專(zhuān)利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多重耐藥cfr基因的引物及檢測(cè)多重耐藥cfr基因的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)菌基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多重耐藥c/r基因的引物，還涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)多重耐藥cfr基因的試劑盒，還涉及用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)多重耐藥cfr基因的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用和不合理使用，使得細(xì)菌的耐藥性愈來(lái)愈強(qiáng)，出現(xiàn)了大量的多重耐藥菌株(MDR0)。目前常見(jiàn)的包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)JiR 古霉素腸球菌(VRE)、產(chǎn)生超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的細(xì)菌(如大腸桿菌、克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌等)和多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等。這些耐藥菌株分布廣， 傳播快，容易產(chǎn)生暴發(fā)流行，對(duì)臨床普遍使用的多種抗菌藥物耐藥，給臨床治療及醫(yī)院感染控制帶來(lái)困難。C/r基因是從革蘭氏陽(yáng)性菌發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)可介導(dǎo)氯霉素、氟苯尼考耐藥的23S rRNA甲基化酶，具有多耐藥的表型，可同時(shí)介導(dǎo)對(duì)氯霉素，林可霉胺類(lèi)，惡唑烷酮類(lèi)，鏈陽(yáng)菌素A和截短側(cè)耳素類(lèi)等五類(lèi)藥物的耐藥，因此具有cfr基因的細(xì)菌有著明顯的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)。 C/r基因合成的蛋白質(zhì)在細(xì)菌耐抗生素機(jī)制中發(fā)揮重要作用，它能很容易從非人類(lèi)病原體傳播給其他能感染人的細(xì)菌類(lèi)型，可感染多種耐抗生素細(xì)菌。對(duì)于具有c/r基因多重耐藥菌的實(shí)驗(yàn)室診斷主要基于抗藥性表型檢測(cè)和PCR技術(shù)進(jìn)行基因確證。但由于PCR具有易出現(xiàn)假陽(yáng)性，檢測(cè)成本高，操作比較復(fù)雜，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)， 一般需要2 3小時(shí)，影響到臨床攜帶多重耐藥c/r基因的檢測(cè)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決PCR擴(kuò)增易出現(xiàn)假陽(yáng)性、檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，填補(bǔ)使用LAMP檢測(cè)多重耐藥c/r基因的空白，本發(fā)明提供了用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多重耐藥c/r基因的引物。本發(fā)明建立了一種多重耐藥c/r基因LAMP檢測(cè)方法，根據(jù)多重耐藥c/r基因保守區(qū)的6段序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性內(nèi)引物，一對(duì)特異性外引物和一個(gè)環(huán)引物。本發(fā)明還提供了檢測(cè)多重耐藥c/r基因的試劑盒。本發(fā)明還提供了檢測(cè)多重耐藥c/r基因的檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的
一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多重耐藥基因的引物，包括一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一個(gè)環(huán)引物，引物核苷酸序列如下
夕卜弓I物 F3 :5，-TCTTGAGCATGCAAACGA-3，， 夕卜弓I物 B3 :5，-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3，，
內(nèi)引物 FIP :5，-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3，， 內(nèi)引物 BIP :5，-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3，， 環(huán)引物 L :5，-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3，。其中，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。
一種檢測(cè)多重耐藥cfr基因的試劑盒，包括若干個(gè)裝有反應(yīng)液的LAMP反應(yīng)管，
其中，每25 μ L反應(yīng)液中含有12. 5 μ L 2X等溫反應(yīng)緩沖液、1.0 μ L Bst DNA聚合酶、40 pmol 內(nèi)引物 FIP、40 pmol 內(nèi)引物 BIP、5 pmol 外引物 F3、5 pmol 夕卜引物 B3、20 pmol 環(huán)引物L(fēng)、余量為滅菌雙蒸水；
其中，Bst DNA聚合酶的活性單位為8U/ μ L ；
2Χ 等溫反應(yīng)緩沖液中含有 40 mM ρΗ 為 8. 8 的 iTris-HCUO mM KCl,16 mM MgSO4,20 mM (NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、1.6 M 甜菜堿、2.8 mM dNTP。所述的試劑盒，還包括1 μ L鈣黃綠素。一種檢測(cè)多重耐藥c/r基因的檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)提取待檢細(xì)菌基因組總DNA；
(2)使用所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作為將待檢細(xì)菌基因組DNA加入LAMP反應(yīng)管的反應(yīng)液內(nèi)，混勻，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照中加入反應(yīng)液內(nèi)的為含有多重耐藥cfr基因的松鼠葡萄球菌基因組DNA，陰性對(duì)照中加入反應(yīng)液內(nèi)的為滅菌雙蒸水，將LAMP 反應(yīng)管置水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為63°C水浴恒溫反應(yīng)35 min0步驟(2)中待檢細(xì)菌基因組DNA為含DNA的濃度為0.003-300 ng/μ L的DNA溶液。所述的檢測(cè)方法，LAMP反應(yīng)管中出現(xiàn)白色沉淀為陽(yáng)性結(jié)果，不出現(xiàn)白色沉淀為陰性結(jié)果。所述的檢測(cè)方法，在擴(kuò)增反應(yīng)前的反應(yīng)管中加入1 μ L鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)榫G色的為陽(yáng)性結(jié)果，橙色的是陰性結(jié)果。步驟(1)中提取待檢細(xì)菌基因組DNA包括以下步驟將待檢的細(xì)菌菌株過(guò)夜培養(yǎng)后，取1 mL的菌液12000 rpm離心2 min，徹底棄上清，取沉淀用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，最后溶于50 μ L滅菌雙蒸水中，-20 °C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的有益效果是
1、本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，比PCR檢測(cè)方法靈敏度更高，不需要昂貴的PCR儀器，只需要普通的金屬浴或水浴鍋即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀察，通過(guò)肉眼觀察白色沉淀產(chǎn)生或使用熒光染料顯色肉眼直接觀察即可判定結(jié)果，時(shí)間大大縮短，從普通PCR 儀的2 3小時(shí)縮短為35 min左右，簡(jiǎn)單而快速，可廣泛用于獸醫(yī)及人醫(yī)領(lǐng)域包括實(shí)驗(yàn)室及臨床基層對(duì)攜帶c/r基因的多重耐藥細(xì)菌的快速檢測(cè)；
2、本方法中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)對(duì)儀器設(shè)備要求不高，臨床上容易做到，檢測(cè)時(shí)間較短，不超過(guò)1個(gè)小時(shí)，為快速，準(zhǔn)確診斷c/r基因探索一種新方法，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外用于 LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)多重耐藥cfr基因的空白。


圖1為實(shí)施例2擴(kuò)增得到的產(chǎn)物通過(guò)肉眼直接觀察白色沉淀的檢測(cè)結(jié)果，其中，1號(hào)管為陰性對(duì)照，2號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照，3號(hào)管為檢測(cè)管；
圖2為實(shí)施例3中LAMP方法檢測(cè)多重耐藥c/r基因靈敏度肉眼直接觀察白色沉淀的檢測(cè)結(jié)果，其中1-7號(hào)管中加入的為倍比稀釋的含多重耐藥c/r基因的松鼠葡萄球菌基因組DNA，8號(hào)管為陰性對(duì)照；
圖3為實(shí)施例3中普通PCR方法檢測(cè)多重耐藥c/r基因靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中1_7號(hào)PCR模板為倍比稀釋的含多重耐藥c/r基因的松鼠葡萄球菌基因組DNA，8號(hào)為陰性對(duì)照； 圖4為實(shí)施例4中LAMP方法檢測(cè)多重耐藥cfr基因特異性檢測(cè)結(jié)果，1-8號(hào)管為檢測(cè)到的陽(yáng)性菌株結(jié)果，9號(hào)管為陰性菌株結(jié)果，10號(hào)管為陰性對(duì)照，11號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照；
圖5為實(shí)施例4中普通PCR方法檢測(cè)多重耐藥c/r基因特異性檢測(cè)結(jié)果，1-8號(hào)為檢測(cè)到的陽(yáng)性菌株結(jié)果，9號(hào)為陰性菌株結(jié)果，10號(hào)為陰性對(duì)照，11號(hào)為陽(yáng)性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1 制備檢測(cè)多重耐藥cfr基因的試劑盒
設(shè)置檢測(cè)多重耐藥cfr基因的試劑盒，該試劑盒包括裝有反應(yīng)液的LAMP反應(yīng)管， 反應(yīng)液以25 μ L計(jì)，含有12. 5 μ L 2X等溫反應(yīng)緩沖液、1.0 μ L Bst DNA聚合酶、40 pmol內(nèi)引物FIP、40 pmol內(nèi)引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol環(huán)引物L(fēng)、余量為滅菌雙蒸水；
其中，Bst DNA聚合酶的活度單位為SU/μ L ；
2Χ 等溫反應(yīng)緩沖液中含有 40 mM ρΗ 為 8. 8 的 iTris-HCUO mM KCl,16 mM MgSO4,20 mM (NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、1.6 M 甜菜堿、2· 8 mM dNTP。外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)的核苷酸序列如下 夕卜弓I物 F3 :5，-TCTTGAGCATGCAAACGA-3，，
夕卜弓I物 B3 :5，-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3，，
內(nèi)引物 FIP :5，-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3，， 內(nèi)引物 BIP :5，-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3，， 環(huán)引物 L :5，-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3，。其中，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。為了設(shè)置對(duì)照組，每個(gè)試劑盒中最少設(shè)置三個(gè)LAMP反應(yīng)管，此試劑盒設(shè)置六個(gè) LAMP反應(yīng)管。擴(kuò)增產(chǎn)物的副產(chǎn)物焦磷酸離子與Mg2+反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生焦磷酸鎂(白色沉淀)的衍生物， 此衍生物與生成的擴(kuò)增產(chǎn)物成正比，由于LAMP法能產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，衍生物產(chǎn)量也會(huì)大增，于是可以呈現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的白色沉淀，可驗(yàn)證是否有靶基因的存在。為了更明顯的觀察擴(kuò)增結(jié)果，試劑盒中設(shè)置有熒光染料鈣黃綠素(螯合劑)，與試劑中的錳離子(Mn2+)結(jié)合處于淬滅狀態(tài)，擴(kuò)增產(chǎn)物的副產(chǎn)物焦磷酸離子與Mn2+結(jié)合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光。因此便于根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物顏色變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)^ ο實(shí)施例2 用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)多重耐藥cfr基因的檢測(cè)方法
(1)提取待檢臨床菌株的基因組總DNA:將待檢的臨床菌株過(guò)夜培養(yǎng)后，取1 mL的菌液 12000 rpm離心2 min，徹底棄上清，取沉淀用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取細(xì)菌基因組總DNA，最后溶于50 μ L滅菌雙蒸水中，測(cè)定DNA濃度為300 ng/uL,-20 °C保存?zhèn)溆谩?2)LAMP擴(kuò)增使用實(shí)施例1中的試劑盒，設(shè)置兩套反應(yīng)體系，其中一套加入熒光染料，另一套不加入。每套體系中都設(shè)置檢測(cè)管、一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照管和一個(gè)陰性對(duì)照管。在檢測(cè)管內(nèi)加入2 μ L待檢DNA樣本，陽(yáng)性對(duì)照管中加入2 μ L含c/r基因的松鼠葡萄球菌基因組DNA，陰性對(duì)照管中加入2 μ L滅菌雙蒸水。加完后混勻，稍離心，使沾在管壁上的樣品也溶解在反應(yīng)液中。將反應(yīng)管置水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為63°C水浴恒溫反應(yīng)35
mirio(3)結(jié)果分析
①在加入熒光染料反應(yīng)體系的反應(yīng)管中觀察反應(yīng)后的混合液顏色，陽(yáng)性對(duì)照管變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照管中為橙色，檢測(cè)管中為綠色，說(shuō)明待檢細(xì)菌中含有多重耐藥c/r基因，因圖片處理成黑白之后，顏色對(duì)比完全看不出來(lái)，所以相應(yīng)的圖沒(méi)有附上；
②在不加熒光染料的反應(yīng)體系中，陽(yáng)性對(duì)照管中出現(xiàn)白色沉淀，陰性對(duì)照管中未出現(xiàn)白色沉淀，檢測(cè)管中出現(xiàn)白色沉淀，如圖1所示，說(shuō)明待檢細(xì)菌中含有多重耐藥c/r基因。實(shí)施例3 多重耐藥cfr基因LAMP檢測(cè)方法和普通PCR方法檢測(cè)靈敏度比較取含cfr基因的松鼠葡萄球菌細(xì)菌基因組DNA (濃度為300 ng/ μ L)，按10倍比稀釋?zhuān)?br> 分別為原液的1，IO"1,10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，分別取1 μ L作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)和PCR反應(yīng)的模板，以滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。即LAMP反應(yīng)和PCR反應(yīng)中的廣7管分別加入以上倍比稀釋的含c/r基因的細(xì)菌基因組DNA 1 μ L，第8管加入滅菌雙蒸水1 μ L。其中LAMP反應(yīng)置于63°C恒溫水浴鍋中反應(yīng)35 min,反應(yīng)結(jié)束后未加熒光染料鈣黃綠素的反應(yīng)管直接用肉眼觀察白色沉淀產(chǎn)生與否，加入熒光染料鈣黃綠素的反應(yīng)管觀察顏色變化。 PCR反應(yīng)中所用引物為根據(jù)NCBI上已知的c/r基因保守序列用ft~imer5. 0軟件設(shè)計(jì)，按以下堿基序列經(jīng)DNA合成儀合成。上游引物為c/r-F :5，-CGATTTGAGGATATGAAGGTTCT-3，， 下游引物為 c/r-R :5，-AAATTAGGATCCGTAAACGAAT-3，，
擴(kuò)增目的片段為416 bp。PCR反應(yīng)體系設(shè)置為總體積25 μ L，其中10XPCR緩沖液 2. 5 μ L、dNTP 0. 5 μ LUO μ M cfr~V 0. 5 μ LUO μ M cfi-R 0. 5 μ L、Taq DNA 聚合酶0.25 1^、模板1 μ L，滅菌雙蒸水補(bǔ)齊25 UL0 PCR產(chǎn)應(yīng)條件為95°C lOmin，然后進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為 94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 1 min，最后 72°C 延伸 10 min, 4°C forever，反應(yīng)時(shí)間是2 h7 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。LAMP結(jié)果顯示，不加熒光染料鈣黃綠素的反應(yīng)管廣6管內(nèi)均出現(xiàn)白色沉淀，7、管內(nèi)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生，如圖2所示。加入熒光染料鈣黃綠素的反應(yīng)管內(nèi)的液體顏色，Γ6管內(nèi)顏色均為明顯的綠色，7、管內(nèi)顏色均為橙色。因圖片處理成黑白之后，顏色對(duì)比完全看不出來(lái)，所以相應(yīng)的圖沒(méi)有附上。結(jié)果說(shuō)明原液稀釋10_5還可以檢測(cè)到多重耐藥c/r基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)顯示反應(yīng)管廣4均出現(xiàn)目的條帶，且條帶越來(lái)越淡，而5、 未出現(xiàn)目的條帶。說(shuō)明原液稀釋10_3可以檢測(cè)到多重耐藥c/r基因，如圖3所示。綜合LAMP和PCR反應(yīng)結(jié)果可以得出，LAMP反應(yīng)靈敏度比PCR反應(yīng)要高2個(gè)數(shù)量級(jí)(至少100倍)，且反應(yīng)時(shí)間比PCR縮短廣1. 5小時(shí)，不需要用凝膠電泳檢測(cè)，直接通過(guò)肉眼觀察白色沉淀或加入染料顯色即可判定結(jié)果。實(shí)施例4 多重耐藥cfr基因LAMP檢測(cè)方法和普通PCR方法特異性比較將臨床分離的50株豬源葡萄球菌分別提取基因組DNA，按照本發(fā)明所建立的多重耐藥
基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以實(shí)施例3的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以豬源松鼠葡萄球菌(含cfr基因)基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照，檢測(cè)提取的50份豬源葡萄球菌基因組DNA，驗(yàn)證本發(fā)明所建立的LAMP方法的特異性。 結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均正常，LAMP結(jié)果中有8株檢測(cè)到cfr陽(yáng)性，PCR結(jié)果也檢測(cè)到相同的8株出現(xiàn)cfr特異性條帶，其余均為陰性結(jié)果。LAMP檢測(cè)部分結(jié)果和PCR檢測(cè)部分對(duì)應(yīng)結(jié)果分別如圖4和圖5所示。說(shuō)明本發(fā)明所建立的LAMP方法檢測(cè)多重耐藥c/r 基因特異性好，與PCR方法一致性達(dá)100%，由于LAMP方法更加直觀簡(jiǎn)便，且耗時(shí)短，因此更加適合臨床快速檢測(cè)的需要。
權(quán)利要求
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多重耐藥c/r基因的引物，其特征在于包括一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一個(gè)環(huán)引物，引物核苷酸序列如下夕卜弓I物 F3 :5， -TCTTGAGCATGCAAACGA-3，， 夕卜弓I物 B3 :5，-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3，，內(nèi)引物 FIP :5，-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3，， 內(nèi)引物 BIP :5，-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3，， 環(huán)引物 L :5，-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3，，其中，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。
2.一種檢測(cè)多重耐藥c/r基因的試劑盒，其特征是包括若干個(gè)裝有反應(yīng)液的LAMP反應(yīng)管，其中，每25 μ L反應(yīng)液中含有12. 5 μ L 2 X等溫反應(yīng)緩沖液、1.0 μ L Bst DNA聚合酶、40 pmol 內(nèi)引物 FIP、40 pmol 內(nèi)引物 BIP、5 pmol 外引物 F3、5 pmol 外引物 B3、20 pmol 環(huán)引物L(fēng)、余量為滅菌雙蒸水；其中，Bst DNA聚合酶的活性單位為8U/ μ L ；2Χ 等溫反應(yīng)緩沖液中含有 40 mM ρΗ 為 8. 8 的 iTris-HCUO mM KCl,16 mM MgSO4,20 mM (NH4)2S04、0. 2wt% Tween20、1.6 M 甜菜堿、2.8 mM dNTP。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包括1μ L鈣黃綠素。
4.一種檢測(cè)多重耐藥c/r基因的檢測(cè)方法，其特征是包括以下步驟(1)提取待檢細(xì)菌基因組總DNA；(2)使用權(quán)利要求2或3所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作為將待檢細(xì)菌基因組DNA 加入LAMP反應(yīng)管的反應(yīng)液內(nèi)，混勻，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照中加入反應(yīng)液內(nèi)的為含有多重耐藥c/r基因的松鼠葡萄球菌基因組DNA，陰性對(duì)照中加入反應(yīng)液內(nèi)的為滅菌雙蒸水，將LAMP反應(yīng)管置水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為63°C水浴恒溫反應(yīng)35 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征是步驟(2)中待檢細(xì)菌基因組DNA為含DNA 的濃度為0. 003-300 ng/ μ L的DNA溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征是LAMP反應(yīng)管中出現(xiàn)白色沉淀為陽(yáng)性結(jié)果，不出現(xiàn)白色沉淀為陰性結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征是在擴(kuò)增反應(yīng)前的反應(yīng)管中加入1μ L鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)榫G色的為陽(yáng)性結(jié)果，橙色的是陰性結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)菌基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多重耐藥cfr基因的引物，包括一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一個(gè)環(huán)引物，外引物與內(nèi)引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。檢測(cè)多重耐藥cfr基因的試劑盒，包括若干個(gè)裝有反應(yīng)液的LAMP反應(yīng)管，反應(yīng)液中含有等溫反應(yīng)緩沖液、BstDNA聚合酶、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、外引物F3、外引物B3、環(huán)引物L(fēng)和滅菌雙蒸水。一種檢測(cè)多重耐藥cfr基因的檢測(cè)方法，提取待檢細(xì)菌基因組DNA；使用所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增條件為63℃水浴恒溫反應(yīng)35min。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，比PCR檢測(cè)方法靈敏度更高，時(shí)間大大縮短，簡(jiǎn)單而快速。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102230019SQ20111019047
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者劉玉慶, 張秀美, 朱曉玲, 杜以軍, 白華, 胡新新, 胡明, 駱延波, 齊靜 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所