專利名稱：一種牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種適用于牛奶或奶粉中的植物源摻加物的PCR擴增檢測方法。
背景技術(shù)：
牛奶營養(yǎng)豐富，蛋白含量高質(zhì)量優(yōu)，受到消費者的喜愛。奶粉是牛奶的干制品，在乳制品中擁有重要地位。但是現(xiàn)在市場競爭激烈，部分商販為謀取利益往往摻假，在牛奶及奶制品中摻加植物源摻加物，包括豆?jié){、豆粉、大豆分離蛋白等。對牛奶中植物成分檢測的傳統(tǒng)的化學(xué)方法已經(jīng)有研究，但是由于這些方法存在檢測對象單一、靈敏度低、易受外源因素干擾等缺點，無法準確、快速、高通量的進行區(qū)分鑒別。國標法對蛋白質(zhì)檢測則設(shè)備復(fù)雜， 操作較繁瑣，費用較高，耗時較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決對牛奶或奶粉中植物源成分檢測的化學(xué)方法存在靈敏度低，易受外源因素干擾等缺點，特別是目前食品中蛋白質(zhì)的測定方法不能將植物蛋白和動物蛋白區(qū)分開來的問題，進而提供一種適用于牛奶或奶粉中的植物源摻加物的PCR檢測方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的方案是一種牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，首先對待測產(chǎn)品的 DNA模板進行提取，然后采用牛特異性引物和植物源特異性引物對提取的基因組DNA進行 PCR擴增，同時對牛源DNA進行PCR擴增做為陰性對照組，對植物源DNA進行PCR擴增做為陽性對照組，然后對所有擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析；最后根據(jù)被測產(chǎn)品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽性對照組和陰性對照組進行比對，即可判定產(chǎn)品中是否添加了植物源摻加物。牛特異性引物1和植物特異性引物2具有的核苷酸序列為引物1-1 5' -GCCATA TAC TCT CCT TGG TGA CA-3'；引物 1-2 5' -GTA GGC TTG GGAATA GTA CGA-3‘；引物 2-1 5' -AAT CTT CTA CTG GTA CAT GGA C—3'；引物2—2 5' -TCA TCA TCT TTG GTA AAA TCA AG-3'。PCR反應(yīng)所用試劑還包括Taq酶、dNTPUOX緩沖液、MgCl2和滅菌水。所述植物源包括豆?jié){、豆粉、大豆分離蛋白或米湯。所述的PCR引物濃度為0. 1-0. 4μ mol/L。最佳方案為，所述的PCR引物濃度為 0.2 μmol/L。所述PCR反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性92 96°C3 8min ；變性92 96°C 20 40s，退火52 60°C 20 40s，延伸72°C 30 120s，共31 ；35個循環(huán)，最后延伸72°C 3 lOmin。 最佳方案為，所述PCR反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性94°C 4min ；變性94°C 30s，退火30s，延伸72°C 60s，共35個循環(huán)，最后延伸720C 7min。
進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 5 2. 0%。最佳方案質(zhì)量濃度為1.7%。本發(fā)明采用分子生物學(xué)中的單一和雙重PCR技術(shù)，可以快速、準確、靈敏地從基因角度對牛奶和奶粉中植物源成分的摻入情況進行定性和半定量分析，為市場監(jiān)督部門和檢驗檢疫部門提供技術(shù)保障。此方法操作簡單，費用低，耗時短，特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，能檢測到牛奶中摻入的植物成分低至0. 1 %，適于推廣應(yīng)用。
具體實施例方式下面詳細闡述本發(fā)明優(yōu)選的實施例。實施例一本實施例所述檢測方法依次包括以下步驟a.對待測產(chǎn)品的DNA模板進行提取，S卩，提取產(chǎn)品基因組的DNA。產(chǎn)品的DNA提取方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中的任意一種公知方法，比如CTAB法、SDS 法，也可以是本申請人于2011年4月1日申請的、申請?zhí)枮?01110081615. 8、名稱為“一種大豆分離蛋白基因組DNA的提取方法”中所闡述的方法，區(qū)別只在于用本發(fā)明所述的牛奶或乳粉替換上述申請中的大豆分離蛋白。申請人在此將該方法闡述如下首先，將預(yù)先加入了已知量豆粉(添加量后面闡述)的待測奶粉與TE緩沖液(濃度不限)充分混合制成TE混合液(混合比例無需限定)，所述TE緩沖液也可以用水代替， 目的只在于使其成為液體；然后，加入液體二倍體積的異硫氰酸胍裂解液，充分混勻，室溫裂解，裂解時間為 20 60min。所述異硫氰酸胍裂解液中含50 IOOmM pH 6. 0 8. OTris-HCl ；10 IOOmM pH 8. OEDTA ；5M 異硫氰酸胍；體積含量 1. 3% TritonX-IOO0第三步采用酚、氯仿/異戊醇抽提蛋白，所述的酚、氯仿/異戊醇的體積比例為 25 24 1，所述的氯仿/異戊醇的體積比例為M 1。第四步采用異丙醇沉淀DNA，沉淀溫度為-20 30°C，沉淀時間為20 60min。第五步乙醇洗滌，使用的乙醇體積濃度為70 95 % ；第六步室溫晾干，晾干的時間為10 15min。第七步將第六步所得產(chǎn)品完全溶解于TE緩沖液(濃度不限)或滅菌水中，即得到基因組DNA的TE溶液，4°C或_20°C保存?zhèn)溆?。b.對前述過程得到基因組DNA的TE溶液(即模板DNA溶液)進行PCR擴增，同時對牛源DNA和植物源DNA進行PCR擴增。本專利提到的植物源可以是豆?jié){、豆粉、大豆分離蛋白、米湯或者其它一切植物源物質(zhì)。PCR擴增所用試劑包括Taq酶、dNTP (脫氧核糖核苷三磷酸)、10 X緩沖液、MgCl2、 滅菌水、引物和模板DNA。本實施例為雙重PCR反應(yīng)體系，控制的工藝參數(shù)為10XPCR 緩沖液 + (NH4)2SO42.5 μ L
MgCl2(25mM)1.5 μ L
dNTP(lOmM)1.0 μ L
DNATaq 聚合酶0.2 μ L
牛特異性上游引物(10 μ Μ)1.0 μ L
牛特異性下游弓丨物(10 μ Μ)1.0 μ L植物特異性上游引物(10 μ Μ)1.0 μ L
植物特異性上游引物(10 μ Μ)1.0 μ L
ddH2015.8 μ L對提取的基因組DNA進行PCR擴增采用牛特異性引物和植物源特異性引物，所述的PCR引物濃度為0. 1_0.41111101/1，較佳的引物濃度為0.21111101/1。牛特異性引物1 和植物特異性引物2具有的核苷酸序列為引物1-1 5' -GCCATA TAC TCT CCT TGG TGA CA-3'；引物 1-2 5' -GTA GGC TTG GGA ATAGTA CGA-3‘；引物2-1 5' -AAT CTT CTA CTG GTA CAT GGA C-3'；引物 2-25' -TCA TCA TCT TTG GTA AAA TCA AG_3'。對牛源DNA進行PCR擴增做為陰性對照組，對植物源DNA進行PCR擴增做為陽性對照組，以判定待測產(chǎn)品植物源摻加物的陽性或陰性。對前述提取的基因組DNA、牛源DNA和植物源DNA進行PCR擴增都采用相同的溫度及時間，即，循環(huán)條件為預(yù)變性92°C 3min ；變性92°C 20s，退火52°C 20s，延伸72°C 30s，共 ；35個循環(huán)，最后延伸72°C :3min。c.對所有擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析，該電泳分析方法為公知技術(shù)。進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 5%。最后根據(jù)被測產(chǎn)品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽性對照組和陰性對照組進行比對，即可判定待測產(chǎn)品植物源摻加物的陽性或陰性，從而可知產(chǎn)品中是否添加了植物源摻加物。本實施例添加的豆粉質(zhì)量比例分別占奶粉的0. 1 %，0. 5 %，2. 5 %，10 %，40 %，然后以該奶粉為待測產(chǎn)品，采用本實施例所述的工藝過程及控制參數(shù)，申請人成功地檢測出此系列奶粉中的豆粉，最低檢出限為0. 1%，其檢測精度達到了 100%。實施例二 本實施例與實施例一的區(qū)別僅在于以大豆分離蛋白為植物源摻加物，大豆分離蛋白所占奶粉的質(zhì)量比例仍為0.1^,0.5^,2.5^,3.5^,5 ^以該奶粉為待測產(chǎn)品，所控制工藝參數(shù)與實施例一完全相同。結(jié)論申請人成功地檢測出此系列奶粉中的大豆分離蛋白，最低檢出限為0. 1%，其檢測精度達到了 100%。實施例三本實施例與實施例一的區(qū)別在于步驟a中，以豆?jié){為植物源摻加物。步驟b中，對提取的基因組DNA、牛源DNA和植物源DNA進行PCR擴增采用的反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 4min ；變性94°C 30s，退火30s，延伸72°C 60s，共35個循環(huán)，最后延伸 72 0C 7min。
步驟c中，進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 7%。 本實施例仍為雙重PCR反應(yīng)體系，控制的工藝參數(shù)為
10XPCR 緩沖液 + (NH4)2SO4 2.5 μ L
MgCl2(25mM)1.5 μ L
dNTP(lOmM)1.0 μ L
DNATaq 聚合酶0.2 μ L
牛特異性上游引物(10 μ Μ)0.5 μ L
牛特異性下游引物(10 μ Μ)0.5 μ L
植物特異性上游引物(10 μ Μ)0.5 μ L
植物特異性上游引物(10 μ Μ)0.5 μ L
ddH2017.8 μ L本實施例以摻入體積分數(shù)分別為0. 1%，0. 5%，2. 5%，10%，40%豆?jié){的牛奶為待測產(chǎn)品，采用本實施例所述的工藝過程及控制參數(shù)，申請人成功地檢測出此系列牛奶中含有的豆?jié){，最低檢出限為0. 1%，其檢測精度達到了 100%。實施例四本實施例與實施例一的區(qū)別僅在于步驟a中，以豆?jié){為植物源摻加物。步驟b中，對提取的基因組DNA、牛源DNA和植物源DNA進行PCR擴增采用的反應(yīng)條件為預(yù)變性96°C 8min ；變性96°C 40s，退火60°C 40s，延伸72°C 120s，共31個循環(huán)，最后延伸 72°C IOmin0步驟c中，進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為2. 0%。本實施例采用單重PCR反應(yīng)體系，控制的工藝參數(shù)為
滅菌 ddH2018.8μ
IOxPCRBuffer2.5^
MgCl2(25mM)1.5μ
dNTP(lOmM)0.5pL
?；蛑参镄蕴禺愋陨?、下游引物(ΙΟμΜ) O^L DNATaq 聚合酶0.2pL
模板 DNALOnL
本實施例以摻入體積分數(shù)分別為0. 1%，0. 5%，2. 5%，10%，40%豆?jié){的牛奶為待
6測產(chǎn)品，采用本實施例所述的工藝過程及控制參數(shù)，申請人成功地檢測出此系列牛奶中含有的豆?jié){，最低檢出限為0. 1%，其檢測精度達到了 100%。實施例五本實施例與實施例四的區(qū)別僅在于步驟a中，以豆粉為植物源摻加物。步驟c中，采用單重PCR反應(yīng)體系，控制的工藝參數(shù)為
滅菌 ddH2018.3^
IOxPCR Buffer
MgCl2(25mM)I^L
dNTP(lOmM)0.5叫
?；蛑参镄蕴禺愋陨稀⑾掠我?ΙΟμΜ) l.OpL DNArTaq 聚合酶
模板 DNA1.0|iL本實施例以分別添加T占奶粉質(zhì)量比例0. 1%,0.5%,2.5%,5%,10%, 40 %豆粉的奶粉為待測產(chǎn)品，采用本實施例所述的工藝過程及控制參數(shù)，申請人成功地檢測出此系列奶粉中含有的豆粉，最低檢出限為0. 1%，其檢測精度達到了 100%。
權(quán)利要求
1.一種牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，首先對待測產(chǎn)品的DNA模板進行提取，然后采用牛特異性引物和植物源特異性引物對提取的基因組 DNA進行PCR擴增，同時對牛源DNA進行PCR擴增做為陰性對照組，對植物源DNA進行PCR 擴增做為陽性對照組，然后對所有擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析；最后根據(jù)被測產(chǎn)品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽性對照組和陰性對照組進行比對，即可判定產(chǎn)品中是否添加了植物源摻加物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，牛特異性引物1和植物特異性引物2具有的核苷酸序列為引物1-1 5' -GCC ATATAC TCT CCT TGG TGA CA-3'；引物 1-2 5' -GTA GGC TTG GGA ATA GTA CGA-3‘；引物 2-1 5' -AAT CTT CTA CTG GTA CAT GGA C-3'；引物 2-2 5' -TCA TCA TCT TTG GTA AAATCA AG-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，PCR反應(yīng)所用試劑還包括Taq酶、dNTPUOX緩沖液、MgCl2和滅菌水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述植物源包括豆?jié){、豆粉、大豆分離蛋白或米湯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述的PCR引物濃度為0. 1-0. 4μ mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述的PCR引物濃度為0. 2 μ mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR 檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性92 96°C 3 Smin ；變性92 960C 20 40s，退火52 60°C 20 40s，延伸72°C 30 120s，共31 35個循環(huán)，最后延伸 720C 3 IOmin0
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性94°C 4min ；變性94°C 30s，退火30s，延伸 72°C 60s，共；35個循環(huán)，最后延伸72°C 7min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR 檢測方法，其特征在于，進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 5 2. 0%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 7%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種牛奶或乳粉中植物源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。所用試劑包括Taq酶、dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)、10×緩沖液、MgCl2、滅菌水、引物和模板DNA。按照如下步驟進行檢測對被測樣品的DNA模板進行提取、PCR擴增及對擴增產(chǎn)物進行分析，從而判定是否有植物源摻加物，該方法的檢出限為0.1％。本發(fā)明提供的方法可快速、準確地檢測出被檢樣品中的植物源摻加物，以有效解決乳品企業(yè)現(xiàn)有的摻假檢測漏洞，為實現(xiàn)從分子水平對乳和乳制品質(zhì)量的控制提供研究基礎(chǔ)。本方法成本低、敏感性高、操作簡便、耗時短，適用于食品質(zhì)量和安全檢測領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK102367472SQ20111018916
公開日2012年3月7日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者仇麗亞, 徐偉麗, 李啟明, 汪家琦, 馬鶯 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)