專利名稱：一種熱纖梭菌高密度培養(yǎng)的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程領域，具體是熱纖梭菌高密度培養(yǎng)的方法。
背景技術：
隨著全球能源和環(huán)境危機的加劇，尋求替代能源已成為許多國家的研究熱點，這其中清潔，可再生的生物能源是替代能源研究的重要方面，而生物こ醇是最有發(fā)展前景的液體生物能源之一，然而目前生物こ醇還主要來自糖類和淀粉發(fā)酵，面對世界人ロ的急劇膨脹和糧食短缺，用糧食生產(chǎn)酒精的發(fā)展將受到諸多限制(王丹，林建強等，2002)。纖維素是地球上最豐富的可再生資源，但只有極少數(shù)被有效利用，絕大部分被作為廢物棄置在環(huán)境中，反而造成一定的環(huán)境污染，比如城市垃圾。所以用纖維素物料生產(chǎn)新型生物燃料，因為具有重大戰(zhàn)略意義而引起世界各國的廣泛重視(聞志強，姜薇，2010)。但 是木質(zhì)纖維素由于極其復雜的結(jié)構(gòu)，導致其降解十分困難(Christian Weber & AlexanderFarwick et. al,2010)。嗜熱厭氧的熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)因能直接將纖維素轉(zhuǎn)化為こ醇而吸引了眾多研究者的注意力，該菌可從每摩爾葡萄糖對等物中產(chǎn)生出高達Imol的こ醇，有學者研究指出，熱纖梭菌是將纖維素直接轉(zhuǎn)化為こ醇的最有效菌之一(Lynd.et al，2002)。研究表明(Lamedr，1984)，熱纖梭菌中廣泛存在的纖維小體(cellulosome)是其能夠直接把纖維素轉(zhuǎn)化為こ醇的關鍵所在，因為纖維小體具有類似核糖體的大分子結(jié)構(gòu)，能協(xié)調(diào)、有序、高效地降解纖維素。雖然當前廣泛使用的纖維素酶主要由木霉，青酶和曲霉等真菌產(chǎn)生和生產(chǎn)，然而真菌生產(chǎn)的纖維素酶主要是酸性纖維素酶，而細菌和放線菌產(chǎn)生的纖維素酶往往具有耐堿耐熱等獨特優(yōu)點，其應用將大有前景。細菌的纖維素酶即以纖維小體的形式存在(黃俊，陳東，黃日波，2011)。熱纖梭菌是ー種高溫、厭氧、纖維素降解菌，能在60°C下快速生長，并產(chǎn)生大量的纖維小體分解纖維素、半纖維素為纖維ニ糖、木糖、木聚ニ糖等。其本身也能利用分解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)生產(chǎn)こ醇、こ酸、乳酸、CO2和h2。然而熱纖梭菌存在こ醇產(chǎn)量低和こ醇耐受性差等突出缺點，強烈抑制了纖維小體的高效表達。同時高能耗的前處理過程和纖維素酶本身高昂的價格極大的制約了纖維素生物質(zhì)能源的利用，所以如果能有效提高纖維小體的表達水平，將對于降低纖維素酶的成本，以及進一歩降低纖維素生物質(zhì)的利用成本具有重要意義。熱纖梭菌的高密度培養(yǎng)可能是實現(xiàn)該目的的方法之一。高密度發(fā)酵是快速獲取菌體及其主要代謝物的主要方法，也是商業(yè)化生產(chǎn)的前提條件，對于提高發(fā)酵エ業(yè)中的生產(chǎn)強度，降低生產(chǎn)成本具有重要意義(陳保立，王世立等，2009)，然而熱纖梭菌的高密度培養(yǎng)還未見報道，本發(fā)明將填補此方面的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明開發(fā)了熱纖梭菌高密度培養(yǎng)的エ藝。所要解決的技術問題可以通過以下方案來實現(xiàn)
本發(fā)明以纖維素質(zhì)生物質(zhì)ニ糖降解物，如纖維ニ糖或木聚ニ糖為原料，發(fā)酵法直接高密度培養(yǎng)，主要包括以下步驟I.發(fā)酵種子液的制備。種子液培養(yǎng)基為GS-2 =KH2PO4 I. 5g/L，K2HPO4 (anhydrous) 2. 9g/L,氮源 2. I g/L, MgCl2 6H20 I. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L,FeSO4 6H20 I. 25mg/L, Cysteine hydrochloride I. Og/L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 5. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og/L, Yeast extract 6.Og/L, Sodiumcitrate 2H20 3. Og/L配制發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH為7. 4。2.高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方KH2PO4 I. 2g/L, K2HPO4 (anhydrous) 6. Og/L,氮源5. Og/L, MgCl2 6H20 2. 49g/L, CaCl2 2H20 150mg/L, FeSO4 6H20 I. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 2. Og/L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 20. Og/L, Morpholinopropane sulfonicacid (MOPS) 10. Og/L, Yeast extract 12. Og/L, Sodium citrate 2H20 0. 752g/L 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并滅菌。其中，碳源為纖維素質(zhì)生物質(zhì)，氮源為有機或無機氮源；滅菌前調(diào)節(jié)PH為
8.0 ;若需擴大底物濃度，則仍應保持碳氮比為5 I。3.接種。將培養(yǎng)好的種子液按一定比例接入?yún)捬跗炕虬l(fā)酵罐中。4.培養(yǎng)。溫度60°C，厭氧，罐或瓶壓為-0. IMPa 0. IMPa,間歇性或低速攪拌。高底物濃度(碳源濃度大于15g/L)發(fā)酵時應控制pH恒定為7. 0左右。發(fā)酵方式可采用分批，補料分批，連續(xù)或半連續(xù)等。5.經(jīng)24h_48h后菌體濃度達到最大,瓶裝條件下0D_達到8. 85，發(fā)酵罐中OD6tltl達到 12. 7。按照以上步驟，熱纖梭菌高密度培養(yǎng)是本技術領域的技術人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。本發(fā)明具有顯著優(yōu)勢厭氧條件可省去發(fā)酵過程中通入氧氣或壓縮空氣所需的昂貴能源消耗；高溫發(fā)酵不易發(fā)生污染，可減少冷卻用水，這些都將進一歩降低熱纖梭菌高密度培養(yǎng)的生產(chǎn)成本。


無
具體實施例方式實施例I :100ml厭氧瓶發(fā)酵I.用ImL注射器取100 ii L C. thermocellum JYTOl的甘油管菌種,接種于裝有5mL
種子培養(yǎng)基的厭氧瓶中，60°C恒溫培養(yǎng)，活化菌種。2.將活化好的C. thermocellum JYTOl菌液3mL接種于50mL種子培養(yǎng)基中，60°C，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，得到一級種子液。3.按配方“KH2PO4 I. Og/L, K2HPO4(anhydrous)6. Og/L, urea 5. Og/L, MgCl2 6H202.49g/L, CaCl2 2H20 135mg/L, FeSO4 6H20 5.Omg/L, Cysteine hydrochloride2.Og/L, Resazurin 2.Omg/L, cellobiose 20.Og/L, Morpholinopropane sulfonicacid (MOPS) 10. Og/L, Yeast extract 10. Og/L, Sodium citrate 2H20 0. 752g/L” 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)整初始pH為8. O。分裝培養(yǎng)基IOOmL于300ml厭氧瓶中，不斷通入氮氣排凈瓶內(nèi)空氣，并用聚丁酯塞密封，以保證瓶內(nèi)厭氧環(huán)境。115°C，15min濕熱滅菌。其中，鈣、鎂、鐵鹽分別配成IOOX母液于滅菌后加入。4.約24h后菌體濃度達到最大，停止培養(yǎng)獲得發(fā)酵液中OD6tltl為8. 85.實施例2:5L發(fā)酵罐發(fā)酵I.按照實施例I所述方法制備C. thermocellum JYTOl 一級種子液200ml,并計算接種量為I : 10，發(fā)酵液總體積為2L時各自所需體積。2 按配方“ KH2PO4 I. Og/L, K2HPO4 (anhydrous) 6g/L, urea 17. 8g/L,MgCl2 6H202. 49g/L, CaCl2 2H20 135mg/L, FeSO4 6H20 5mg/L, Cysteine hydrochloride2. Og/L, Resazurin 2. Omg/L, cellobiose 30. Og/L, Yeast extract 12. Og/L, Sodiumcitrate 2H20 0. 752g/L”配制發(fā)酵培養(yǎng)基(鈣、鎂、鐵鹽母液滅菌后加入)，115°C,15min 濕熱滅菌。3.滅菌結(jié)束后，不斷向發(fā)酵罐中通入氮氣，以去除培養(yǎng)基及發(fā)酵罐內(nèi)的氧氣。待培養(yǎng)基由淡藍色或粉紅色(刃天青的顏色)變回其自身的顏色后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH恒定為7.0，罐溫60°C，同時接入所需體積的JYT01 —級種子液，停止通氣，80rpm攪拌發(fā)酵。4.約48h后碳源被全部消耗，發(fā)酵液中菌體濃度達12. 7 (OD600)。以上是結(jié)合具體實施例子對本發(fā)明所做的進ー步描述。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。參考文獻陳保立，王世立和韓金榜(2009)，重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的研究講展。中國牛物制品學雜志，22 (11) :1156-1159.Christian Weber & Alexander Farwick et. al(2010). Trends and challengesin the microbial production of lignocellulosic bioalcohol fuels. Appl MicrobiolBiotechnol 87 :1303-1315.Lamed R, setter E, Bayer EA (1983) Characterization of acellulosebinding, ceilulase containing complex in しlostridium thermocellum. .I Bacteriol,156 :828-836.Lynd LR(1996). Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosicbiomass :techno丄ogy, economics, the environment and policy. Annu Rev EnerRYEnviron 21 :403-465.Lynd, L. R. , P. J. ffeimer, et al. (2002). " Microbial cellulose utilization fundamentals and biotechnology. " Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66(3) :506-577.王丹，林建強，曲音波，等(2002).直接生物轉(zhuǎn)化纖維素類資源生產(chǎn)燃料こ醇的研究進展.山東農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，33 (4) =525-529.聞志強，姜薇，林建平，等(2010).產(chǎn)纖維小體細菌厭氧降解纖維素制こ醇的研究講展.微牛物學通報,37 (5) =732-737.
權利要求
1.ー種熱纖梭菌高密度培養(yǎng)的方法，其特征是以GS-2培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，通過高溫，厭氧發(fā)酵，在反應器中實現(xiàn)熱纖梭菌的高密度培養(yǎng)。主要包括以下步驟 1)菌種 熱纖梭菌(Clostridium thermocellum) JYTOl 2)培養(yǎng)基的制備種子液培養(yǎng)基為=KH2PO4 I. 5g/L，K2HPO4 (anhydrous) 2. 9g/L，氮源 2. I g/L, MgCl2 6H20I.Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L, FeSO4 6H20 I. 25mg/L, Cysteine hydrochloride I.Og/L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 5. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid (MOPS) 10. Og/L,Yeast extract 6. Og/L, Sodium citrate *2H20 3. Og/L配制發(fā)酵培養(yǎng)基,初始pH 為 7. 4。高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方KH2P04 I. 2g/L，K2HPO4 (anhydrous) 6. Og/L，氮源 5. Og/L, MgCl2 6H202.49g/L, CaCl2 2H20 150mg/L, FeSO4 6H20 I.25mg/L, Cysteine hydrochloride 2.Og/ L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 20. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid (MOPS) 10. Og/L,Yeast extract 12. Og/L, Sodium citrate *2H20 0. 752g/L 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并滅菌。滅菌前調(diào)節(jié)pH為8. O。
3)接種 將培養(yǎng)好的種子液按I : 20-1 60(V V)比例接入?yún)捬跗炕虬l(fā)酵罐中。
4)培養(yǎng) 溫度50-70°C，厭氧，罐或瓶壓為-0. IMPa 0. IMPa,攪拌轉(zhuǎn)速為60-100rpm。高底物濃度(碳源濃度大于15g/L)發(fā)酵時應控制pH為6. 0-8. O。培養(yǎng)時間為12h-48h。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征是所用菌株為熱纖梭菌(ClostridiumthermoceI lum) JYTOI以及在它們基礎上進行的任何突變株。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征是所述優(yōu)選發(fā)酵條件為厭氧，溫度為60-65°C，罐或瓶壓為-0. IMPa 0. IMPa，接種量為I : 40-1 50 (V/V)，高底物濃度(碳源濃度大于15g/L)上罐發(fā)酵吋，需控制pH恒定為6. 5-8. 0，攪拌轉(zhuǎn)速為70-80rpm，發(fā)酵時間為24h-48h。
4.根據(jù)權利要求I所述的方法，碳源為纖維素質(zhì)生物質(zhì)，氮源為有機或無機氮源；當增加碳源濃度時，應保持碳氮比為5. 5 1-5 I。
5.根據(jù)權利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征是所述碳源為纖維ニ糖，木聚ニ糖中之一或它們的任何組合。
6.根據(jù)權利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征是所述氮源為有機氮源，包括酵母粉，尿素、玉米漿、生物素中之一或它們的任何組合。
7.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征是所述發(fā)酵的方式分批發(fā)酵，補料-分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領域，具體是一種熱纖梭菌高密度培養(yǎng)的方法。其特征是以GS-2培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，通過多元數(shù)理統(tǒng)計方法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，快速高效的提高熱纖梭菌的菌體濃度。本發(fā)明的優(yōu)點在于提供了一種快速獲取熱纖梭菌大量菌體濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基，為后續(xù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化纖維素為生物乙醇效率特別高的纖維小體做鋪墊。本發(fā)明所得熱纖梭菌的菌體密度比初始培養(yǎng)基提高6～9倍，瓶裝條件下OD600達到8.85，發(fā)酵罐中OD600達到12.7。
文檔編號C12N1/20GK102864089SQ20111018909
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權日2011年7月7日
發(fā)明者崔球, 朱新術, 張華仁, 張景濤 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所