑為EDTA,可螯合Mg2+或Mn2+離子,其濃度為0. 01 0. lmol/L0
5.使用權(quán)利1所述的抽提試劑來同步抽提大豆子葉總RNA和DNA的方法,其抽提步驟為使用含蛋白變性劑(如SDS、異硫氰酸胍或CTAB中的一種或多種試劑)的偏堿性(pH范圍7.0 8. 5)裂解液裂解樣品;加入等體積的Tris飽和苯酚/氯仿(體積比=1 1), 混勻,離心后取上清;加入等體積的氯仿,混勻,離心后取上清;加入LiCl (終濃度為1 3mol/L),離心后RNA沉淀在管底;繼續(xù)加入乙醇(終濃度為65% 70% (體積比)),離心后得到DNA沉淀;DNA沉淀經(jīng)漂洗后,溶于含RNase A水中;向RNA溶液中加入DNase I處理,然后常規(guī)苯酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,沉淀經(jīng)漂洗后,于適量RNase-free水中溶解,此步為可選做步驟。
全文摘要
在核酸抽提上已有一些相關(guān)的技術(shù)報道,但目前尚無轉(zhuǎn)基因大豆子葉RNA和DNA同步抽提方法的報道。本發(fā)明使用偏堿性CTAB、SDS或異硫氰酸胍裂解液裂解子葉,常規(guī)苯酚/氯仿抽提,用LiCl選擇性沉淀RNA,用乙醇繼續(xù)沉淀DNA,沉淀的RNA和DNA分別用DNase I和RNase A處理,最后得到高質(zhì)量的核酸。同步抽提既能節(jié)約樣品、試劑、又能節(jié)約時間。對子葉做核酸分析能夠在大豆剛出苗時對經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大豆進行分子檢測,提早確定是否將外源基因?qū)氪蠖挂约巴庠椿蚴欠癖磉_。
文檔編號C12N15/10GK102250884SQ20111018425
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者周向紅, 易樂飛, 王萍 申請人:淮海工學院
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