專利名稱：家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標抗性的分子檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及家蠅對擬除蟲菊酯類靶標抗性的分子檢測技術，屬于生物技術領域，適合用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的快速檢測。
背景技術：
家蠅(Musca domestica)是一種重要的疾病傳媒,據(jù)報道它可以傳播100多種人畜疾病。家蠅也是重要的畜牧業(yè)害蟲，家蠅的發(fā)生可以導致畜禽產品產量和質量的降低。因此家蠅種群的控制對于人類的健康和國民經(jīng)濟的發(fā)展都具有十分重要的意義。家蠅的防治長期以來主要依賴化學農藥，抗藥性問題突出?？顾幮詫е職⑾x劑殺蟲效率的下降，由此引發(fā)諸如殺蟲劑使用次數(shù)和劑量增加，蟲媒人畜疾病的流行等問題已給人類帶來巨大損失。擬除蟲菊酯殺蟲劑(如溴氰菊酯)已廣泛用于家蠅的防治，家蠅對這類殺蟲劑普 遍產生了抗性?？顾幮缘臋z測是科學制定有效的防治措施的前提，對減少化學藥劑對環(huán)境的污染和合理制定抗藥性治理具有重要的指導意義。家蠅對擬除蟲菊酯類的抗性的檢測常采用生物測定，這種方法存在如下缺點(I)試驗周期長一般需要24小時以上才能得到生測結果；(2)對試蟲的數(shù)量和質量要求高為保證生測結果的準確性，需要使用特定生理狀態(tài)的試蟲；(3)難于檢測早期抗性和預測抗性的發(fā)展趨勢生物測定的方法只能記錄殺蟲劑劑量和試蟲死亡率的信息，而無法測定個體的基因型。近年來，隨著對家蠅抗藥性抗性分子機制的了解，國內外開始嘗試家蠅抗性的分子檢測技術的研究。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，家蠅對擬除蟲菊酯類抗性的主要機制之一是鈉離子通道基因的點突變導致家蠅對農藥的敏感性下降(即靶標不敏感性)。靶標不敏感主要是鈉離子通道蛋白在1014位點的氨基酸變異(亮氨酸L變?yōu)楸奖彼酕或組氨酸H，稱為擊倒抗性)以及918位點上的蛋氨酸(M)替換為蘇氨酸(T)。918位點的抗性突變只見于存在1014F抗性突變的個體，這兩抗性位點的突變組合稱為超擊倒抗性。至今，在國內外只建立了基于PCR的L1014F抗性突變的檢測方法，而我們的研究發(fā)現(xiàn)，在我國，L1014H變異的頻率更高，而且在高抗性家蠅品系中還存在M918T這一抗性相關的遺傳變異。(Qiu X，Li M, Luo H, Fu T. 2007 Molecular analysis of resistancein a deltamethrin—resistant str ain of Musca domestica from China. PesticideBiochemistry and Physiolog y 89(2) :146-150)

發(fā)明內容
本發(fā)明是根據(jù)我們對我國各地家蠅抗藥性機制的了解，提出了家蠅抗藥性的分子檢測方法，包括L1014F，L1014H, M918T三個抗性突變的檢測方法。因此，本發(fā)明的目的是根據(jù)對我國各地家蠅抗藥性機制的了解，建立可用于檢測家蠅對擬除蟲菊酯類靶標抗性的分子檢測方法。本發(fā)明的一方面涉及一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標抗性的分子檢測方法，該方法包含下列步驟
(I)提取單頭家蠅基因組DNA ；(2)對家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異進行分子檢測；(3)對家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異進行分子檢測。其中，所述家蠅鈉離子通道基因序列選自SEQ ID NO :10(鈉離子通道基因1014L)、11(鈉離子通道基因1014F)、12(鈉離子通道基因1014H)、13 (鈉離子通道基因918M)、14(GenBank登錄號為EF592581，鈉離子通道基因918T)所示。其中，1014的位點抗性相關變異為L1014F或L1014H，918位點抗性相關變異為M918T，可以使用PCR方法對家蠅鈉離子通道基因編碼的1014氨基酸位點和918氨基酸位點抗性相關的變異進行分子檢測。在一個特定的實施方案中，對家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異的PCR檢測使用下列5種PCR引物
PF :正向通用外引物，序列為 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:
1);PR:反向通用外引物，序列為 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:
2)PL : 1014L 敏感基因特異性引物，序列為 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCAT-3，(SEQ ID NO 5)其中，對每個個體設置3個PCR反應，分別使用三種不同的引物混合物，即Al (PF+PR+PL, 1:1:3 混合)，A2 (PF+PR+PF, 1:1:3 混合)，A3 (PF+PR+PH, 1:1:3混合)。PCR 反應程序為94°C 3min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，35 個循環(huán)；72°C IOmin0在另一個特定的實施方案中，對家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異的PCR檢測使用下列4種PCR引物SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5’ -CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3’ (SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3’ (SEQ ID NO :9)其中，PCR 反應中引物 S1、S2、
S3和 S4 的混合比例為 I : I : 3 : 3。PCR 反應程序為94°C 3min ；94V 30s, 50°C 30s,72°C 30s，30 個循環(huán)；72V IOmin0本發(fā)明的另一方面涉及上述方法在家蠅抗藥性檢測中的應用。本發(fā)明的第三方面涉及一種用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標抗性檢測的試劑盒，包括(I)用于提取單頭家蠅基因組DNA的試劑；(2)用于對家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑；(3)用于對家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑。在一個特定的實施方案中，用于對家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑包括下列5種PCR引物
PF :正向通用外引物，序列為 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:
1);PR:反向通用外引物，序列為 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:
2)PL : 1014L 敏感基因特異性引物，序列為 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCA T-3，(SEQ ID NO 5)在另一個特定的實施方案中，用于對家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑包括下列4種PCR引物SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5，-CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3，(SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3，(SEQ ID NO 9)本發(fā)明相比現(xiàn)有技術有如下優(yōu)點I.本發(fā)明建立的抗性分子檢測技術與傳統(tǒng)生物測定相比具有如下優(yōu)點(I)需要生物材料少，數(shù)量在50-200頭就可以滿足檢測要求；(2)對材料的要求低可以采用任何蟲態(tài)的試蟲，可以用活體，也可以用保存的樣品，可以用整頭家蠅，也可以用蟲體的某一部位(如雙翅)；(3)可以區(qū)分種群的雜/純合狀態(tài)有利預測種群抗性基因頻率的變化趨勢，便于抗性的早期診斷；(4)快速從DNA的提取到PCR產物的檢測，數(shù)小時就可以完成。2.本發(fā)明與其它文獻報道的用于家蠅靶標抗性檢測的分子檢測法方法(李春曉等特異性等位基因PCR擴增技術檢測家蠅擊倒抗性相關鈉通道的基因突變。中國媒介生物學及控制雜志(2007)，18 (3) =255-256)相比，具有(I)覆蓋面廣不僅可以檢測1014F,還可以檢測1014H這一在我國自然種群家蠅中普遍存在的抗性基因型；(2)提供了 M918T抗性突變的快速檢測方法用I個PCR反應就可以區(qū)分抗性與敏感基因型，而且M918T抗性突變意味著更高的抗性水平，該方法可以用于家蠅超擊倒抗性的早期預警。


以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖IA-F為家蠅鈉離子通道基因1014位點基因型檢測結果。其中，M代表DNA分子量標記(50bp DNA ladder，天根公司)；A1 :反應所用引物為PF+PR+PL，按I : I : 3混合；A2 :反應所用引物為PF+PR+PF，按I : I : 3混合；A3 :反應所用引物為PF+PR+PH，按1:1: 3混合。其中圖IA為1014L/L基因型電泳圖；圖IB為1014L/F基因型電泳圖；圖IC為1014F/F基因型電泳圖；圖ID為1014L/H基因型電泳圖；圖IE為1014F/H基因型電泳圖；圖IF為1014H/H基因型電泳圖。圖2為家蠅鈉離子通道基因918位點基因型檢測結果。其中，M代表分子量標記(50bp DNA ladder，天根公司)；RR :抗性純合子；RS :雜合子；SS :敏感純合子;B1_B5 :北京樣品檢測，顯示全部敏感純合。
具體實施例方式實施例I單頭家蠅基因組DNA的提取方法(參考 Rinkevich FD et al. Frequencies of the pyrethroid resistancealleles of Vsscland CYP6Dlin house flies from the eastern United Strtes. InsectMolecular Biology (2006)，15 (2)，157-167)本發(fā)明所使用的家蠅株系來源如下所使用的家蠅RR(實驗室抗性BJD品系，基因型為918T純合)，RS (實驗室抗性與敏感品系的雜交Fl代，基因型為918M/T雜合)，
SS (實驗室敏感品系，基因型為918M純合)，B1-B5,L/L，L/F，F(xiàn)/F，L/H，F(xiàn)/H，H/H基因型家蠅采自北京奧運村垃圾站以上品系家蠅均可得自中國科學院動物研究所(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院-5號)。(I)取單頭家蠅(去腹部)置于I. 5ml體積的離心管(印pendorf管)中，加入
0.5ml裂解緩沖液，碾磨將蟲體搗碎，置60°C溫浴，20分鐘后取出；(2)加75 μ I的8Μ醋酸鉀，混勻，置冰上10分鐘；(3) 14000g離心5min，取400 μ I上清液(避免取到沉淀)轉至新的離心管；(4)加入800 μ I (上清液的2倍體積)100%冰冷乙醇，室溫放置IOmin ；(5)離心10分鐘，棄上清，沉淀用0. 5ml 70%乙醇清洗；(6)離心5分鐘,沉淀干燥后,加入50 μ I水重溶。制備的DNA樣品可直接用于后續(xù)的PCR，也可以將樣品保存在4°C下備用，或在-20°C條件下長期保存。以上方法中使用的試劑配制方法如下(I)溶液A :含 IOOmM Tris HCl pH 8. O, IOmM EDTA, 50mM NaCl (高壓滅菌，室溫保存)；(2)0. 15M 精胺(spermine)(過濾滅菌,分裝保存在 _20°C ) ； (Fluka 公司)(3) 0. 5M亞精胺(spermidine)(過濾滅菌,分裝保存在_20°C ) ； (Fluka公司)(4) 20mg/ml蛋白酶K (過濾滅菌,分裝保存在_20°C ) ; (Merck公司)(5)10% SDS，用溶液A配制，無須滅菌；(6) 8M醋酸鉀(室溫保存，IOOml水中溶解醋酸鉀78. 51g)；(7)裂解緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用):為溶液A含I % SDS ；0. 15mM精胺，O. 5mM亞精胺和0. lmg/ml (20U/mg)蛋白酶 K。實施例2家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異的分子檢測(I)PCR引物一共有5條引物(委托Invitrogen公司合成)，其中PF:為通用外引物(正向)，序列為 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGTGC-3，(SEQ IDNO 1)PR :為通用外引物(反向)，序列為 5，-CGA AGT TGG ACA AAA GCAAA-3’ (SEQ IDNO 2)PL :為1014L敏感基因特異性引物，序列為5’ -TGG CCA CGT CAACTT ACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF :為1014F抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCAT-3，(SEQ ID NO 5) (2)PCR反應設置每個個體設置三個PCR反應，分別使用三種不同的引物混合物，即 Al (PF+PR+PL, I I 3 混合)，A2 (PF+PR+PF, I I 3 混合)，A3 (PF+PR+PH,1:1: 3 混合^PCR反應體系為 20 μ 1，含 10XPCR緩沖液(Takara公司，IOOmM Tris-HCL,500mMKCL, 15mM MgCL2) 2. O μ 1，dNTP (2. 5mM) I. 5 μ I，引物混合物 I. 2μ I ；DNA I μ 1，Taq 酶(Takara 公司，r~Taq, 5U/ μ I) O. 2 μ I。(3) PCR 反應程序94 °C 3min ；94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 30s, 35 個循環(huán)；72°C IOmin。(4) PCR產物的電泳檢測將PCR產物在2. O %的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓設定在160V，電泳20min后在紫外光下檢測。各反應除了有285bp的參照條帶外，根據(jù)另一條基因特異性引物產物的有無，來判斷各個體的基因型?；蛐团袆e方法見下表
~LTLL/F ~FVFL/HH/H ~FVH
~Ti285+140 285+140 285285+140 285285
A2285285+189 285+189 285285285+189
A3285285285285+189 285+189 285+189檢測結果如圖I所示。實施例3家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異的分子檢測(I)PCR引物引物有四條，其序列分別為SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5，-CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3，(SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3，(SEQ ID NO 9)(2)PCR反應設置PCR反應體系15 μ 1，含10XPCR緩沖液(Takara公司，IOOmMTris-HCL, 500mM KCL, 15mM MgCL2) I. 5 μ I, dNTP(2. 5mM) I. 2 μ 1，引物混合物 I. 2 μ I [=S1+S2+S3+S4 (O. 15 μ 1+0. 15 μ 1+0. 45 μ 1+0. 45 μ I) ]，DNA O. 5 μ I，Taq 酶(Takara 公司，r-Taq,5U/μ I)0. I μ I。(3) PCR 反應程序94 V 3min ；94 V 30s, 50 V 30s, 72 V 30s, 30 個循環(huán)；72°C IOmin。 (4) PCR產物的電泳檢測
將PCR產物在2. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓設定在160v，20min后紫外光下檢測。如果在272bp和115bp有條帶，說明該個體為敏感純合子；如果在272bp和196bp有條帶，說明該個體為抗性純合子；如果在272bp，196bp和115bp有條帶，說明該個體為雜檢測結果如圖2所示。
權利要求
1.一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標抗性的分子檢測方法，包含下列步驟 (1)提取單頭家蠅基因組DNA; (2)對家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異進行分子檢測； (3)對家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異進行分子檢測。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中所述家蠅鈉離子通道基因序列選自SEQID NO10，SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12，SEQ ID NO 13 和 SEQ IDNO :14。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其中，所述家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異為L1014F或L1014H。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異為M918T。
5.根據(jù)權利要求I至4中任一項所述的方法，其中，使用PCR方法對家蠅鈉離子通道基因1014位點和918位點抗性相關變異進行分子檢測。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，步驟(2)中使用了下列5種PCR引物 PF :正向通用外引物，序列如SEQ ID NO :I所示； PR :反向通用外引物，序列如SEQ ID NO 2所示； PL :1014L敏感基因特異性引物，序列如SEQ ID NO :3所示； PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 4所示； PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 5所示。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，步驟(2)中每個個體設置3個PCR反應A1、A2和A3，其分別使用下列3種不同的引物混合物 Al PF+PR+PL, 1:1:3 混合； A2 PF+PR+PF, 1:1:3 混合；A3 PF+PR+PH, I I 3 混合。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其中，步驟(2)的PCR反應程序為94°C3min;94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，35 個循環(huán)；72°C IOmin0
9.根據(jù)權利要求5-8任一項所述的方法，其中，步驟(3)中使用了下列4種PCR引物 51:序列如SEQ ID NO 6所示； 52:序列如SEQ ID NO 7所示； 53:序列如SEQ ID NO 8所示； 54:序列如SEQ ID NO 9所示。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中，步驟(3)的PCR反應中引物S1、S2、S3和S4的混合比例為I : I : 3 : 3。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的方法，其中，步驟(3)的PCR反應程序為94°C3min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環(huán)；72°C IOmin0
12.權利要求1-11任一項的方法在家蠅抗藥性檢測中的應用。
13.一種用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標抗性檢測的試劑盒，包括 (1)用于提取單頭家蠅基因組DNA的試劑； (2)用于對家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑； (3)用于對家蠅鈉離子通道基因918位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑。
14.根據(jù)權利要求13所述的試劑盒，其中所述家蠅鈉離子通道基因序列如SEQID NO.10，11，12，13 和 14 所示。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的試劑盒，其中，用于對家蠅鈉離子通道基因1014位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑包括下列5種PCR引物 PF :正向通用外引物，序列如SEQ ID NO :I所示； PR :反向通用外引物，序列如SEQ ID NO 2所示； PL :1014L敏感基因特異性引物，序列如SEQ ID NO :3所示； PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 4所示； PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 5所示。 根據(jù)權利要求13-15中任一項所述的試劑盒，其中，用于對家蠅鈉離子通道基因.918位點抗性相關變異進行分子檢測的試劑包括下列4種PCR引物 .51:序列如SEQ ID NO 6所示； .52:序列如SEQ ID NO 7所示； .53:序列如SEQ ID NO 8所示； .54:序列如SEQ ID NO 9所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標抗性的分子檢測方法。采用根據(jù)家蠅鈉離子通道基因的敏感與抗性基因型設計的特異性引物，以單頭家蠅的基因組DNA為模板，進行鈉離子通道基因片段的PCR擴增，根據(jù)對PCR產物的電泳檢測，來區(qū)分家蠅個體的基因型，檢測抗性基因型頻率。本發(fā)明涵蓋家蠅鈉離子通道的1014F，1014H，918T三種抗性點突變的檢測方法。該方法經(jīng)濟、快速、高通量、準確性高。
文檔編號C12Q1/68GK102864209SQ20111018641
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權日2011年7月5日
發(fā)明者邱星輝, 李梅, 王慶敏, 周云輝 申請人:中國科學院動物研究所