專利名稱：一種利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程的動物生物技術，特別是水牛繁殖與定向遺傳改良領域。具體是一種利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法。
背景技術：
轉基因動物(Transgenic animal)技術是借助基因工程技術將外源基因導入受體動物基因組內，并在體內穩(wěn)定表達且外源導入基因能穩(wěn)定遺傳給后代的技術。其主要特點是人類有目的、有計劃、有根據、有預見地改變動物的遺傳結構，而賦予轉基因動物新的表型特征。水牛是我國南方的一種極具開發(fā)前景的重要家畜，因其適應性強、耐高溫高濕、抗病力強、耐粗飼、容易飼養(yǎng)、使用年限長和乳品營養(yǎng)價值高等特性，而倍受人們關注與重視。 然而，目前我國水牛的品種的產奶量和繁殖率低，制約水牛奶業(yè)的發(fā)展，急需應用胚胎工程技術對其進行品種改良。與其他轉基因技術相比，轉基因克隆技術可以在細胞水平上進行遺傳操作，實現基因的定點整合和敲除，并能在理論上使轉基因的效率達到100%，此外還實現轉基因動物的性別控制。因此，轉基因克隆技術是一種目前生產轉基因動物和改良動物遺傳性狀最為有效的理想方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法。本發(fā)明采用電穿孔法將EGFP基因導入水牛胎兒成纖維細胞中，然后結合體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛胚胎，并結合胚胎移植技術建立一種生產轉基因水牛的新方法。本發(fā)明通過以下技術方案解決上述技術問題一種利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法，包括如下步驟(1)水牛胎兒成纖維細胞的轉染與篩選傳代培養(yǎng)至三代的水牛胎兒成纖維細胞使用線性質粒DNA(pCE-EGFP-IRES-ne0)采用電穿孔法進行轉染。然后用DMEM+10%胎牛血清+600 μ g/ml G418的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)，6 IOd后，挑取細胞數超過60個的細胞集落擴大培養(yǎng)。獲得G418抗性的轉EGFP基因細胞，可用于核移植。(2)轉基因克隆水牛的生產水牛卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)2 后，選擇有第一極體的卵母細胞于裝有Spindle-view系統(tǒng)的倒置顯微鏡下進行去核獲得受體卵母細胞。供體細胞為轉染篩選后且通過接觸抑制法培養(yǎng)的水牛胎兒成纖維細胞，經倒置熒光顯微鏡觀察確證表達EGFP后注入到去核的卵母細胞卵周隙中，然后采用安裝在顯微操作儀上可活動的距離為0. 2mm的兩根鉬金絲微電極針進行電融合。融合后的核移植重構胚用離子霉素處理5min，再用2mmol/L的6- 二甲氨基嘌呤培養(yǎng)池進行化學激活處理，然后置于含顆粒細胞單層的微滴中共培養(yǎng)6 7d。將獲得的克隆囊胚在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況，篩選出表達EGFP的轉基因克降囊胚移植到受體母水牛的子宮角中，受體水牛經妊娠足月后產下犢牛，在紫外燈照射下，這些轉基因克隆水牛犢頭部和四肢明顯均表達有EGFP標記基因。本發(fā)明的突出優(yōu)點在于用本發(fā)明的方法，成功生產了轉基因克隆水牛胚胎，經過胚胎移植后有3頭受體水牛獲得妊娠到期并產下犢牛4頭，其中3頭成活，1頭死亡，在紫外燈照射下，這些轉基因克隆水牛犢頭部和四肢明顯均表達有EGFP標記基因。說明利用本發(fā)明可成功生產轉基因克隆水牛。


圖1是本發(fā)明獲得的表達EGFP的轉基因水牛胎兒成纖維細胞，其中，圖A為常光下；圖B為熒光燈下。圖2是本發(fā)明獲得的表達有EGFP的水牛轉基因克隆囊胚，其中，圖A為常光下；圖 B為熒光燈下。圖3是本發(fā)明獲得的表達有EGFP的轉基因克隆水牛，其中，圖A為常光下；圖B為熒光燈下。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明。本發(fā)明所述的利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法，包括如下步驟1、水牛胎兒成纖維細胞的轉染與篩選將水牛胎兒的耳部以及腹部皮膚組織剪成約0. 5cm2的組織塊。用含有青、鏈霉素的PBS緩沖液多次清洗，放入75%酒精內浸泡約30s，再用含有青、鏈霉素的PBS緩沖液反復清洗，放于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌眼科剪將皮膚剪碎至2mm3小塊，均勻地平鋪于皿底。加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液0. 5ml，但要防止組織塊飄起來，輕輕移入38. 5°C飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，待組織塊貼壁后，再加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，進行原代培養(yǎng)，每隔 3 4d換一次液。待原代細胞長到80 90%匯合時，開始進行細胞傳代。先用無Ca2+、Mg2+的PBS 洗兩遍，加入含0. 25%胰蛋白酶的Hank’ s液消化3 5min，待細胞變圓時，小心吸出消化液，再加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化。棄去皿內組織塊，用吸管輕輕吹打使細胞懸浮，收集懸浮液于5ml離心管，采用1200rpm離心5min，重懸液以IX IO6細胞/ml接種于新的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每隔4 5d傳一代，傳代比例為1 3 1 4。傳代培養(yǎng)至三代的水牛胎兒成纖維細胞使用線性質粒DNA(pCE-EGFP-IRES-ne0) 使用電穿孔轉染。在轉染前2 3d，將細胞轉接到IOOmm培養(yǎng)皿內，加入適量DMEM+10% FBS置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。轉染前池換新鮮培養(yǎng)液，準備轉染時用PBS清洗兩遍后，加入胰蛋白酶消化并收集細胞。用PBS稀釋均勻后計數，制成IO7AiL的細胞懸液轉移至內徑為0. 4cm 的電擊杯中。加入10 μ g線性化質?；靹颍覝胤胖?min。利用電融合儀按照150V，IOms, Ipulse的參數進行電擊，電擊后冰上放置5min，隨后轉移至新的IOOmm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；1 2d后待細胞生長狀態(tài)恢復，加入600 μ g/ml G418進行抗性細胞篩選。每3 4d換液一次， 同時補加G418。每天觀察細胞生長或死亡。6 IOd后，挑取細胞數超過60個的細胞集落擴大培養(yǎng)后用于核移植。2、轉基因克隆水牛的制備從屠宰場收集水牛卵巢，置于含有K+、Ca2+、、Na+、Mg2+的；35 37°C生理鹽水的保溫瓶內，4h內送到實驗室，用37°C的生理鹽水洗凈，剪掉卵巢周圍的懸韌帶，用帶有12號針頭的IOml注射器抽取直徑為2 6mm的卵泡中卵母細胞。在實體顯微鏡下挑選出細胞質均勻，并有完整致密卵丘細胞的卵丘卵母細胞復合物，用洗卵液清洗兩遍后，放入含1. 5ml水牛體外成熟液(TCM-199+5% 0CS+0. 1 μ g/ml FSH)的 30 X IOmm 玻璃平皿中，在 38. 5°C、5% CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中體外成熟培養(yǎng)22h。選擇具有第一極體的水牛卵母細胞，以10 15枚為一組，置于5 μ g/ml細胞松弛素B的操作液微滴中，并覆蓋石蠟油。在裝有Spindle-view系統(tǒng)的倒置顯微鏡下找到紡錘體區(qū)域。用固定管從第一極體對側吸住卵母細胞，通過內徑20 25 μ m左右的去核針調整位置，使極體以及核處于3 4點之間，吸取第一極體及其下方含有細胞核1/16 1/8的細胞質，去核后的卵母細胞待用于核移植的受體胞質。去核后的卵母細胞放入培養(yǎng)液中在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)30min，使其形態(tài)恢復。轉移到含 0. 聚乙烯醇PVA操作液的液滴中。本發(fā)明采用卵周隙注核法，將供核細胞用去核管吸取并沿去核時在透明帶留下的切口注入。注核時在倒置熒光顯微鏡的引導下，挑選表面光滑、 胞質均勻的表達綠色熒光蛋白的細胞為供核細胞。注核時，先吸取少量細胞質，再將細胞質連同供體細胞一起注入卵周隙中，使供體細胞與卵膜緊貼在一起，以便有利于細胞融合。本發(fā)明所用的電融合儀為ECM-2001，電極為兩根安裝在顯微操作儀上可活動的距離為0. 2mm的鉬金絲，注核后的供體-卵母細胞胞質復合體先在融合液(融合液為 0. 28mol/L 甘露醇 +0. 05mmol/LCaCl2+0. Immo 1 /LMgS04+5mmo 1 /LHepes+0. 1 % BSA+5mg/L 酚紅)中平衡2分鐘，再移到電極間的100 μ 1融合滴中，用其中一根鉬金絲輕輕撥動細胞，使待融合的兩質膜平面與電場方向垂直，然后采用電融合參數為100v/mm，15yS，3次電脈沖進行融合。電激后的重組胚移入培養(yǎng)液中，在38. 5°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，然后在顯微鏡下檢查其融合情況。將融合的重組胚進一步進行激活處理，未融合的重組胚棄之。將融合后的重構胚用5 μ mol/L的離子霉素激活處理5min，然后用2mmol/L的 6- 二甲氨基嘌呤培養(yǎng)池進行激活處理。而后將激活處理后的重構胚置于顆粒細胞單層微滴中，在38. 5°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液每隔48小時更換一次。水牛轉基因克隆重構胎在體外培養(yǎng)6 7d后，將獲得的核移植囊胚在倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況，挑選表達EGFP的轉基因克隆囊胚裝入胚胎移植管中，采用非手術法將胚胎移植到受體母牛的子宮角中。3個月后檢測受體水牛妊娠情況。其中，3頭受體母牛懷孕至足月后分娩，生下4頭轉基因克隆水牛，其中3頭成活。實施例2010年，我們共將72枚新鮮或冷凍/解凍的表達有EGFP基因的水牛轉基因克隆囊胚分別移植給36頭受體水牛的子宮角中，每頭受體牛移植2枚囊胚，其中2010年1月觀日、2月5日和4月3日分別移植的3頭受體水牛獲得妊娠，經過300多天的妊娠足月后， 分別于2010年12月19日產下2頭公牛犢，其中一頭成活，一頭死亡，2011年1月4日和
52011年3月19日分別產下1頭公牛犢，在紫外燈照射下，這些轉基因克隆水牛頭部和四肢明顯均表達有EGFP標記基因。這一實施例證明，本發(fā)明利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法是可行的。
權利要求
1. 一種利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)水牛胎兒成纖維細胞的轉染與篩選傳代培養(yǎng)至三代的水牛胎兒成纖維細胞使用線性質粒DNA(pCE-EGFP-IRES-neo)采用電穿孔法進行轉染，然后用DMEM+10 %胎牛血清 +600 μ g/ml G418的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)6 IOd后，挑取細胞數超過60個的細胞集落擴大培養(yǎng)，獲得G418抗性的轉EGFP基因細胞，(2)轉基因克隆水牛的生產水牛卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)2 后，選擇有第一極體的卵母細胞于裝有Spindle-view系統(tǒng)的倒置顯微鏡下進行去核獲得受體卵母細胞，供體細胞為轉染篩選后且通過接觸抑制法培養(yǎng)的水牛胎兒成纖維細胞，經倒置熒光顯微鏡觀察確證表達EGFP后注入到去核的卵母細胞卵周隙中，然后采用安裝在顯微操作儀上可活動的距離為0. 2mm的兩根鉬金絲微電極針進行電融合，融合后的核移植重構胚用離子霉素處理 5min,再用2mmol/L的6- 二甲氨基嘌呤培養(yǎng)池進行化學激活處理，然后置于含顆粒細胞單層的微滴中共培養(yǎng)6 7d，將獲得的克隆囊胚在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況，篩選出表達EGFP的轉基因克隆囊胚移植到受體母水牛的子宮角中，受體水牛經妊娠足月后產下犢牛，在紫外燈照射下，這些轉基因克隆水牛犢頭部和四肢明顯均表達有EGFP標記基因。
全文摘要
一種利用體細胞核移植技術生產轉基因克隆水牛的方法，是從水牛胎兒分離培養(yǎng)得到水牛胎兒成纖維(BFF)，再將攜帶新霉素抗性基因和增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因的轉基因載體(pCE-EGFP-IRES-neo)通過電穿孔法導入BFF，并通過G418篩選獲得轉EGFP基因的BFF；而后，將轉EGFP基因的BFF移植到去核的水牛卵母細胞構建克隆重構胚，經5μmol/L離子霉素處理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培養(yǎng)3h進行化學激活處理后，置于顆粒細胞單層共培養(yǎng)6-7d后獲得轉基因克隆囊胚。在倒置熒光顯微鏡下挑選表達EGFP的轉基因克隆囊胚移植到受體水牛，經過妊娠足月后分娩獲得轉基因克隆犢牛。經紫外燈照射，這些轉基因克隆水牛犢頭部和四肢明顯均表達EGFP標記基因，證明用本發(fā)明的方法可成功生產轉基因克隆水牛。
文檔編號C12N15/873GK102250954SQ20111018531
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權日2011年7月4日
發(fā)明者劉慶友, 李楠, 李湘萍, 石德順, 羅嬋, 蔣建榮, 陸鳳花, 韋英明 申請人:廣西大學