專利名稱：一種產(chǎn)蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌分離篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)蛋白酶菌株的分離篩選方法，特別是產(chǎn)蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的分離篩選方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是當(dāng)今世界上產(chǎn)銷量最大的商業(yè)酶，廣泛應(yīng)用于食品、釀造、醫(yī)藥、紡織、皮革、洗滌劑和飼料等行業(yè)，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著重要的作用。該酶類廣泛分布于動(dòng)物、植物、 微生物中。微生物由于生產(chǎn)周期短、提取工藝簡(jiǎn)單日益成為工業(yè)酶制劑的主要來(lái)源。產(chǎn)生蛋白酶的微生物種類繁多，目前用于蛋白酶工業(yè)生產(chǎn)主要的微生物菌株是芽孢桿菌。我國(guó)的蛋白酶研究近20年取得了很大的進(jìn)展，目前，產(chǎn)酶菌株的篩選、育種、發(fā)酵、酶的純化與制備技術(shù)日趨成熟。但是，與國(guó)外相比，我國(guó)蛋白酶研究還存在許多問題，產(chǎn)酶微生物資源開發(fā)不足，蛋白酶種類較少，酶制劑品種單一，價(jià)格昂貴，產(chǎn)量低生產(chǎn)成本高，應(yīng)用面還不夠廣泛等。因此，一些產(chǎn)生高溫、低溫等酶類特殊環(huán)境微生物的研究也越來(lái)越受到關(guān)注，例如。 耐熱酶與中溫酶相比較，它的重要性在于熱穩(wěn)定性好，使用時(shí)不易因溫度的生高而失活，而且在較高的溫度下作用可抑制有害微生物的生長(zhǎng)，使用耐熱酶比中溫酶更容易控制條件。寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌是一類在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度很低環(huán)境條件生長(zhǎng)的微生物，通常定義為第一次培養(yǎng)時(shí)能夠在含碳l_15mg/L培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，該類菌具有穩(wěn)定的特殊機(jī)能和遺傳基因，在生物地球化學(xué)循環(huán)中起重要作用，但其分泌蛋白酶方面的生理功能還未被發(fā)現(xiàn)報(bào)道。新疆古爾班通古特沙漠、庫(kù)姆塔格沙漠、吐魯番火焰山是干旱、土壤貧瘠、溫度高， 鹽堿性大的特殊生態(tài)環(huán)境，為寡營(yíng)養(yǎng)、耐高溫等微生物生長(zhǎng)繁殖提供了有利自然條件。因此，從該特殊環(huán)境下分離篩選營(yíng)養(yǎng)需求低的蛋白酶高產(chǎn)菌株，由于其具備寡營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)，對(duì)于提高特殊環(huán)境微生物資源的開發(fā)及利用，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)酶制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的
眉、ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，為了解決目前存在的不足，提供一種產(chǎn)蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的分離篩選方法，該方法分離的樣品采自新疆古爾班通古特沙漠貧瘠土壤環(huán)境，采用低營(yíng)養(yǎng)配方，分離純化出的36株菌均具寡營(yíng)養(yǎng)性。通過(guò)采用明膠液化法初篩和以酪蛋白為底物復(fù)篩，從中篩選出一株產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)的菌株，菌體桿狀、菌落圓形。生長(zhǎng)所需最適碳量為 15mg碳/L培養(yǎng)基，最適生長(zhǎng)溫度為37°C，pH6. 0，野生菌產(chǎn)酶活力為3000單位，所產(chǎn)生的酶在55°C和pH 7. 0的條件下穩(wěn)定性最好。該方法選擇性強(qiáng)，效率高，所獲得的菌株?duì)I養(yǎng)需求低，產(chǎn)酶能力強(qiáng)，耐高溫，應(yīng)用于酶制劑生產(chǎn)將可降低成本。將可能成為一種具有重大應(yīng)用前景的蛋白酶產(chǎn)生菌。本發(fā)明所述的一種產(chǎn)蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌分離篩選方法，按下列步驟進(jìn)行a、采樣取新疆古爾班通古特沙漠0-5cm處土壤樣品裝入采樣袋備用；
b、菌株的分離采用平板稀釋分離法，將樣品涂布于無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)平板，溫度37°C 培養(yǎng)48小時(shí)，獲得單個(gè)菌落后，再通過(guò)劃線法純化獲取純菌株，其中無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)基為 (NH4)2SO4 0.5，KH2PO4 lg, MgSO4O. 2g, NaCl 5g，CaCO3 5g，葡萄糖用量為每升培養(yǎng)基中含碳量為 15mg，瓊脂粉 llg，蒸餾水 1000ml, pH 7. 0-7. 2 ；C、初篩將步驟b分離獲得的純菌株通過(guò)穿刺的方式接種于明膠培養(yǎng)基上，溫度 37°C培養(yǎng)48小時(shí)，選取液化明膠能力強(qiáng)的菌株，其中明膠培養(yǎng)基為牛肉膏3g，蛋白胨5g， 明膠 120g，蒸餾水 1000ml, ρΗ7· 0-7. 2 ；d、復(fù)篩將步驟c初篩獲得的菌株，接種于豆餅粉液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝液量 35mL/250mL三角瓶，溫度37°C搖瓶振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，以酪蛋白為底物測(cè)酶活后篩選酶活力高的菌株即可，其中豆餅粉培養(yǎng)基為玉米粉20g，豆餅粉15g，麩皮 20g, Na2HPO4 0. 3g, NaH2PO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸餾水 1000ml, pH 7-7. 2。本發(fā)明所述的一種產(chǎn)蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌分離篩選方法，該方法包括以下步驟采樣樣品采自細(xì)菌新疆古爾班通古特沙漠；菌株分離純化采用了低碳的培養(yǎng)基配方，平板稀釋分離法獲得單個(gè)菌落；初篩以明膠培養(yǎng)基上穿刺進(jìn)行初篩，獲取液化量大的菌株進(jìn)行復(fù)選；復(fù)選對(duì)初選菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，通過(guò)搖瓶振蕩培養(yǎng)后，發(fā)酵液的上清液通過(guò)紫外分光測(cè)定以酪蛋白為底物測(cè)得酶活，獲取野生菌酶活在3000單位以上的菌株G-16(圖1)， 將該菌接種于斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后保存于4°C冰箱中；寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌G-16基本特性觀察了所選寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌G-16的形態(tài)(見圖2)、培養(yǎng)特征，營(yíng)養(yǎng)需求(圖3)，生長(zhǎng)溫度(圖4)、pH生長(zhǎng)溫度(圖5)。寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)酶發(fā)酵液的制備將復(fù)選得到的斜面菌種G-16接種于搖瓶液體培養(yǎng)基中37°C搖床振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，獲得粗酶液。酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性分析通過(guò)在不同溫度和不同PH條件下測(cè)定培養(yǎng)液(粗酶液)中的酶活，分析了酶的熱穩(wěn)定性(圖6)和pH穩(wěn)定性(圖7)。


圖1為本發(fā)明篩選出的液化明膠能力極強(qiáng)的G-16菌株。圖2為本發(fā)明菌株G-16的個(gè)體形態(tài)(X 1000)。圖3為本發(fā)明菌株G-16的營(yíng)養(yǎng)需求。圖4為本發(fā)明菌株G-16生長(zhǎng)對(duì)溫度的需求。圖5為本發(fā)明菌株G-16生長(zhǎng)對(duì)pH的需求。圖6為本發(fā)明酶的熱穩(wěn)定性。圖7為本發(fā)明酶的pH穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的樣品取自于新疆古爾班通古特沙漠0-5cm處土壤采樣，根據(jù)寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的生理需求確定分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基的配方，經(jīng)過(guò)分離純化獲得單個(gè)菌落，以明膠和酪蛋白
4為底物進(jìn)行初選和復(fù)選，最終得到1株高溫蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)菌種。實(shí)施例1培養(yǎng)基的制備分離培養(yǎng)基斜面/ 平板培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0. 5，KH2PO4 lg, MgSO4O. 2g，NaCl 5g， CaCO3 5g，葡萄糖(每升培養(yǎng)基中含碳量為15mg)，瓊脂粉Ilg(液體培養(yǎng)基不加)；蒸餾水 1000ml, ρΗ7· 0-7. 2 ；初選培養(yǎng)基明膠培養(yǎng)基為牛肉膏3g，蛋白胨5g，明膠120g，pH7. 0-7. 2 ；復(fù)選培養(yǎng)基/搖瓶培養(yǎng)基玉米粉20g，豆餅粉15g，麩皮20g，Na2HPO4 0. 3g， NaH2PO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸溜水 1000ml，pH 7-7. 2 ；采樣取新疆古爾班通古特沙漠0-5cm處土壤樣品裝入采樣袋備用；菌株的分離將樣品采用平板稀釋分離法，涂布于分離培養(yǎng)基(無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)基)平板，溫度37°C培養(yǎng)48小時(shí)，獲得單個(gè)菌落后，再通過(guò)劃線法純化獲取純菌株，通過(guò)此方法分離出36株寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，將其編號(hào)為Gl-36，此菌株供初選產(chǎn)蛋白酶用；初篩將分離獲得的純菌株分別通過(guò)穿刺的方式接種于滅菌后明膠培養(yǎng)基上 (5mL培養(yǎng)基/管)，溫度37°C培養(yǎng)48小時(shí)，觀察液化情況，選取其中2株具有液化明膠能力強(qiáng)的菌株；復(fù)篩將復(fù)篩培養(yǎng)基配制成液體培養(yǎng)基，取50mL培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶中，經(jīng) IKg壓力滅菌30min后，冷卻，分別將5mL初篩獲得的兩株菌株的菌懸液(取一環(huán)斜面菌種放入5mL無(wú)菌水中搖勻?yàn)榫鷳乙?，接種于液體培養(yǎng)基中，溫度37°C搖瓶振蕩培養(yǎng)48小時(shí)， 搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，以酪蛋白為底物測(cè)酶活后篩選酶活力高的菌株即可。結(jié)果表明G-16的酶活為3000單位(圖1- ，將該菌接種于斜面培養(yǎng)基上溫度4°C保存。通過(guò)本發(fā)明所述的方法獲得的菌株G-16的基本特性觀察形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察取溫度37°C培養(yǎng)48小時(shí)的斜面菌種在光學(xué)顯微鏡下觀察， 結(jié)果表明菌株G-16為桿狀(見圖2)；菌落圓形，濕潤(rùn)，隆起明顯，邊緣整齊，淡土黃色。不同碳量對(duì)菌株G-16生長(zhǎng)的影響以分離培養(yǎng)基= (NH4)2SO4 0. 5，KH2PO4 Ig, MgSO4 0. 2g，NaCl 5g，CaCO3 5g，葡萄糖，蒸餾水1000ml，pH7. 0-7. 2配制成液體培養(yǎng)基，分別制備使得每升培養(yǎng)基中的含碳量分別為lmg、5mg、10mg、15mg或20mg的培養(yǎng)基，接種后溫度37°C培養(yǎng)48天，菌體生長(zhǎng)以Du 800型分光光度計(jì)680nm處所測(cè)定的光密度值大小表示， 結(jié)果表明G-16生長(zhǎng)的最適碳量為15mg/L培養(yǎng)基，進(jìn)一步表明了其寡營(yíng)養(yǎng)性。不同溫度對(duì)菌株G-16生長(zhǎng)的影響在斜面/平板培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，接種后置溫度10°C、20°C、30°C、37°C、40°C、45°C、50 V、60°C或70 V培養(yǎng)48小時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量以 Du 800型分光光度計(jì)680nm處所測(cè)定的光密度值的大小表示，結(jié)果表明該菌的最適生長(zhǎng)溫度為37°C。不同pH值對(duì)菌株G-16生長(zhǎng)的影響在斜面/平板培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，分別調(diào) PH值為5、6、7、8、9、10或11，接種后溫度37°C培養(yǎng)48小時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量以Du 800型分光光度計(jì)680nm處所測(cè)定的光密度值的大小表示，結(jié)果表明該菌的最適生長(zhǎng)pH為6. O。粗酶液的制備和酶活力測(cè)定粗酶液的制備按照搖瓶培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)液，搖瓶培養(yǎng)基玉米粉20g，豆餅粉 1 ，麩皮 20g, Na2HPO4 0. 3g, NaH2PO4g 0. 2g, MgSO4O. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸餾水 1000ml，pH7-7. 2，培養(yǎng)基裝量為50πι ν250ιΛ，Ikg壓力滅菌30min，冷卻后，保存于4°C冰箱中，從斜面菌種取一環(huán)接種于250毫升的三角瓶中，200轉(zhuǎn)/分，溫度37°C振蕩培養(yǎng)60小時(shí)獲得菌株 G-16產(chǎn)酶發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)lOOOr/min離心25分鐘，上清液即為粗酶液。蛋白酶活力測(cè)定采用福林酚法，在溫度60°C下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1微克酪氨酸定義為一個(gè)酶活力單位，采用乳酸緩沖液系統(tǒng)。酶熱、pH穩(wěn)定性分析酶熱穩(wěn)定性酶的熱穩(wěn)定性以酪蛋白為底物，取酶液在溫度55-90°C測(cè)得酶活力結(jié)果(圖6)表明，該酶在溫度55°C，1小時(shí)活力在90%以上，溫度60°C，1小時(shí)酶活力是原來(lái)的65%，經(jīng)溫度90°C，1小時(shí)酶活力未完全喪失，證明菌株G-16產(chǎn)生的酶熱穩(wěn)定性能較好為耐熱酶。酶的pH穩(wěn)定性酶液用不同pH的乳酸緩沖液稀釋100倍，于溫度37°C保持48小時(shí)，測(cè)定酶活力結(jié)果(圖7)表明，以酪蛋白為底物時(shí)，該酶在pH6. 0-8. O比較穩(wěn)定，酶活均在96%以上，7. O最穩(wěn)定，酶活為原來(lái)的100%。
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌分離篩選方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行a、采樣取新疆古爾班通古特沙漠0-5cm處土壤樣品裝入采樣袋備用；b、菌株的分離采用平板稀釋分離法，將樣品涂布于無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)平板，溫度37°C培養(yǎng) 48小時(shí)，獲得單個(gè)菌落后，再通過(guò)劃線法純化獲取純菌株，其中無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)基為(NH4)2SO4 0.5，KH2PO4 IgjMgSO4O. 2g, NaCl 5g，CaCO3 5g，葡萄糖用量為每升培養(yǎng)基中含碳量為15mg， 瓊脂粉 llg，蒸餾水 1000ml，pH 7. 0-7. 2 ；c、初篩將步驟b分離獲得的純菌株通過(guò)穿刺的方式接種于明膠培養(yǎng)基上，溫度37°C 培養(yǎng)48小時(shí)，選取液化明膠能力強(qiáng)的菌株，其中明膠培養(yǎng)基為牛肉膏3g，蛋白胨5g，明膠 120g，蒸餾水 1000ml，pH7. 0-7. 2 ；d、復(fù)篩將步驟c初篩獲得的菌株，接種于豆餅粉液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝液量 35mL/250mL三角瓶，溫度37°C搖瓶振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，以酪蛋白為底物測(cè)酶活后篩選酶活力高的菌株即可，其中豆餅粉培養(yǎng)基為玉米粉20g，豆餅粉15g，麩皮 20g, Na2HPO4 0. 3g, NaH2PO4 0. 2g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g，蒸餾水 1000ml, pH 7-7. 2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)蛋白酶的寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌分離篩選方法，該方法分離的樣品采自新疆古爾班通古特沙漠貧瘠土壤環(huán)境，采用低營(yíng)養(yǎng)配方，分離純化出的36株菌均具寡營(yíng)養(yǎng)性。通過(guò)采用明膠液化法初篩和以酪蛋白為底物復(fù)篩，從中篩選出一株產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)的菌株，菌體桿狀、菌落圓形。該方法選擇性強(qiáng)，效率高，所獲得的菌株?duì)I養(yǎng)需求低，產(chǎn)酶能力強(qiáng)，耐高溫，應(yīng)用于酶制劑生產(chǎn)將可降低成本。將可能成為一種具有重大應(yīng)用前景的蛋白酶產(chǎn)生菌。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102268392SQ20111019409
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者吳楠, 張?jiān)? 潘惠霞, 牟書勇, 程爭(zhēng)鳴, 齊曉玲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所