專利名稱：核酸存在比測定裝置、核酸存在比測定方法、判斷方法及核酸存在比測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸存在比測定裝置、核酸存在比測定方法、判斷方法及核酸存在比測定試劑盒。
背景技術(shù)：
以往，提出了一種熔解曲線分析方法及熔解曲線分析裝置，其根據(jù)以微分熔解曲線表示的熔解曲線判斷不同的兩個峰的有無以及其溫度范圍，從而辨別基因多態(tài)性的類型；其中，微分熔解曲線表示的是對表示各溫度下樣品的信號值的熔解曲線的信號值進行微分而得的信號微分值與溫度的關(guān)系(例如，參照專利文獻1)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 國際公開第2009/081965號小冊子
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題然而，在專利文獻1的技術(shù)中，存在以下問題即使能夠自動地辨別基因多態(tài)性的類型，也無法得到該基因的變異的比例。本發(fā)明是為了解決上述問題而完成的，其目的在于提供通過簡易地計算核酸存在比即可測定核酸存在比的核酸存在比測定裝置、核酸存在比測定方法、核酸存在比測定程序、判斷方法以及核酸存在比測定試劑盒。用于解決問題的方案為了達成上述目的，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置包括以下結(jié)構(gòu)檢測單元，在不同的溫度范圍內(nèi)檢測具有1個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號；存在比計算單元，基于從由上述檢測單元檢測出的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。標(biāo)準(zhǔn)信息是指表示特征量之比與核酸存在比的關(guān)系的信息，例如，有表示特征量之比與核酸存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線、表、計算式等。根據(jù)本發(fā)明的核酸存在比測定裝置，檢測單元，在不同的溫度范圍內(nèi)檢測具有1 個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號。而且，存在比計算單元，基于從由檢測單元檢測出的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比，從而測定待測物(測定對象核酸混合物)中的核酸存在比。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)可以包括以下結(jié)構(gòu)存儲單元，存儲表示特征量之比與存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息；或輸入單元，用于輸入上述標(biāo)準(zhǔn)信息；其中，所述特征量是基于從具有各不相同的熔解溫度的核酸的存在比各不相同的多個核酸混合物各自得出的表示溫度與檢測信號的關(guān)系的熔解曲線、從包含上述熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的上述熔解曲線的檢測信號中得出的。
根據(jù)這樣的形態(tài)，存儲單元，存儲表示特征量之比與存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息，其中，所述特征量是基于從具有各不相同的熔解溫度的核酸的存在比各不相同的多個核酸混合物各自得出的表示溫度與檢測信號的關(guān)系的熔解曲線、從包含各不相同的熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號中得出的。此外，該標(biāo)準(zhǔn)信息可由輸入單元輸入。而且，基于測定對象核酸混合物的熔解曲線的與多個溫度范圍分別對應(yīng)的溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號，計算特征量之比，并基于所計算出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比，從而測定待測物中的核酸存在比。這樣，基于表示多個核酸存在比與各核酸的從包含熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號中得出的特征量之比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息，和從測定對象核酸混合物的與多個溫度范圍分別對應(yīng)的溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號中得出的特征量之比，簡易地計算核酸存在比，從而可測定待測物中的核酸存在比。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，上述特征量之比可以為從一個熔解溫度附近(大致相當(dāng)于熔解溫度)的檢測信號水平減去背景水平所得的值與從其他熔解溫度附近的檢測信號水平減去背景水平所得的值之比；從一個熔解溫度附近的檢測信號的微分值減去背景水平所得的值與從其他熔解溫度附近的檢測信號的微分值減去背景水平所得的值之比；一個溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和與其他溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和之比；或者從一個溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和減去背景水平之和所得的值與從其他溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和減去背景水平之和所得的值之比。熔解溫度附近的檢測信號，原本理想的是使用熔解溫度的檢測信號，但考慮到因試劑條件(待測物的狀態(tài))、循環(huán)數(shù)而產(chǎn)生的熔解溫度的偏移、因測定裝置的檢測靈敏度 (例如，以rc為單位進行測定)而產(chǎn)生的誤差，熔解溫度附近的檢測信號意味著使用熔解溫度附近的檢測信號。另外，熔解溫度附近的檢測信號包含熔解溫度的檢測信號。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，上述特征量之比可以為在表示溫度與檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中，由通過一個溫度范圍的下限值所對應(yīng)的點和上述一個溫度范圍的上限值所對應(yīng)的點所作的直線與熔解曲線所圍成的部分的面積， 與由通過其他溫度范圍的下限值所對應(yīng)的點和上述其他溫度范圍的上限值所對應(yīng)的點所作的直線與熔解曲線所圍成的部分的面積之比。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，上述溫度范圍的上限值或下限值可以為在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中的兩個峰間檢測信號的微分值為最小時的溫度；在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中峰的峰腳所對應(yīng)的溫度；或在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中距離峰士 15°C以內(nèi)的溫度。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，上述溫度范圍的上限值或下限值可以為在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中距離峰士 10°c以內(nèi)的溫度。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，上述溫度范圍的上限值或下限值可以為在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中距離峰士7°C以內(nèi)的溫度。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，上述一個溫度范圍的上限值與含有高于上述一個溫度范圍的溫度范圍的下限值可以為不同的值。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，從上述一個溫度范圍的下限值到上限值的寬度與從上述其他溫度范圍的下限值到上限值的寬度可以為同一寬度。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)中，從上述一個溫度范圍的下限值到上限值的寬度與從上述其他溫度范圍的下限值到上限值的寬度可以為不同的寬度。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的其他形態(tài)可以進一步含有以下結(jié)構(gòu)溫度控制單元，控制上述核酸混合物的溫度變化；測量單元，測量吸光度、熒光強度或相對熒光強度作為上述檢測信號。通過該結(jié)構(gòu)，使用從待測物測量出的檢測信號，能夠測定待測物中的核酸存在比。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定方法可以為包括以下工序的方法檢測工序，在不同的溫度范圍內(nèi)檢測具有1個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號；存在比計算工序，基于從上述檢測工序中檢測出的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。根據(jù)本發(fā)明的核酸存在比測定方法，在檢測工序中，在不同的溫度范圍內(nèi)檢測具有1個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號。而且，在存在比計算工序中， 基于從上述檢測工序中檢測出的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比，從而測定待測物中的核酸存在比。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定方法的其他形態(tài)可以為包括以下工序的方法標(biāo)準(zhǔn)信息制作工序，制作表示特征量之比與存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息，所述特征量是基于從具有各不相同的熔解溫度的核酸的存在比各不相同的多個核酸混合物各自得出的表示溫度與檢測信號的關(guān)系的熔解曲線、從包含上述熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的上述熔解曲線的檢測信號中得出的；特征量之比計算工序，基于測定對象核酸混合物的熔解曲線的與上述多個溫度范圍分別對應(yīng)的溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號，計算特征量之比；存在比計算工序，基于上述特征量之比計算工序中計算出的特征量之比和上述標(biāo)準(zhǔn)信息制作工序中制作出的標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。經(jīng)由這些工序計算核算存在比，從而能夠測定核酸存在比。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定程序可以為用于使計算機作為存在比計算單元發(fā)揮作用從而使計算機測定待測物中的核酸存在比的程序；存在比計算單元，讀取在不同的溫度范圍內(nèi)檢測出的檢測信號，并基于從讀取的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比，其中，所述檢測信號為具有1個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定程序的其他形態(tài)可用于使計算機作為獲取標(biāo)準(zhǔn)信息的獲取單元、特征量之比計算單元、及存在比計算單元發(fā)揮作用。獲取單元，從存儲有表示特征量之比與存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息的存儲單元獲取該標(biāo)準(zhǔn)信息，或者獲取由輸入單元輸入的上述標(biāo)準(zhǔn)信息；其中，所述特征量是基于從具有各不相同的熔解溫度的核酸的存在比各不相同的多個核酸混合物各自得出的表示溫度與檢測信號的關(guān)系的熔解曲線、從包含上述熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的上述熔解曲線的檢測信號中得出的；特征量之比計算單元，基于測定對象核酸混合物的熔解曲線的與上述多個溫度范圍分別對應(yīng)的溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號，計算特征量之比；以及存在比計算單元，基于由上述特征量之比計算單元計算出的特征量之比和由上述獲取單元獲取的標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。由此，能夠使計算機測定待測物中的核酸存在比。此外，作為本發(fā)明的核酸存在比測定程序的其他形態(tài)，可以使上述計算機作為控制單元發(fā)揮作用，控制單元用于使其他計算機執(zhí)行上述檢測信號、一部分的計算。此外，本發(fā)明的判斷方法為以下方法基于使用上述核酸存在比測定裝置、上述核酸存在比測定方法或上述核酸存在比測定程序而得到的核酸存在比和預(yù)先確定的核酸存在比與患者的狀態(tài)的關(guān)系，判斷患者的狀態(tài)。此外，本發(fā)明的判斷方法為以下方法基于使用上述核酸存在比測定裝置、上述核酸存在比測定方法或上述核酸存在比測定程序而得到的核酸存在比和預(yù)先確定的核酸存在比與體質(zhì)及相適于體質(zhì)的藥劑處方量中至少一者的關(guān)系，判斷體質(zhì)及相適于體質(zhì)的藥劑處方量中至少一者。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定試劑盒為以下核酸存在比測定試劑盒其被使用在上述核酸存在比測定裝置、上述核酸存在比測定方法或上述核酸存在比測定程序中測定上述核酸存在比之際，該試劑盒含有能夠雜交到上述核酸混合物中的核酸中可能存在的包含靶變異的核酸序列區(qū)域的探針；能夠擴增上述核酸混合物中的核酸中可能存在的包含靶變異的核酸序列的引物對。此外，也可基于預(yù)先確定的核酸存在比與體質(zhì)及相適于體質(zhì)的藥劑處方量中至少一者的關(guān)系，將本發(fā)明的核酸存在比測定試劑盒用于判斷體質(zhì)及相適于體質(zhì)的藥劑處方量中至少一者。此外，本發(fā)明的核酸存在比測定裝置可以包括以下結(jié)構(gòu)存儲單元，存儲表示特征量之比與存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息；其中，所述特征量是基于從多個核酸存在比各不相同的多個核酸混合物各自的表示溫度與檢測信號的關(guān)系的熔解曲線、從包含大小各不相同的熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號中得出的；特征量之比計算單元，基于測定對象核酸混合物的熔解曲線的與上述多個溫度范圍分別對應(yīng)的溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號，計算特征量之比；存在比計算單元，基于由上述特征量之比計算單元計算出的特征量之比和上述存儲單元中存儲的標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。發(fā)明的效果如以上說明的那樣，根據(jù)本發(fā)明的核酸存在比測定裝置、核酸存在比測定方法以及核酸存在比測定程序，基于從具有不同的熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，能夠得到以下效果通過簡易地計算核酸存在比即可測定待測物中的核酸存在比。此外，根據(jù)本發(fā)明的判斷方法和判斷試劑盒，能夠得到以下效果使用通過本發(fā)明的核酸存在比測定裝置、核酸存在比測定方法或核酸存在比測定程序而得到的核酸存在比，能夠判斷患者的狀態(tài)。
圖1為表示本實施方式的核酸存在比測定裝置的結(jié)構(gòu)的框圖。圖2中，(A)為表示核酸混合物的熔解曲線的一個例子、⑶為表示微分熔解曲線的一個例子的圖。
圖3為表示微分熔解曲線的其他例子的圖。圖4為表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的一個例子的圖。圖5為表示本實施方式的核酸存在比測定裝置中核酸存在比測定處理例程的內(nèi)容的流程圖。圖6為表示實施例中的核酸混合物的各樣品的微分熔解曲線的圖。圖7為表示實施例中的測定對象核酸混合物的熔解曲線的圖。圖8為表示實施例中的測定對象核酸混合物的微分熔解曲線的圖。圖9為表示核酸混合物的㈧熔解曲線及⑶微分熔解曲線的其他例子的圖。圖10為用于對特征量之比的其他例子進行說明的圖。圖11為表示微分熔解曲線中兩個溫度范圍分離的例子的圖。圖12為表示微分熔解曲線中基值偏移的例子的圖。附圖標(biāo)記說明10核酸存在比測定裝置12操作部14顯示部16計算機20CPU22R0M24RAM26存儲器
具體實施例方式以下，參照附圖詳細說明本發(fā)明的核酸存在比測定裝置的實施方式。如圖1所示，本實施方式的核酸存在比測定裝置10具備操作部12，由鍵盤、鼠標(biāo)、觸摸面板、條形碼讀取器等讀取裝置構(gòu)成且用于通過操作而輸入各種信息；顯示部14， 用于顯示核酸存在比的測定結(jié)果；以及計算機16，實行核酸存在比的測定處理。計算機16含有以下結(jié)構(gòu)CPU20，控制核酸存在比測定裝置10總體；R0M22，作為存儲后述核酸存在比測定處理等的各種程序的存儲介質(zhì)；RAM24，作為工作區(qū)暫時存儲數(shù)據(jù)；存儲器26，作為存儲有各種信息的存儲單元；輸入輸出端口(I/O端口)28 ；網(wǎng)絡(luò)接口 (網(wǎng)絡(luò)I/F) 30 ；以及連接這些構(gòu)件的總線。I/O端口 28上連接著操作部12及顯示部14。 另外，還可設(shè)置HDD。此外，存儲器26，存儲有標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線表示從包含大小各不相同的熔解溫度的兩個溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號的微分值之和減去背景水平之和所得的值之比與兩種核酸的存在比的關(guān)系；其中，所述從包含大小各不相同的熔解溫度的兩個溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號的微分值之和減去背景水平之和所得的值是基于從兩種核酸存在比各不相同的多個核酸混合物各自的熔解曲線。另外，標(biāo)準(zhǔn)曲線也可預(yù)先存儲在 R0M22或HDD。此外，本實施方式中，雖然對于在計算前事先讀取預(yù)先存儲的標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況進行說明，但也可以用條形碼讀取器讀取包含標(biāo)準(zhǔn)曲線的信息的條碼，或者用各種讀取裝置讀取記錄在IC芯片、RFID中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的信息等從操作部12輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線的信息，還可以從介由I/O端口 28、網(wǎng)絡(luò)I/F30連接的外部裝置接收標(biāo)準(zhǔn)曲線的信息。這里，對標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法進行說明。首先，例如，制作使野生型核酸Wt和突變型核酸Mt這兩種核酸的存在比各不相同的多個核酸混合物，對于多個核酸混合物的每一個，使用熔解曲線分析裝置而得到熔解曲線。圖2中，(A)表示某一個核酸混合物的由溫度與吸光度或熒光強度等檢測信號的關(guān)系所表示的熔解曲線，(B)表示由溫度與檢測信號的微分值的關(guān)系所表示的熔解曲線 (也稱作微分熔解曲線)。通過從該微分熔解曲線檢測峰，從而檢測核酸Wt的熔解溫度Tmw 及核酸Mt的熔解溫度TmM，設(shè)定分別包含Tmw及TmM的溫度范圍。作為包含Tmw的溫度范圍 ATW，例如，可以設(shè)定成以Tmw與TmM之間檢測信號的微分值最小時的溫度為下限、以檢測信號的峰的峰腳所對應(yīng)的溫度為上限的溫度范圍。此外，作為包含TmM的溫度范圍Δ Tm,例如， 可以設(shè)定成以Tmw與TmM之間檢測信號的微分值最小時的溫度為上限、以檢測信號的峰的峰腳所對應(yīng)的溫度為下限的溫度范圍。另外，溫度范圍ΔΤ 及溫度范圍ΔΤΜ可以如圖2的 (B)所示那樣設(shè)定成同一寬度(例如10°C )，或者，如圖3所示那樣設(shè)定成不同的寬度(例如，溫度范圍Δ 1 為71，溫度范圍ATM*16°C)。此外，溫度范圍Δ Tw及溫度范圍Δ Tm可以設(shè)定成從各自的熔解溫度Tm加上X°C、減去X°C的寬度(X°C為例如15°C以內(nèi)，優(yōu)選10°C 以內(nèi)，更優(yōu)選7°C以內(nèi))。自動地進行這樣的溫度范圍的設(shè)定是容易的。接著，對于各個溫度范圍ATw及溫度范圍Δ TM，求出由通過微分熔解曲線的溫度范圍的下限所對應(yīng)的點和上限所對應(yīng)的點所作的直線與微分熔解曲線所圍成的面積(圖2 的(B)的斜線部分)。作為面積的求法的一個例子，具體可按以下方式求得。設(shè)溫度T下的檢測信號的微分值為f (T)，設(shè)溫度T下的基值為B(T)，根據(jù)下述式(1)求得。面積S = {f (Tsh) -B (Ts+1) } + {f (Ts+2) -B (Ts+2)}+…+ {f(IV1)-B(Th)}··· (1)其中，Ts為各溫度范圍的下限值，Te為上限值。此外，各溫度T的基值B(T)為根據(jù)下述式(2)求得的值，表示檢測信號中所包含的背景水平。通過從檢測信號的微分值減去該基值，從而能夠更適當(dāng)?shù)厝コ龣z測信號中所包含的背景的影響。
其中，
根據(jù)上述式(1)及式(2)，對各核酸混合物，求出溫度范圍Δ Tw下的面積Sw及溫度范圍△ Tm下的面積SM，制作表示面積比與各核酸混合物的存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖 4表示橫軸采用存在比(核酸Mt相對于核酸混合物的總量的比例)、縱軸采用面積比(Sm/ Sff)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的一個例子。將這樣制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線預(yù)先存儲在存儲器26中。另外，面積比可以設(shè)定為SW/SM。接著，參照圖5，對于本實施方式的核酸存在比測定裝置10中所實行的對測定對象核酸混合物的核酸存在比測定處理例程進行說明。在步驟100中，讀取存儲在存儲器26中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。接著，在步驟102中，獲取兩種核酸存在比未知的待測物(測定對象核酸混合物) 的熔解曲線的數(shù)據(jù)。熔解曲線的數(shù)據(jù)，可以從介由網(wǎng)絡(luò)I/F30連接的熔解曲線分析裝置等的外部裝置獲取，或者通過讀取記錄在記錄介質(zhì)的數(shù)據(jù)來獲取。
接著，在步驟104中，將上述步驟102中獲取的熔解曲線的檢測信號對溫度進行微分，從而計算表示溫度與檢測信號的微分值的關(guān)系的微分熔解曲線。接著，在步驟106中，對上述步驟104中計算的微分熔解曲線，設(shè)定與在制作上述步驟100中讀取的標(biāo)準(zhǔn)曲線時設(shè)定的各個溫度范圍AR Δ Tm對應(yīng)的溫度范圍ΔΤ’ 及 ΔΤ’μ。另外，溫度范圍NV ΔΤ’Μ可以設(shè)定成與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時設(shè)定的溫度范圍ATw 及Δ Tm相同的溫度范圍，也可設(shè)定成與溫度范圍L、R ΔΤΜ近似的溫度范圍。而且，對于各個溫度范圍ΔΤ’ w及溫度范圍ΔΤ’ M，求出由通過微分熔解曲線的溫度范圍的下限所對應(yīng)的點和上限所對應(yīng)的點所作的直線與微分熔解曲線所圍成的面積。具體而言，根據(jù)式(1)及式(2)，采用與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時計算各溫度范圍的面積所用相同的方法，計算溫度范圍八1~’ 下的面積5’ 及溫度范圍八1~’ 下的面積5’ 。接著，在步驟108中，使用上述步驟106中計算的面積S’w及S’M，計算面積比S’M/ S，
O ffo接著，在步驟110中，基于上述步驟108中計算出的面積比S’ M/S’ w和上述步驟 100中讀取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算與面積比S，M/S’ 對應(yīng)的核酸存在比，從而測定待測物的核酸存在比。即，測定待測物的變異的比例。接著，在步驟112中，按照顯示部14中顯示上述步驟110中的測定結(jié)果的方式，輸出測定結(jié)果，從而結(jié)束處理。另外，上述例程中，步驟102中，在讀取熔解曲線之前，事前讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線(步驟 100)，只要在步驟110中的基于面積比及標(biāo)準(zhǔn)曲線測定核酸存在比(變異的比例)之前，則可以在任一階段進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的讀取。如以上說明的那樣，根據(jù)本實施方式的核酸存在比測定裝置，基于表示兩種核酸存在比與各核酸的從包含熔解溫度的兩個溫度范圍內(nèi)的微分熔解曲線得出的面積比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，和從存在比未知的測定對象核酸混合物的微分熔解曲線的與兩個溫度范圍分別對應(yīng)的溫度范圍內(nèi)的微分熔解曲線得出的面積比，簡易地計算待測物的核酸存在比， 從而簡易地測定待測物的核酸存在比。即，可簡易地測定待測物的變異的比例。[實施例1]以下，使用c-kit基因的部分序列作為測定對象核酸，對本發(fā)明的一個實施例進行說明。作為樣品使用表3所示的核酸混合物的樣品(IO3拷貝/反應(yīng)液)，使用全自動 SNPs檢查裝置(商品名i-densy (商標(biāo))，愛科來株式會社制)進行PCR及Tm分析。PCR反應(yīng)液組成如表1所示，PCR及Tm分析的條件如表4所示。[表 1]
50μ 的PCR反應(yīng)液中:_
Ix反應(yīng)緩沖液1.25UTaq 聚合Sl 1.5mmol/L MgCl2 0.2mmol/L dNTP Ιμπιο /LF 引物(※)
權(quán)利要求
1.一種核酸存在比測定裝置，其包括檢測單元，在不同的溫度范圍內(nèi)檢測具有1個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號；存在比計算單元，基于從由上述檢測單元檢測出的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸存在比測定裝置，其包括存儲單元，存儲表示特征量之比與存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息；或輸入單元，用于輸入上述標(biāo)準(zhǔn)信息；其中，所述特征量是基于從具有各不相同的熔解溫度的核酸的存在比各不相同的多個核酸混合物各自得出的表示溫度與檢測信號的關(guān)系的熔解曲線、從包含上述熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的上述熔解曲線的檢測信號中得出的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸存在比測定裝置，其中，上述特征量之比為從一個熔解溫度附近的檢測信號水平減去背景水平所得的值與從其他熔解溫度附近的檢測信號水平減去背景水平所得的值之比；從一個熔解溫度附近的檢測信號的微分值減去背景水平所得的值與從其他的熔解溫度附近的檢測信號的微分值減去背景水平所得的值之比；一個溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和與其他溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和的比；或者從一個溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和減去背景水平之和所得的值與從其他溫度范圍內(nèi)的檢測信號的微分值之和減去背景水平之和所得的值之比。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸存在比測定裝置，其中，上述特征量之比為在表示溫度與檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中，由通過一個溫度范圍的下限值所對應(yīng)的點和上述一個溫度范圍的上限值所對應(yīng)的點所作的直線與熔解曲線所圍成的部分的面積，與由通過其他溫度范圍的下限值所對應(yīng)的點和上述其他溫度范圍的上限值所對應(yīng)的點所作的直線與熔解曲線所圍成的部分的面積之比。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸存在比測定裝置，其中，上述溫度范圍的上限值或下限值為在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中的兩個峰間檢測信號的微分值為最小時的溫度；在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中峰的峰腳所對應(yīng)的溫度；或在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中距離峰士 15°C以內(nèi)的溫度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸存在比測定裝置，其中，上述溫度范圍的上限值或下限值為在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中距離峰士 10°c以內(nèi)的溫度。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸存在比測定裝置，其中，上述溫度范圍的上限值或下限值為在表示溫度和檢測信號的微分值的關(guān)系的熔解曲線中距離峰士7°C以內(nèi)的溫度。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸存在比測定裝置，其中，上述一個溫度范圍的上限值與含有高于上述一個溫度范圍的溫度范圍的下限值為不同的值。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸存在比測定裝置，其中，從上述一個溫度范圍的下限值到上限值的寬度與從上述其他溫度范圍的下限值到上限值的寬度為同一寬度。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸存在比測定裝置，其中，從上述一個溫度范圍的下限值到上限值的寬度與從上述其他溫度范圍的下限值到上限值的寬度為不同的寬度。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸存在比測定裝置，其包括溫度控制單元，控制上述核酸混合物的溫度變化；測量單元，測量吸光度、熒光強度或相對熒光強度作為上述檢測信號。
12.一種核酸存在比測定方法，其包括檢測工序，在不同的溫度范圍內(nèi)檢測具有1個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號；存在比計算工序，基于從上述檢測工序中檢測出的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。
13.一種核酸存在比測定方法，其包括標(biāo)準(zhǔn)信息制作工序，制作表示特征量之比與存在比的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)信息，其中，所述特征量是基于從具有各不相同的熔解溫度的核酸的存在比各不相同的多個核酸混合物各自得出的表示溫度與檢測信號的關(guān)系的熔解曲線、從包含上述熔解溫度的多個溫度范圍內(nèi)的上述熔解曲線的檢測信號中得出的；特征量之比計算工序，基于測定對象核酸混合物的熔解曲線的與上述多個溫度范圍分別對應(yīng)的溫度范圍內(nèi)的熔解曲線的檢測信號，計算特征量之比；存在比計算工序，基于上述特征量之比計算工序中計算出的特征量之比和上述標(biāo)準(zhǔn)信息制作工序中制作出的標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。
14.一種判斷方法，其基于使用權(quán)利要求1所述的核酸存在比測定裝置而得到的核酸存在比和預(yù)先確定的核酸存在比與患者的狀態(tài)的關(guān)系，判斷患者的狀態(tài)。
15.一種判斷方法，其基于使用權(quán)利要求1所述的核酸存在比測定裝置而得到的核酸存在比和預(yù)先確定的核酸存在比與體質(zhì)及相適于體質(zhì)的藥劑處方量中至少一者的關(guān)系，判斷體質(zhì)及相適于體質(zhì)的藥劑處方量中至少一者。
16.一種核酸存在比測定試劑盒，其被使用在權(quán)利要求1所述的核酸存在比測定裝置中測定上述核酸存在比之際，該試劑盒含有能夠雜交到上述核酸混合物中的核酸中可能存在的包含靶變異的核酸序列區(qū)域的探針；能夠擴增上述核酸混合物中的核酸中可能存在的包含靶變異的核酸序列的引物對。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸存在比測定試劑盒，其中，上述探針為標(biāo)記探針。
全文摘要
提供能夠簡易地測定核酸存在比的核酸存在比測定裝置、核酸存在比測定方法、判斷方法以及核酸存在比測定試劑盒。一種核酸存在比測定裝置，其包括檢測單元，在不同的溫度范圍內(nèi)檢測具有1個以上熔解溫度的核酸混合物的熔解曲線的檢測信號；存在比計算單元，基于從由上述檢測單元檢測出的檢測信號中得出的特征量之比和標(biāo)準(zhǔn)信息，計算核酸存在比。
文檔編號C12M1/34GK102311915SQ20111019359
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者小森真理子, 平野勝靖 申請人:愛科來株式會社