專利名稱：一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬ifitm3基因及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)和抗病育種領(lǐng)域。更具體涉及一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬 IFITM3 基因(interferon induced transmembrane 3，IFITM3)，同時(shí)還涉及一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的構(gòu)建方法，還涉及一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因在口蹄疫抗病育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國是世界養(yǎng)豬第一大國。養(yǎng)豬業(yè)是我國畜牧業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，豬肉占肉類的 67.7%，是我國人民動物蛋白質(zhì)的最主要來源。傳染病嚴(yán)重危害人類和動物的健康。全球每年有1500萬人死于傳染病，我國每年有1160萬頭豬、45. 3萬頭牛和5. 3億只禽發(fā)病，直接損失近400億元。病毒性傳染病在人和動物傳染病中扮演著重要的作用，近年來新發(fā)傳染病絕大部分是由病毒引起的，一旦發(fā)病，一般無特效藥物治療，因而其危害也是越來越嚴(yán)重。豬病嚴(yán)重制約著我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。近年來，口蹄疫、豬繁殖與呼吸道綜合征等重大疾病頻頻爆發(fā)，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)引起多種偶蹄動物共患的急性、熱性、高度接觸性的傳染病。FMDV 屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，有7個血清型，各個血清型間無交叉反應(yīng)。FMDV基因組為具有感染性的單股正鏈RNA病毒，大小約8. 5kb,只有一個開放的讀碼框(open reading frame, 0RF)，兩側(cè)各有一個非編碼區(qū)(non coding region,NCR)。開放讀碼框首先翻譯為一個多聚蛋白，經(jīng)過蛋白酶切割為成熟的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白以及一些中間體(Grubman MJ andBaxt B，2004)。另外，F(xiàn)MDV以“準(zhǔn)種”形式存在， 基因組RNA沒有單一準(zhǔn)確的核酸序列，呈現(xiàn)類群分布，這種特性使得RNA病毒在病毒變異和適應(yīng)性方面具有極大的潛能，加上不同血清型之間無交叉保護(hù)、病毒傳播快等特點(diǎn)給口蹄疫的預(yù)防和控制帶來了極大的困難(Martinez et al. , 1992 ；Domingo E，et al. ,2005(a), (b))。口蹄疫傳播途徑多，傳播速度快，感染動物通過氣體中的懸浮微?？焖賯鞑MDV 給其它的動物，造成畜牧業(yè)生產(chǎn)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，通常給該國畜牧經(jīng)濟(jì)以毀滅性打擊 (P. W. Mason, et al.，2003 ；Alexandersen S，et al.，2003 ；M. J. Grubman and B. Baxt, 2004)。一個國家或地區(qū)一旦發(fā)現(xiàn)有口蹄疫，其有關(guān)動物及其產(chǎn)品貿(mào)易受阻，感染及接觸動物將被屠殺等(Pereira HG, 1981) 1994、1996、2000年希臘，1992年阿爾巴尼亞，1997年我國臺灣省以及2001年英國等爆發(fā)的口蹄疫均給畜牧經(jīng)濟(jì)致命性打擊。我國的口蹄疫疫情非常嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料表明，1999-2003年期間，我國發(fā)病動物總數(shù)達(dá)890616頭(只)， 遍及31個省、市、自治區(qū)，疫情暴發(fā)次數(shù)11 個，疫點(diǎn)數(shù)2375個。2003年4月份以后，0型口蹄疫出現(xiàn)了我國罕見的基因型毒株，泛亞毒株又卷土重來。青海和新疆分別發(fā)現(xiàn)了 A型和Asia I型口蹄疫。新疆0型和Asia I型口蹄疫同時(shí)流行，在病畜中還發(fā)現(xiàn)0型和AsiaI型混合感染。據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)報(bào)道，2009年至今我國及其周邊國家或地區(qū)多處出現(xiàn)口蹄疫疫情，損失慘，2009-2010年豬0型口蹄疫耿馬毒在我國養(yǎng)豬場大面積的流行 (http://web. oie. int/wahis/public. php)。病毒感染機(jī)體后，宿主啟動一些因子來抵御病毒感染。I型干擾素在病毒感染天然免疫中發(fā)揮重要的作用(Randall RE. 2008)。病毒感染后細(xì)胞釋放干擾素進(jìn)而激活細(xì)胞信號通路，誘導(dǎo)大量干擾素刺激基因(interferon stimulated genes, ISGs)表達(dá)，通過各種機(jī)制減弱病毒復(fù)制發(fā)揮抗病毒作用，如使干擾素信號放大、產(chǎn)生細(xì)胞因子激活獲得型免疫或直接抑制病毒增值。目前研究表明，口蹄疫病毒對I型和II型干擾素非常敏感，干擾素處理的細(xì)胞能夠很好的抑制口蹄疫病毒的增殖，因而激活干擾素信號通路的宿主信號分子具有抗口蹄疫病毒復(fù)制的潛力(Chinsangaram，J.，et al.，2001 ；Moraes, M. P.，et al.， 2007 ；Diaz-San Segundo F. et al.，2010 ；Dias CC.，et al.，2011)。干擾素誘導(dǎo)跨膜基因 (interferon induced transmembrane, IFITM)屬于 ISGs 中一類較小的分子，包括 5 個序列相關(guān)高度保守的基因=IFITM 1 3，IFITM5和IFITM6，編碼細(xì)胞表面蛋白，該類蛋白較短、含有兩個跨膜區(qū)域，保守核心區(qū)和差異較大N端和C端(Martensen et al.，2004 ；Fredy Siegrist et al. ,2011) 0除IFITM 5為誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄外，其它的IFITM在多種組織中廣泛轉(zhuǎn)錄。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITMs)參與早期發(fā)育、細(xì)胞間黏著、細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞生長等功能(Saitou M et al.，200 。最新研究表明，機(jī)體被病毒和細(xì)菌等病原感染后導(dǎo)致 IFITM激活，在宿主免疫防御反應(yīng)方面具有一定的功能，并且參與天然免疫相關(guān)的生物過程 (Siegrist F,et al.，2011)。其中IFITM3是最具有潛力的抑制病毒復(fù)制的宿主限制因子， 具有潛在的抗口蹄疫病毒復(fù)制的能力(Brass et al.，2009 Jiang et al.，2010)。動物病毒性疫病的預(yù)防傳統(tǒng)上主要通過疫苗的免疫預(yù)防接種，在動物疫病預(yù)防與控制中發(fā)揮著極其重要的作用。由于口蹄疫病毒各亞型之間無明顯的交叉保護(hù)，增加了疫情的復(fù)雜性和控制難度，使防疫工作面臨很大困難。近年來隨著轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)的快速發(fā)展，動物的分子抗病育種得到長足的進(jìn)步，可以從源頭上控制疫病尤其是病毒性疾病的發(fā)生。分子抗病育種是控制疾病有效的策略之一，如將疫苗免疫和分子抗病育種結(jié)合在一起必將有助于動物疫病的控制。以IFITM3蛋白為研究對象，利用過表達(dá)IFITM3蛋白的細(xì)胞系和表達(dá)IFITM3的慢病毒免疫乳鼠來評價(jià)IFITM3對口蹄疫病毒增值的影響，為口蹄疫病毒的抗病毒育種提供優(yōu)良的候選基因奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬干擾素誘導(dǎo)跨膜3基因(interferon induced transmembrane 3，IFITM3)，該基因?qū)儆诟蓴_素刺激基因中一類小分子，具有抑制病毒復(fù)制的能力。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的制備方法，將IFITM3基因分別亞克隆入真核載體pCA和慢病毒轉(zhuǎn)移載體pLentiV7. 3/ V5-T0P0,直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得慢病毒或直接注射小鼠后便可評價(jià)其抗病毒能力。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的細(xì)胞系BHK21-sIFITM;3eGFP在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。在BHK-21細(xì)胞上過表達(dá)豬IFITM3，通過細(xì)胞病變程度可以直接評價(jià)該蛋白抗病毒活性。
本發(fā)明的另有一個目的是在于提供了一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的慢病毒LentiviruS-SIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。慢病毒可以有效的將外源基因IFITM3整合到宿主體內(nèi)分化和非分化細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮更佳的抗病毒活性，也是制備轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)良載體。本發(fā)明的還有一個目的是在于提供了一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的真核質(zhì)粒PCA-SIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。該載體可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞或注射動物或顯微注射動物胚胎，來評價(jià)其抗病毒活性或構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的還有一個目的是在于提供了豬IFITM3基因可以用來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動物，為抗病育種研究提供良好素材。為了實(shí)現(xiàn)上的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因(sIFITiO)的制備方法，其步驟是1、豬 IFITM3 基因(sIFITM3)的合成參照GenBank人和小鼠IFITM3基因序列，與豬的EST序列進(jìn)行比對，選擇同源性最高的序列作為靶序列，設(shè)計(jì)一對引物，提取豬的淋巴結(jié)組織RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增 SIFITM3基因，其引物序列如下sIFITM 3F -tttgaattccaccatgaactgcgct-3'sIFITM 3R -tttctcgagtcagatcatcgga-3'利用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，首先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)而以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為模板質(zhì)粒 0. 25 μ L, IOXLAbuffer 5 μ L，pTRIM25F、pTRIM25R 引物各 1· 0μ L (終濃度為 10pmol/L)，LA 酶 0.25yL，dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。按 94°C作用 3 分鐘； 然后94°C作用30秒分鐘，58°C退火30秒，72°C延伸3分鐘，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10 分鐘的反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8% (g/v)的瓊脂糖凝膠電泳分析，一條大小438bp片段。將獲得基因片段其克隆入T載體進(jìn)行測序，上傳GenBank，其登錄號為 HQ641403. 1。并與人源、鼠源以及牛源干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因3進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與牛源基因同源性較高，處于同一個分支，其次是人源基因。通過XbaI和XhoI將sIFITM3亞克隆于的真核表達(dá)載體pCA(Invitrogen，Amp+, 4713bp)中，獲得載體pCA-sIFITM3，大小為5151bp，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，置-80°C保存。 利用pCA-sIFITM3轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過共聚焦顯微鏡觀察該蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜(詳見圖 1)。2、表達(dá)SIFITM3基因的慢病毒的構(gòu)建以及純化SIFITM3基因在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)是成功研究抗病毒活性的關(guān)鍵。由于慢病毒對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，在細(xì)胞機(jī)體細(xì)胞上持久穩(wěn)定地表達(dá)，為此利用ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems anvitrogen )來建立攜帶sIFITM3基因的慢病毒。為了獲得表達(dá) SIFITM3的慢病毒Lentivirus，首先通過Xba I和Xho I酶將sIFITM3亞克隆入慢病毒轉(zhuǎn)移載體pLentiV7. 3/V5-T0P0相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pLV7. 3_sIFITM3。為了便于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) SIFITM3的細(xì)胞系，通過Xho I和XmaI將綠熒光蛋白基因eGFP置于sIFITM3的下游進(jìn)行， 構(gòu)建質(zhì)粒PLV7. 3-sIFITM;3eGFP。然后與慢病毒包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG，通過脂質(zhì)體法Lipofectamine 2000 (Invitrogen)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。由于存在VSVG，轉(zhuǎn)染后48h可以通過顯微鏡觀察到典型的細(xì)胞融合特征。7 后收集上清，同時(shí)補(bǔ)加生長液，12h后再次收集上清液，獲得HIV假型病毒，命名為Lentivirus-sIFITiOeGFP。用同樣的方法將eGFP 亞克隆于pLentiV7. 3/V5-T0P0獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLV7. 3-eGFP與包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/ VSVG共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞獲得慢病毒Lentivirus-eGFP，作為對照。將收集的上清液2000rpm/min離心5分鐘，通過0. 45 μ m的濾膜，過濾之后進(jìn)行超速離心，具體方法參照 Gustavo Tiscornia 等(Gustavo Tiscornia, Oded Singer&Inder M Verma, natyre protocols, 2006)，獲得純化的個曼病毒 Lentivirus-sIFITM3eGFP 禾口 Lentivirus-eGFPο按照 ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems(InvitrogenTM)說明書，將純化的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞，通過流流式細(xì)胞儀計(jì)算測定效價(jià)。3、穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3基因的BHK21_sIFITiOeGFP細(xì)胞系的構(gòu)建為了構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3 的 BHK_21(Baby hamster kidney, ATCC CCL10)細(xì)胞系，利用Lentivirus-sIFITiOeGFP和LentiviruseGFP分別轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞，通過綠熒光進(jìn)行初步克隆篩選(如圖2B)，進(jìn)而通過RT-PO^P Wfesternblotting鑒定SIFITM3的表達(dá)， 并命名為 BHK21-sIFITM;3eGFP。①慢病毒Lentivirus-sIFITM3eGFP 轉(zhuǎn)導(dǎo) BHK-21 細(xì)胞長滿單層，形態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞，通過胰酶消化進(jìn)行傳代，胎盤藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞量為IX IO6個/ml。取100 μ 1上述細(xì)胞(IO5個細(xì)胞)、1μ 1 5 μ g/ml 的 polybrene、500 μ 1 沒有超離純化的慢病毒(Lentivirus-sIFITiOeGFP 和 Lentivirus-eGFP)和500 μ 1無抗生素的DMEM與1. 5ml離心管中，輕輕混勻，與37°C孵育 Ih,期間每隔15分鐘輕輕混勻2 3次。隨后500 μ 1/孔接種于M孔板培養(yǎng)，次日吸棄上清，另補(bǔ)加Iml生長液繼續(xù)培養(yǎng)。通過熒光顯微鏡觀察綠熒光，進(jìn)行克隆篩選。②RT-PCR 擴(kuò)增 BHK21_sIFITM;3eGFP 細(xì)胞中 sIFITM3 基因收集BHK-eGFP 和 BHK21_sIFITM;3eGFP 細(xì)胞，提取細(xì)胞總 RNA，進(jìn)行 RT-PCR 檢測 SIFITM3，其反應(yīng)條件同上基因擴(kuò)增。結(jié)果在BHK21-sIFITM;3eGFP中可以擴(kuò)增438bp的 SIFITM3片段，而正常BHK-eGFP細(xì)胞陰性，表明BHK21_sIFITM;3eGFP細(xì)胞株中有sIFITM3基因(如圖2C)。③Western blotting鑒定外源基因sIFITM3的表達(dá)收集長滿單層BHK-eGFP和BHK_TRIM2kGFP細(xì)胞，提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和 Western blotting檢測。所用一抗為兔抗sIFITM3多抗(實(shí)驗(yàn)室制備，首先構(gòu)建原核表達(dá)載體pETj8a-sIFITM3，進(jìn)行原核表達(dá)。表達(dá)蛋白通過多次免疫家兔獲得多克隆抗兔抗體，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員均可制備)，二抗是HRP標(biāo)記的鼠抗兔單克隆抗體。結(jié)果在 BHK21-sIFITM;3eGFP細(xì)胞中有20KD的特異性陽性帶，與sIFITM3蛋白大小相符，而正常 BHK-eGFP細(xì)胞陰性，表明BHK21_sIFITM;3eGFP細(xì)胞株中sIFITM3有效表達(dá)(如圖2D)。通過制備獲得了該基因，該基因公布在Genbank(HQ641403. 1)上。一種抑制口蹄疫病毒增殖的細(xì)胞系BHK21_sIFITM;3eGFP、慢病毒 Lentivirus-sIFITM3和真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其步驟是1、一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的細(xì)胞系BHK21_sIFITM;3eGFP在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其步驟是①空斑試驗(yàn)為了初步觀察SIFITM3蛋白對FMDV增殖的影響，將相同數(shù)量 BHK21-sIFITM3eGFP和BHK-21細(xì)胞接種入6孔板，待細(xì)胞長勢90%左右進(jìn)行空斑試驗(yàn)，觀察SIFITM3蛋白對病毒產(chǎn)生噬斑能力的影響。結(jié)果表明，BHK21-sIFITM3eGFP細(xì)胞上噬斑數(shù)為19-39個，并且噬斑為分開可數(shù)的；同樣劑量的病毒感染的BHK-eGFP細(xì)胞中噬斑數(shù)很多，很多病毒噬斑連在一起，無法計(jì)算噬斑數(shù)。表明FMDV在BHK-eGFP細(xì)胞中得到大量的增殖，可見BHK21-sIFITM;3eGFP細(xì)胞中表達(dá)的sIFITM3蛋白顯著抑制FMDV的增殖，呈現(xiàn)出良好的抗病毒活性(如圖3)。②病毒滴度的測定為了量化SIFITM3蛋白對FMDV的抑制效果，將BHK-eGFP和 BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0. 8X104cells/well，次日用0. 01M0I 0 型口蹄疫病毒進(jìn)行病毒感染。分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)觀察病毒感染細(xì)胞所致細(xì)胞病變效應(yīng)并收集上清測定病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)6h，12h，18h,24h,30h,36h樣品中FMDV的滴度。在顯微鏡下觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，感染后Mi可以發(fā)現(xiàn)BHK-eGFP 細(xì)胞中有明顯的細(xì)胞變圓，而BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞長勢良好，直到感染后3 BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞才有的典型CPE。感染后不同時(shí)間點(diǎn)的上清液，按Reed-Muench法測定病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(TCID5tl)。結(jié)果表明感染BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞組病毒含量一直低于BHK-eGFP細(xì)胞感染組，滴度低IO2 IO2 5倍，表明sIFITM3能顯著抑制FMDV 的增殖(如圖4)。2、一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的慢病毒Lentivirus_sIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其步驟是為了評價(jià)SIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，進(jìn)而在動物機(jī)體上觀察其抑制病毒增值情況。選取FMDV敏感的1 2日齡乳鼠，設(shè)4組，每組10只乳鼠。利用慢病毒Lent iνirus系統(tǒng)來免疫乳鼠。首先通過肌肉注射相同劑量的純化的3 X 107TU/ml Lentivirus-sIFITM3 (50 μ 1/ 只)和 Lentivirus (對照組)，48 小時(shí)后分別用 5MLD5(I 和 20MLD50的FMDV進(jìn)行攻毒。攻毒后觀察乳鼠的死亡情況，連續(xù)觀察8天。結(jié)果顯示SIFITM3蛋白對5MLD5(1保護(hù)率為90%，對照組為40% (如圖5A所示)； SIFITM3蛋白對20MLD5Q保護(hù)率為50%，對照組為20% (如圖5B所示)。結(jié)果表明在機(jī)體水平上SIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV復(fù)制感染，使機(jī)體抵御FMDV的感染。3、一種抑制口蹄疫病毒增殖的真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其步驟是為了進(jìn)一步評價(jià)SIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，進(jìn)而利用真核質(zhì)粒pCA 系統(tǒng)來免疫乳鼠，在動物機(jī)體上觀察其抑制病毒增值情況。選取FMDV敏感的1 2日齡乳鼠，設(shè)4組，每組10只乳鼠。在用5MLD50或20MLD50的FMDV進(jìn)行攻毒前48小時(shí)，用5. 0 μ g pCA-sIFITM3和pCA分別肌肉注射乳鼠，攻毒后觀察乳鼠的死亡情況，連續(xù)觀察8天。結(jié)果顯示SIFITM3蛋白對5MLD5Q保護(hù)率為100%，對照組為40% (如圖6A所示)； SIFITM3蛋白對20MLD5Q保護(hù)率為60%，對照組為10% (如圖6B所示)。結(jié)果再次表明在機(jī)體水平上SIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV復(fù)制感染，使機(jī)體抵御FMDV的感染。
4、一種抑制口蹄疫病毒增殖的SIFITM3基因在轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用， 其應(yīng)用過程是為了評價(jià)SIFITM3基因具有潛在的育種價(jià)值，在機(jī)體水平研究sIFITM3基因的抗病毒活性。利用AccI和HindIII酶切真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3，回收含有啟動子、sIFITM3和 PolyA的^K)6bp片段于轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ肨E中，終濃度為2 μ g/ml。然后通過常規(guī)的方法進(jìn)行顯微注射(于政權(quán)。轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)具有抗菌活性重組溶菌酶的研究，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，博士學(xué)位論文)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠/豬的研究。獲得的小鼠提取其尾部DNA，用sIFITM 3F(5’ -tttgaattccaccatgaactgcgct-3，)和 sIFITM 3R(5，_tttctcgagtcagatcatcgga_3，)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，在115個FO代轉(zhuǎn)基因小鼠中2和8號小鼠是陽性，能夠擴(kuò)出438bp的目的帶。圖 7為轉(zhuǎn)基因小鼠第一代DNA檢測結(jié)果。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.本發(fā)明所構(gòu)建的BHK21_sIFITM;3eGFP細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)sIFITM3蛋白。2.本發(fā)明穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3基因的細(xì)胞系BHK21_sIFITM;3eGFP能夠抑制口蹄疫病
毒復(fù)制。3.本發(fā)明攜帶SIFITM3基因的慢病毒lentivirus_sIFITM3和真核質(zhì)粒 pCA-sIFITM3在機(jī)體水平能夠抑制口蹄疫病毒復(fù)制。4.本發(fā)明的SIFITM3基因可以用來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動物。


圖1為一種顯示了豬干擾素轉(zhuǎn)膜蛋白3(sIFITM3)的克隆與分析示意圖。通過RT-PCR擴(kuò)增豬的IFITM3基因，測序結(jié)果表明全長為438bp，具有兩個跨膜區(qū) (a)。與其它物種IFITM3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，與牛的IFITM3親緣關(guān)系最近(b)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后通過共聚焦顯微鏡顯示，該蛋白表達(dá)與細(xì)胞膜中(C)。圖2為一顯示了 SIFITM3基因在BHK21細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建策略及蛋白表達(dá)鑒定；其中A圖是將SIFITM3和綠熒光蛋白eGFP基因克隆入慢病毒載體pLentiV7. 3/ V5-T0P0獲得轉(zhuǎn)移載體pLV7. 3-sIFITM3的策略圖。轉(zhuǎn)移載體pLV7. 3-sIFITM3eGFP與包裝質(zhì)粒 pLPl、pLP2 和 pLP/VSVG 共轉(zhuǎn) 293ft 細(xì)胞，獲得慢病毒 Lentivirus-sIFITiOeGFP， 進(jìn)而轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞后獲得穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3的細(xì)胞株(B)。是分別通過RT-PCR(C)和 flfestern-blotting對細(xì)胞株進(jìn)行鑒定(D)。圖3為一顯示穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3基因細(xì)胞系抑制口蹄疫病毒增殖的空斑試驗(yàn)圖譜；分別以25M0I 的 0 型 FMDV 接種 BHK21_sIFITM;3eGFP 和 BHK21_eGFP 細(xì)胞，72h 后利用結(jié)晶紫染色，噬斑數(shù)顯示SIFITM3對口蹄疫病毒增殖具有明顯的抑制作用。A-C為 BHK21-eGFP細(xì)胞中噬斑，D-G為BHK21_sIFITM;3eGFP細(xì)胞上噬斑。圖4為一是SIFITM3基因抑制口蹄疫病毒滴度測定效果圖；將BHK-eGFP和BHK-sIFITM3_eGFP細(xì)胞分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 0.8X104cells/welL·次日用0. 01M0I 0型口蹄疫病毒進(jìn)行病毒感染，分別于感染后不同時(shí)間點(diǎn)(6h,12h,18h,24h,30h,36h)取樣測定病毒含量即TCID50，。結(jié)果統(tǒng)計(jì)表明病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)，在兩種細(xì)胞中TCID50均存在明顯差異，其Ig值差異達(dá)2 2. 5，sIFITM3 抑制效果達(dá)100倍，能顯著抑制FMDV的增殖。圖5為一顯示在機(jī)體水平利用慢病毒Lentivirus-sIFITiOeGFP注射小鼠抑制口蹄疫病毒效果圖。利用慢病毒Lentivirus-sIFITiOeGFP免疫注射乳鼠，在機(jī)體上直接評價(jià)sIFITM3 抗口蹄疫病毒的能力。結(jié)果表明在小鼠機(jī)體水平，SIFITM3能顯著抑制FMDV的增殖。圖6為一顯示在機(jī)體水平利用真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3注射小鼠抑制口蹄疫病毒效果圖。利用真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3分別來免疫注射乳鼠，在機(jī)體上直接評價(jià)sIFITM3抗口蹄疫病毒的能力。結(jié)果表明在小鼠機(jī)體水平，SIFITM3能顯著抑制FMDV的增殖。圖7為一為SIFITM3基因轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測圖利用真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3進(jìn)行顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠的研究。該圖顯示FO 代轉(zhuǎn)基因小鼠樣品的DNA檢測結(jié)果，表明2號和8號為陽性樣品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的制備方法，其步驟是1、豬IFITM3基因(sIFITM3)的克隆與真核載體pCA_sIFITM3的構(gòu)建參照GenBank人和小鼠IFITM基因序列，與豬的EST序列進(jìn)行比對，選擇同源性最高的序列作為靶序列，設(shè)計(jì)一對引物，提取豬的淋巴結(jié)組織RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增SIFITM3 基因，其引物序列如下sIFITM 3F :5，_tttgaattccaccatgaactgcgct_3，sIFITM 3R -tttctcgagtcagatcatcgga-3'利用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，首先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)而以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為模板質(zhì)粒 0. 25 μ L, IOXLAbuffer 5 μ L，pTRIM25F、pTRIM25R 引物各 1· 0μ L (終濃度為 10pmol/L)，LA 酶 0.25yL，dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。按 94°C作用 3 分鐘； 然后94°C作用30秒分鐘，58 °C退火30秒，72 °C延伸3分鐘，共35個循環(huán)，最后72 °C延伸10 分鐘的反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8% (g/v)的瓊脂糖凝膠電泳分析，一條大小438bp片段。將獲得基因片段其克隆入T載體進(jìn)行測序(SEQ ID NO :1)，并與人源、鼠源以及牛源干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因3進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與牛源基因同源性較高，處于同一個分支，其次是人源基因。通過XbaI和XhoI將sIFITM3亞克隆于的真核表達(dá)載體pCA (Invitrogen, Amp+)中，獲得載體pCA-sIFITM3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5ci，置-80°C保存。通過脂質(zhì)體法將 pCA-sIFITM3轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，共聚焦顯微鏡觀察該蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜(詳見圖1)。2、表達(dá)SIFITM3基因的慢病毒的構(gòu)建以及純化SIFITM3基因在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)是成功研究抗病毒活性的關(guān)鍵。由于慢病毒對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，在細(xì)胞機(jī)體細(xì)胞上持久穩(wěn)定地表達(dá)，為此利用ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems anvitrogen )來建立攜帶 sIFITM3 基因的慢病毒。為了獲得表達(dá)SIFITM3的慢病毒Lentivirus，首先將通過Not I和Xho I酶將sIFITM3亞克隆入慢病毒轉(zhuǎn)移載體pLentiV7. 3/V5-T0P0相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pLV7. 3_sIFITM3，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH-IOa，置-80°C保存。通過脂質(zhì)體法Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 將pLV7. 3-sIFITM3與慢病毒包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞 (Invitrogen )。由于存在VSVG，轉(zhuǎn)染后4 可以通過顯微鏡觀察到典型的細(xì)胞融合特征。7 后收集上清，同時(shí)補(bǔ)加生長液，12h后再次收集上清液，獲得HIV假型病毒，命名為 Lentivirus-sIFITM3。用同樣的方法將pLentiV7. 3/V5-T0P0 與包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2 和 pLP/ VSVG共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞獲得慢病毒Lentivirus，作為對照。將收集的上清液2000rpm/min離心5分鐘，通過0. 45 μ m的濾膜，過濾之后進(jìn)行超速離心，具體方法參照 Gustavo Tiscornia 等(Gustavo Tiscornia, Oded Singer&Inder M Verma,natyre protocols，2006)，獲得純化的個曼病毒 Lentivirus-sIFITM3 禾口 Lentivirus。按照 ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems(InvitrogenTM)說明書，將純化的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞，通過流流式細(xì)胞儀計(jì)算測定效價(jià)。3、穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3基因的BHK21_sIFITiOeGFP細(xì)胞系的構(gòu)建為了構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3 的 BHK-21 細(xì)胞系(Baby Hamster Kidney，CCTC)，利用Lentivirus-sIFITM3和Lentivirus分別轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞，通過綠熒光進(jìn)行初步克隆篩選(如圖2B)，進(jìn)而通過RT-PCR和Wfestern blotting鑒定表達(dá)sIFITM3細(xì)胞系。A、慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞長滿單層，形態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞，通過胰酶消化進(jìn)行傳代，胎盤藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞量為IXlO6個/ml。取ΙΟΟμ 1上述細(xì)胞(IO5個細(xì)胞)、1μ 1 5 μ g/ml 的 polybrene、500y 1 沒有超離純化的慢病毒(Lentivirus_sIFITM3 和 Lentivirus)和 500 μ 1無抗生素的DMEM與1. 5ml離心管中，輕輕混勻，與37°C孵育lh，期間每隔15分鐘輕輕混勻2 3次。隨后500 μ 1/孔接種于M孔板培養(yǎng)，次日吸棄上清，另補(bǔ)加Iml生長液繼續(xù)培養(yǎng)。通過熒光顯微鏡觀察綠熒光，進(jìn)行克隆篩選。B、RT-PCR 擴(kuò)增 BHK21_sIFITM;3eGFP 細(xì)胞中 sIFITM3 基因收集BHK-eGFP 和 BHK21_sIFITM;3eGFP 細(xì)胞，提取細(xì)胞總 RNA，進(jìn)行 RT-PCR 檢測 SIFITM3，其反應(yīng)條件同上基因擴(kuò)增。結(jié)果在BHK21-sIFITM;3eGFP中可以擴(kuò)增438bp的 SIFITM3片段，而正常BHK-21細(xì)胞陰性，表明BHK21_sIFITM;3eGFP細(xì)胞株中有sIFITM3基因 (如圖2C)。C、Western blotting 鑒定外源基因 sIFITM3 的表達(dá)收集長滿單層BHK-eGFP和BHK-TRIM25_eGFP細(xì)胞，提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和 Western blotting檢測。所用一抗為兔抗sIFITM3多抗(實(shí)驗(yàn)室制備，首先構(gòu)建原核表達(dá)載體pETj8a-sIFITM3，進(jìn)行原核表達(dá)。表達(dá)蛋白通過多次免疫家兔獲得多克隆抗兔抗體。)， 二抗為HRP標(biāo)記的鼠抗兔單克隆抗體。結(jié)果在BHK21-sIFITM;3eGFP細(xì)胞中有20KD的特異性陽性帶，與SIFITM3蛋白大小相符，而正常BHK-eGFP細(xì)胞陰性，表明BHK21-sIFITM;3eGFP 細(xì)胞株中SIFITM3有效表達(dá)(如圖2D)。實(shí)施例2 —種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因、細(xì)胞系 BHK21-sIFITM;3eGFP、慢病毒 Lentivirus_sIFITM3 和真核質(zhì)粒 pCA_sIFITM3 在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。(這五種都是相同的應(yīng)用過程嗎？如果相同則可以寫在同一實(shí)施例中進(jìn)行描述，如果應(yīng)用不同，則分別對應(yīng)用進(jìn)行描述？1、一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的細(xì)胞系BHK21_sIFITM;3eGFP在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其步驟是①空斑試驗(yàn)為了初步觀察SIFITM3蛋白對FMDV增殖的影響，將相同數(shù)量 BHK21-sIFITM3eGFP和BHK-21細(xì)胞接種入6孔板，待細(xì)胞長勢90%左右進(jìn)行空斑試驗(yàn)，觀察SIFITM3蛋白對病毒產(chǎn)生噬斑能力的影響。結(jié)果表明，BHK21-sIFITM3eGFP細(xì)胞上噬斑數(shù)為19-39個，并且噬斑為分開可數(shù)的；同樣劑量的病毒感染的BHK-eGFP細(xì)胞中噬斑數(shù)很多，很多病毒噬斑連在一起，無法計(jì)算噬斑數(shù)。表明FMDV在BHK-eGFP細(xì)胞中得到大量的增殖，可見BHK21-sIFITM;3eGFP細(xì)胞中表達(dá)的sIFITM3蛋白顯著抑制FMDV的增殖，呈現(xiàn)出良好的抗病毒活性(如圖3)。②病毒滴度的測定為了量化SIFITM3蛋白對FMDV的抑制效果，將BHK-eGFP和 BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0. 8X 104cells/well，次日用0. 01M0I 0型口蹄疫病毒進(jìn)行病毒感染。分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)觀察病毒感染細(xì)胞所致細(xì)胞病變效應(yīng)并收集上清測定病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)(6h，12h，18h,24h,30h,36h)樣品中FMDV的滴度。在顯微鏡下觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，感染后Mi可以發(fā)現(xiàn)BHK-eGFP 細(xì)胞中有明顯的細(xì)胞變圓，而BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞長勢良好，直到感染后3 BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞才有的典型CPE。感染后不同時(shí)間點(diǎn)的上清液，按Reed-Muench法測定病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(TCID5tl)。結(jié)果表明感染BHK-sIFITM3-eGFP細(xì)胞組病毒含量一直低于BHK-eGFP細(xì)胞感染組，滴度低IO2 IO2 5倍，表明sIFITM3能顯著抑制FMDV 的增殖(如圖4)。2、一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的慢病毒Lentivirus-sIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其步驟是為了評價(jià)SIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，進(jìn)而在動物機(jī)體上觀察其抑制病毒增值情況。選取FMDV敏感的1 2日齡乳鼠，設(shè)4組，每組10只乳鼠。利用慢病毒Lent iνirus系統(tǒng)來免疫乳鼠。首先通過肌肉注射相同劑量的純化的3 X 107TU/ml Lentivirus-sIFITM3 (50 μ 1/ 只)和 Lentivirus (對照組)，48 小時(shí)后分別用 5MLD5(I 和 20MLD50的FMDV進(jìn)行攻毒。攻毒后觀察乳鼠的死亡情況，連續(xù)觀察8天。結(jié)果顯示SIFITM3蛋白對5MLD5(1保護(hù)率為90%，對照組為40% (如圖5A所示)； SIFITM3蛋白對20MLD5Q保護(hù)率為50%，對照組為20% (如圖5B所示)。結(jié)果表明在機(jī)體水平上SIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV復(fù)制感染，使機(jī)體抵御FMDV的感染。3、一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用，其步驟是為了進(jìn)一步評價(jià)SIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖活性，進(jìn)而利用真核質(zhì)粒pCA 系統(tǒng)來免疫乳鼠，在動物機(jī)體上觀察其抑制病毒增值情況。選取FMDV敏感的1 2日齡乳鼠，設(shè)4組，每組10只乳鼠。在用5MLD5(1或20MLD5(1的FMDV進(jìn)行攻毒前48小時(shí)，用 5. 0 μ gpCA-sIFITM3和pCA分別肌肉注射乳鼠，攻毒后觀察乳鼠的死亡情況，連續(xù)觀察8天。結(jié)果顯示SIFITM3蛋白對5MLD5Q保護(hù)率為100%，對照組為40% (如圖6A所示)；SIFITM3蛋白對20MLD5Q保護(hù)率為60%，對照組為10% (如圖6B所示)。結(jié)果再次表明在機(jī)體水平上SIFITM3蛋白能有效是抑制FMDV復(fù)制感染，使機(jī)體抵御FMDV的感染。實(shí)施例3 —種抑制口蹄疫病毒增殖的SIFITM3基因在轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是為了評價(jià)SIFITM3基因具有潛在的育種價(jià)值，在機(jī)體水平研究sIFITM3基因的抗病毒活性。利用AccI和HindIII酶切真核質(zhì)粒pCA_sIFITM3，回收含有啟動子、sIFITM3和 PolyA的^K)6bp片段于轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ肨E中，終濃度為2 μ g/ml。然后通過常規(guī)的方法進(jìn)行顯微注射(于政權(quán)。轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)具有抗菌活性重組溶菌酶的研究，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，博士學(xué)位論文)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠/豬的研究。獲得的小鼠提取其尾部DNA，用sIFITM 3F(5’ -tttgaattccaccatgaactgcgct-3，)和 sIFITM 3R(5，_tttctcgagtcagatcatcgga_3，)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，在115個FO代轉(zhuǎn)基因小鼠中2和8號小鼠是陽性，能夠擴(kuò)出438bp的目的帶。圖 7為轉(zhuǎn)基因小鼠第一代DNA檢測結(jié)果。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進(jìn)行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的制備方法，其步驟是A、豬IFITM3基因的合成設(shè)計(jì)引物，提取豬的淋巴結(jié)組織RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增 SIFITM3 基因，其引物序列如下sIFITM 3F 5，-tttgaattccaccatgaactgcgct _3，； sIFITM 3R 5’ -tttctcgagtcagatcatcgga _3’ ；利用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，首先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為模板質(zhì)粒0.25 μ L，1 OXLA buffer 5 μ L, pTRIM25F、pTRIM25R 引物各 1. 0μ L，LA 酶 0. 25 μ L, dNTPS LOyL，力口 ddH20 至 50 μ L，按 94°C作用3分鐘；然后94°C作用30秒分鐘，58°C退火30秒，72°C延伸3分鐘，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘的反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%g/v的瓊脂糖凝膠電泳分析，一條大小438bp片段；通過^CbaI和B10I將SIFITM3亞克隆于的真核表達(dá)載體PCA中，獲得載體pCA-sIFITM3，大小為515Ibp，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，置-80 V保存，利用pCA-sIFITM3轉(zhuǎn)染ΒΗΚ-21細(xì)胞，通過共聚焦顯微鏡觀察該蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜；B、表達(dá)SIFITM3基因的慢病毒的構(gòu)建以及純化sIFITM3基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)， 慢病毒對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均有感染，將外源基因整合到宿主染色體上，在細(xì)胞機(jī)體細(xì)胞上持久穩(wěn)定地表達(dá)，利用 ViraPowerTM HiPerformTM Lentiviral Expression Systems 來建立攜帶SIFITM3基因的慢病毒，獲得表達(dá)SIFITM3的慢病毒Lentivirus，首先通過 Xba I和Xho I酶將SIFITM3亞克隆入慢病毒轉(zhuǎn)移載體pLentiV7. 3/V5-T0P0相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pLV7. 3-sIFITM3，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)sIFITM3的細(xì)胞系，通過Β ο I和XmaI將綠熒光蛋白基因eGFP置于SIFITM3的下游進(jìn)行，構(gòu)建質(zhì)粒pLV7. 3_sIFITM;3eGFP，然后與慢病毒包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG，通過脂質(zhì)體法Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞，存在VSVG，轉(zhuǎn)染后4 通過顯微鏡觀察到典型的細(xì)胞融合，72h后收集上清，同時(shí)補(bǔ)加生長液， 1 后再次收集上清液，獲得HIV假型病毒，為Lentivirus- sIFITiOeGFP，用同樣的方法將eGFP亞克隆于pLentiV7. 3/V5-T0P0獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLV7. 3-eGFP與包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2 和pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞獲得慢病毒Lentivirus-eGFP ；將收集的上清液2000rpm/ min離心5分鐘，通過0. 45 μ m的濾膜，過濾之后進(jìn)行超速離心，獲得慢病毒Lentivirus-sIFITM3eGFP 和 Lentivirus-eGFP ；C、穩(wěn)定表達(dá)SIFITM3基因的BHK21-sIFITM;3eGFP細(xì)胞系的構(gòu)建構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) SIFITM3 的 BHK-21 細(xì)胞系，利用 Lentivirus-sIFITiOeGFP 和 LentiviruseGFP 分別轉(zhuǎn)導(dǎo) BHK-21細(xì)胞，通過綠熒光進(jìn)行克隆篩選，通過RT-PCR和^festern blotting鑒定sIFITM3的表達(dá)，為 BHK21- sIFITiOeGFP。
2.權(quán)利要求1所述的一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的細(xì)胞系BHK21-SlFITiOeGFP在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的慢病毒 LentiviruS-SIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因的真核質(zhì)粒pCA-SIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因在口蹄疫抗病藥物育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制口蹄疫病毒增殖的豬IFITM3基因及構(gòu)建方法和應(yīng)用，其步驟A、豬IFITM3基因的合成設(shè)計(jì)引物，提取豬的淋巴結(jié)組織RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增sIFITM3基因，擴(kuò)增，利用pCA-sIFITM3轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過共聚焦顯微鏡觀察該蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜；B、表達(dá)sIFITM3基因的慢病毒的構(gòu)建以及純化；C、穩(wěn)定表達(dá)sIFITM3基因的BHK21-sIFITM3eGFP細(xì)胞系的構(gòu)建構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)sIFITM3的BHK-21細(xì)胞系，利用Lentivirus-sIFITM3eGFP和LentiviruseGFP分別轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞，通過綠熒光進(jìn)行克隆篩選，通過RT-PCR和Westernblotting鑒定sIFITM3的表達(dá)，為BHK21-sIFITM3eGFP。該基因、細(xì)胞系BHK21-sIFITM3eGFP、慢病毒Lentivirus-sIFITM3和真核質(zhì)粒pCA-sIFITM3在制備治療或預(yù)防口蹄疫病毒藥物中的應(yīng)用。構(gòu)建的BHK21-sIFITM3eGFP細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)sIFITM3蛋白、BHK21-sIFITM3eGFP能夠抑制口蹄疫病毒復(fù)制、攜帶sIFITM3基因的慢病毒lentivirus-sIFITM3和真核質(zhì)粒pCA-sIFITM3在機(jī)體水平能夠抑制口蹄疫病毒復(fù)制。
文檔編號C12N15/10GK102286465SQ20111019109
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者劉莎莎, 周銳, 李祥敏, 許晉芳, 金梅林, 錢平, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)