專利名稱：一種八氫番茄紅素脫氫酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種八氫番茄紅素脫氫酶基因，尤其涉及一種高效合成番茄紅素的八氫番茄紅素脫氫酶基因及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
番茄紅素是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑，能高效淬滅單線態(tài)氧和清除自由基，其淬滅單線態(tài)氧速率常數(shù)是維生素E的100倍，因而番茄紅素具有重要的生理功能，如防癌、抗老化、提高免疫力等。目前商品化番茄紅素的獲得主要是從番茄中提取，這種方法需要大量的番茄來保證工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)性和低成本，而且番茄不便運(yùn)輸，其獲得受氣候條件影響較大。由于環(huán)境惡化和人們健康意識的提高，番茄紅素需求量越來越大，僅靠有限的番茄提取不能滿足市場需求，迫切需要開發(fā)新的獲得方法。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素周期短，能克服氣候和產(chǎn)地限制，大大降低生產(chǎn)成本，因而受到廣泛關(guān)注。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素主要是利用八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,ECl. 14. 99.-)對底物八氫番茄紅素脫氫生成。目前國際上進(jìn)行番茄紅素生產(chǎn)研究的八氫番茄紅素脫氫酶來源有限，需要尋找新的高效合成番茄紅素的酶源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種來源于固氮紅細(xì)菌的八氫番茄紅素脫氫酶基因及其應(yīng)用。一種八氫番茄紅素脫氫酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。上述八氫番茄紅素脫氫酶基因全長1557堿基，來源于固氮紅細(xì)菌(Iihodobacter azotoformans)m5，固氮紅細(xì)菌船5購自日本NITE Biological Resource Center (NBRC) 保藏編號為16436。由上述八氫番茄紅素脫氫酶基因編碼的八氫番茄紅素脫氫酶，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。該八氫番茄紅素脫氫酶全長518個(gè)氨基酸。一種含有上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的大腸桿菌表達(dá)載體。上述大腸桿菌表達(dá)載體為pET_22b表達(dá)載體。該pET_22b表達(dá)載體購自德國 Novagen 公司。上述八氫番茄紅素脫氫酶在制藥、食品領(lǐng)域方面的應(yīng)用。上述八氫番茄紅素脫氫酶基因在制備番茄紅素和鏈孢紅素方面的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下將八氫番茄紅素脫氫酶基因克隆到pET_22b表達(dá)載體上，與質(zhì)粒pACCRT-EB共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生番茄紅素和鏈孢紅素。上述質(zhì)粒pACCRT-EB，是通過將菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)的櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合成酶基因(crtE) (GenBank No. D90087)和八氫番茄紅素合成酶基因(crtB) (GenBank No. D90087)分別通過BamHI-SacI，NdeI-KpnI酶切位點(diǎn)連接到大腸桿菌表達(dá)載體 pACYCDuet-1 (Novagen, Germany)上構(gòu)建得至丨J。以上操作步驟、實(shí)驗(yàn)條件及試劑如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)操作和常用試劑。本發(fā)明有益效果如下本發(fā)明所述八氫番茄紅素脫氫酶基因經(jīng)克隆到pET_22b表達(dá)載體上，然后與質(zhì)粒 pACCRT-EB共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，可高效生產(chǎn)番茄紅素。經(jīng)檢測， 發(fā)酵液中番茄紅素產(chǎn)量為0. ^59mg/L，菌體干重中番茄紅素含量為0. 256mg/g,占類胡蘿卜素總量的73. 5%，固氮紅細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶重組酶催化產(chǎn)物以番茄紅素為主要色素成分，為番茄紅素生產(chǎn)提供了新的酶源。


圖1是本發(fā)明所述固氮紅細(xì)菌KA25重組八氫番茄紅素脫氫酶的SDS-PAGE電泳圖；其中，M、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、大腸桿菌重組八氫番茄紅素脫氫酶粗酶，2、穿過峰， 3、Washing Buffer 1 洗脫峰，4、Washing Buffer 2 洗脫峰，5、Eluting Buffer 洗脫峰。圖2是本發(fā)明所述固氮紅細(xì)菌KA25八氫番茄紅素脫氫酶基因與菠蘿泛菌 (Pantoea ananatis)的櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合成酶基因及八氫番茄紅素合成酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)中共表達(dá)，催化生成的類胡蘿卜素產(chǎn)物液相圖譜；其中，1、番茄紅素，2、鏈孢紅素。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但不限于此。實(shí)施例1 固氮紅細(xì)菌(Iihodobacter azotoformans) KA25八氫番茄紅素脫氫酶基因的PCR擴(kuò)增取購自日本NITE Biological Resource Center (NBRC)保藏編號為 16436 的固氮紅細(xì)菌(Iihodobacter azotoformans)KA25培養(yǎng)液5mL，用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行基因組提取，提取步驟參照Qiagen公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書。從GenBank中檢索同屬不同菌株八氫番茄紅素脫氫酶基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對引物F-I和R-I。引物序列如下F-I :5’ -ATGCCCGCGACCAAGCATGT-3，SEQ ID N0. 3R-I :5，-TCATTCCgCggCCAgCCTTT-3，SEQ ID NO. 4以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，采用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增?？傮w積為50μ L，超純水 18 μ L，2 XGC buffer I (含 MgCl2) 25 μ L，dNTP (各 2. 5mmol/L) 4 μ L，引物(20ymol/L)各 1 μ L,基因組DNA 25ng, TaKaRa LA Taq酶2. 5U。PCR擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性5分鐘，反應(yīng) 30個(gè)循環(huán)(95°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸1. 5分鐘)，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測，用Bioflux凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR片段切膠回收，測序大小為1557bp。所得產(chǎn)物即為固氮紅細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶基因片段，測得序列如SEQ ID No. 1。該段核苷酸序列全長1557bp，是一個(gè)完整的0RF，編碼518個(gè)氨基酸。該1557bp的ORF即為固氮紅細(xì)菌的八氫番茄紅素脫氫酶基因，其核苷酸序列及編碼的氨基酸序列分別為 SEQID No. 1 和 SEQ ID No. 2。實(shí)施例2 固氮紅細(xì)菌(Iihodobacter azotoformans) KA25八氫番茄紅素脫氫酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)和純化根據(jù)SEQ ID No. 1所示序列設(shè)計(jì)引物F-I_22b和R-I_22b，分別引入能插入 pET-22b質(zhì)粒的NdeUalI酶切位點(diǎn)(下劃線所示)，序列如下F-I-22b :5’ -GCGCATATGCCCGCGACCAAGCATGT-3’ SEQ ID NO. 5R-I-22b :5，-GCGGTCGACTTCCgCggCCAgCCTTTCA-3‘ SEQ ID NO. 6以提取的固氮紅細(xì)菌基因組DNA為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件和PCR產(chǎn)物回收方法同實(shí)施例1。PCR產(chǎn)物回收后加Ndel、Sail (NEB, USA)于37°C酶切 1小時(shí)，進(jìn)行DNA純化，采用同樣酶切方法處理pET-22b質(zhì)粒載體。將制備好的酶基因片段與pET-2^載體按一定比例混合，采用T4連接酶(NEB，USA)于16°C連接18小時(shí)，然后采用 CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化菌液涂布氨芐青霉素抗性LB平板，37°C 過夜培養(yǎng)。挑取生長良好的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)10小時(shí)，提取質(zhì)粒，通過酶切法和PCR法驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子，得到表達(dá)固氮紅細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶的大腸桿菌重組菌。將上述在氨芐青霉素抗性LB平板中生長良好的大腸桿菌重組菌接種于200mL LB 培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)至OD600達(dá)到0. 5 0. 9，加IPTG誘導(dǎo)，IPTG終濃度為0. 5mmol/L，25°C誘導(dǎo)培養(yǎng)30小時(shí)。離心收集菌體細(xì)胞，用lOOmmol/L Tris-HCl (pH7. 9)重懸后超聲波破碎。 破碎液12000rpm離心20分鐘后用鎳親和層析柱(GE，USA)進(jìn)行重組八氫番茄紅素脫氫酶的純化。純化中使用的溶液如下Binding Buffer =Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，濃 HCl 調(diào) ρΗ7· 9 ；Washing Bufferl 咪唑 20mmol/L，Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，濃 HCl 調(diào) ρΗ7· 9 ；Washing Buffer2 咪唑 50mmol/L，Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，濃 HCl 調(diào) ρΗ7· 9 ；Eluting Buffer 咪唑 200mmol/L，Tris · HCl 20mmol/L, NaCl 0. 5mol/L，濃 HCl 調(diào) ρΗ7· 9。上述純化過程中的收集峰用SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測，電泳采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方式，電泳分離膠濃度為10%，濃縮膠4%，電泳結(jié)果顯示酶蛋白單亞基分子量約為57士5kDa(如附圖1)。上述LB 培養(yǎng)液成分蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 7g/L，ρΗ7· 0 7. 5，121 °C 滅菌20分鐘。實(shí)施例3 固氮紅細(xì)菌(Iihodobacter azotoformans) KA25八氫番茄紅素脫氫酶基因和質(zhì)粒pACCRT-EB在大腸桿菌BL21中共表達(dá)將實(shí)施例2中獲得的固氮紅細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pACCRT-EB 共同轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)方法同實(shí)施例2。誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌離心后菌體用丙酮進(jìn)行類胡蘿卜素提取，HPLC檢測，色譜柱為TC-C18 (Agilent，USA)，流動相甲醇/乙腈(4/6)，流速ImL/分鐘，柱溫30°C，檢測波長474nm。
圖2顯示上述雙質(zhì)粒共表達(dá)大腸桿菌菌株產(chǎn)物主要有兩種類胡蘿卜素，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較，鑒定兩種類胡蘿卜素分別是番茄紅素和鏈孢紅素，其中番茄紅素相對含量為73. 5 %，鏈孢紅素為19. 1%。番茄紅素產(chǎn)量為0. 256mg/g細(xì)胞干重。上述質(zhì)粒pACCRT-EB，是通過合成菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)的櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合成酶基因(crtE) (GenBank No. D90087)和八氫番茄紅素合成酶基因(crtB) (GenBankNo. D90087)分別通過BamHUacI，NdeI-KpnI酶切位點(diǎn)連接到大腸桿菌表達(dá)載體 pACYCDuet-1 (Novagen, Germany)上構(gòu)建得至丨J。
權(quán)利要求
1.一種八氫番茄紅素脫氫酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.由權(quán)利要求1所述的八氫番茄紅素脫氫酶基因編碼的八氫番茄紅素脫氫酶，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.一種含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的大腸桿菌表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，大腸桿菌表達(dá)載體為pET-22b表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求2所述八氫番茄紅素脫氫酶在制藥、食品領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述八氫番茄紅素脫氫酶基因在制備番茄紅素和鏈孢紅素方面的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述應(yīng)用，步驟如下將八氫番茄紅素脫氫酶基因克隆到pET-22b表達(dá)載體上，與質(zhì)粒pACCRT-EB共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生番茄紅素和鏈孢紅素。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，上述質(zhì)粒pACCRT-EB，是通過將菠蘿泛菌 (Pantoea ananatis)的櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合成酶基因crtE和八氫番茄紅素合成酶基因 crtB分別通過BamHUacI，NdeI-KpnI酶切位點(diǎn)連接到大腸桿菌表達(dá)載體pACYCDuet_l上構(gòu)建得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種八氫番茄紅素脫氫酶基因，尤其涉及一種高效合成番茄紅素的八氫番茄紅素脫氫酶基因及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。一種八氫番茄紅素脫氫酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。該基因編碼的八氫番茄紅素脫氫酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明所述八氫番茄紅素脫氫酶基因可高效生產(chǎn)番茄紅素。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中番茄紅素產(chǎn)量為0.269mg/L，菌體干重中番茄紅素含量為0.256mg/g，占類胡蘿卜素總量的73.5％，固氮紅細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶重組酶催化產(chǎn)物以番茄紅素為主要色素成分，為番茄紅素生產(chǎn)提供了新的酶源。
文檔編號C12R1/01GK102260692SQ201110190899
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者盧麗麗, 張金華, 肖敏 申請人:山東大學(xué)