專利名稱：乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒、檢測方法、引物及其探針的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術領域、特別涉及一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒檢測方法、弓I物及其探針。
背景技術：
乙肝病毒(HBV)是一種高危險性的病毒，乙型肝炎病毒感染在世界范圍廣泛流行，乙肝病毒感染不僅可導致急、慢性病毒性肝炎，而且還可發(fā)展為肝硬化及肝細胞癌、每年導致大約100萬人死亡、嚴重影響了人類的健康。乙肝病毒吸附并進入肝細胞后脫去衣殼、在DNA聚合酶作用下、以負鏈DNA為模板修補正鏈空隙、從而形成共價閉合環(huán)狀的雙鏈 DNA進入細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄。在乙肝病毒的復制過程中，由于RNA的反轉(zhuǎn)錄缺乏讀碼校正功能、 所以容易導致堿基錯配的發(fā)生，因而病毒基因突變十分頻繁，乙肝病毒的變異率是其它DNA 病毒的10倍左右。病毒的變異導致病毒耐藥株的出現(xiàn)，耐藥株的出現(xiàn)是與病毒的高變異率和免疫壓力以及各種抗病毒治療藥物誘導變異等綜合因素的結(jié)果。隨著抗病毒藥物治療的廣泛開展，病毒變異和耐藥株不斷出現(xiàn)，一個位點的突變甚至可以引起對多種藥物的交叉耐藥。拉米夫定(lamivudine、LAM)是一種雙脫氧核苷類似物，拉米夫定作用于乙肝病毒基因開放閱讀框的P區(qū)后，能迅速抑制乙型肝炎病毒的復制，使血清轉(zhuǎn)氨酶降至正常水平。長期服用拉米夫定可顯著改善肝臟炎癥性壞死、減輕或阻止肝臟纖維化的進程。然而由于乙肝病毒超螺旋的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子的存在，短期用藥很難治愈乙型肝炎，拉米夫定的用藥必須在一年以上；拉米夫定的長期使用容易導致病毒耐藥，患者在服用該藥后 6 8個月即可能出現(xiàn)耐藥的病毒株，隨著服藥時間的延長，耐藥率明顯增加。研究表明，長期服用拉米夫定藥物，乙肝病毒DNA的P區(qū)204位的YMDD基序的蛋氨酸會被纈氨酸、異亮氨酸或被絲氨酸所取代、分別生成YVDD、YIDD或YSDD、三者均對拉米夫定耐藥、YV/IDD是被廣泛報道和研究的突變類型；YSDD變異是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的變異類型，這種變異株是從 1例接受拉米夫定治療18個月患者的血清中發(fā)現(xiàn)的，體外轉(zhuǎn)染研究也證實了這種YSDD變異株對拉米夫定耐藥，大量測序研究表明，拉米夫定耐藥的病毒株在204位密碼子發(fā)生突變的同時常會出現(xiàn)180位密碼子的聯(lián)合突變，即180位的亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?，生成rtL180M。現(xiàn)有技術中拉米夫定的耐藥突變檢測的方法主要有直接測序法、錯配PCR限制性片斷多態(tài)性分析法、基因芯片法、焦磷酸測序法、高效變性液相色譜法(DHPLC)和實時定量 PCR等。這些方法各有利弊、并且有些檢測方法的弊端暫時還沒有較好的解決辦法。1、直接測序法DNA直接測序法一直被認為是檢測基因突變的金標準。很多學者都曾利用直接測序法或結(jié)合其他方法檢測乙肝病毒YMDD基序變異、但由于直接測序法在大多數(shù)情況會要求將目標序列先進行PCR擴增并連接到載體，費時、費力且必須送到測序公司完成測序，顯然不適合于乙肝病毒的快速診斷和大規(guī)模的檢測。另外，直接測序法對于含量低的病毒以及混合突變的病毒檢測顯得不夠靈敏，對于野生、突變混合型或不同突變型混合存在的病毒，大多數(shù)情況下只能檢測到其中的一種DNA含量較高的優(yōu)勢病毒株；當然、直接測序法能檢測新發(fā)突變位點是它的最大優(yōu)勢。2、錯配PCR和限制性片段長度多態(tài)性分析技術錯配PCR技術最早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰島素基因缺陷的檢查、目前已廣泛應用于基因點突變的檢測。根據(jù)PCR引物設計的不同、可將錯配PCR分為間接和直接錯配PCR;間接錯配PCR的引物與野生型完全互補，突變株不能PCR擴增；直接錯配PCR的引物與特定的點突變完全互補，野生株不能進行PCR擴增。RFLP技術是利用限制性內(nèi)切酶專一性識別切割DNA序列的特點，不同的序列就會被切割成長短不一的DNA片段， 再通過凝膠電泳觀察酶切結(jié)果，然后對酶切圖像進行多態(tài)性分析找出差異。Allen等研究表明，錯位PCR和RFLP聯(lián)合檢測YMDD的突變株是十分精確的，有人認為在檢測野生型病毒和突變型病毒混合存在的樣本時RFLP比直接測序法更敏感。盡管如此，錯位PCR-RFLP技術也是有缺陷的，該方法對于低濃度的突變和混合突變檢測敏感性不太高、且操作較復雜、耗時較長、只能檢測已知的突變位點等。3、基因芯片技術生物芯片技術是根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生物學研究中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生化分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列為分析對象的基因芯片，固體芯片表一定的陣列集成了大量的特異目標探針，它能與待測的有熒光標記的樣品核酸通過堿基互補雜交反應，通過激光共聚焦系統(tǒng)檢測到雜交信號、數(shù)據(jù)資料經(jīng)由計算機分析處理、最后獲取樣品的各種信息，完成對核酸序列的大規(guī)模高通量分析?；蛐酒夹g廣泛應用于基因突變的檢測，且檢測精度很高，對于檢測耐藥乙肝病毒是可靠和有用的一種工具；生物芯片技術與傳統(tǒng)的儀器檢測方法相比具有高通量、 微型化、自動化、成本低、防污染等特點，其缺點是費用很高、數(shù)據(jù)可能需要專業(yè)的生物信息學人員分析、只能檢測已知的突變位點等。4、焦磷酸測序技術焦磷酸測序技術是由Nyren等人于1987年發(fā)展起來的一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術、該技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，當引物與模板DNA 退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術的反應體系由反應底物、待測單鏈、 測序引物和4種酶構成。該技術可以用在研究單核苷酸多態(tài)性(SNP)、遺傳多態(tài)性、植物多態(tài)性分析、分子診斷細菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學等方面。該技術不需要凝膠電泳、也不需要對DNA樣品進行任何特殊形式的標記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點。宋家武等，應用該技術建立了高通量測定乙型肝炎病毒YMDD突變區(qū)的方法，經(jīng)標準的YMDD突變質(zhì)粒及血清標本的重復性及可靠性檢測，質(zhì)粒標準品的突變檢出率及重復率均達100%，而血清標本達98.8%。然而焦磷酸測序技術需要購買專門的實驗儀器、只能精確檢測大約40bp左右的堿基，而傳統(tǒng)的測序技術可對500bp堿基進行檢測。可見，焦磷酸測序技術更適于對已知突變位點的大規(guī)模檢測，而不適于對大范圍基因突
6變的篩選，這正好滿足臨床上對乙肝病毒YMDD突變檢測的需求。5、變性高效液相色譜(DHPLC)DHPLC技術是近年來發(fā)展起來的一項新的分析技術，DHPLC亦稱為溫度調(diào)節(jié)的雜合雙鏈分析，其利用在部分變性條件下同源、異源雙鏈DNA解鏈特征的差異進行變異檢測。 另外在非變性條件或完全變性條件下，DHPLC還可用于分離、分析雙鏈或單鏈核酸片段，它是分離核苷酸片段及分析檢測已知未知基因突變和SNP的最佳技術平臺，其核心技術采用 Transgenomic公司專利技術的DNA Sepcartridge分離柱。柱溫是決定DHPLC敏感性的最關鍵因素，先把野生型和突變型PCR產(chǎn)物等比例混合，將柱溫升高使DNA片段開始變性，在部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性復性過程，形成同源雙鏈，同時也錯配形成異源雙鏈。由于異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同，在相同的部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，被色譜柱保留時間短于同源雙鏈，故先被較低濃度的乙腈洗脫下來，從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線，異源雙鏈將被測序以識別可能的突變位點；完全匹配的同源雙鏈在目標產(chǎn)物處出現(xiàn)一個單峰。陳發(fā)林等，通過該方法檢測結(jié)果顯示野生型YMDD的圖形呈單峰，而變異型YIDD、YVDD的DHPLC圖形呈現(xiàn)3峰，且峰型低矮、寬大、與野生型YMDD的 DHPLC圖形明顯不同。DHPLC具有快速、高通量、靈敏性更高、特異性更強、廉價省時、操作簡單等優(yōu)點。但是、它對待檢樣本的PCR擴增要求比較高，不但有PCR引物設計、PCR條件控制、擴增片斷最適長度的要求，還對PCR樣品的質(zhì)量和含量、擴增產(chǎn)物的特異性有較高要求。PCR擴增特異性差時，會導致假陽性，以致檢測失敗?，F(xiàn)有技術中還沒有一種熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸試劑
品.ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例的目的是針對上述現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種具有高度的特異性、 靈敏度與準確性、且技術操作簡便、自動化程度高的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術方案是一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒、該試劑盒含有(1)熒光定量PCR反應液其中包括DEPC處理水、具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOX熒光定量 PCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、rtM204I/V(YM/I/VDD)檢測特有的rt204位點正向引物、 rt204位點反向引物和rt204M/rt204I/rt204V位點探針以及rtL180M檢測特有的rtl80位點正向引物、rt 180位點反向引物和rtl80L/rtl80M位點探針；①rt204位點正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3'；rt204位點反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3'；rt204M 位點探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示5' CATCATCCATATAACTG 3'；
rt204I 位點探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 4 所示5' CACATCATCAATATAACT 3'；rt204V 位點探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 5 所示5' TCATCCACATAACTG 3'；②rtl80位點正向引物如序列表中SEQ ID NO. 6所示 5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA3‘；rtl80位點反向引物如序列表中SEQ ID NO. 7所示 5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA3‘；rtl80L 位點探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 8 所示5 ‘ CGTTTCTCYTGGCTCA 3'；rtl80M 位點探針序列如序列表中 SEQ ID N0. 9 所示5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；其中，以上所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光基團修飾；所述引物序列中， Y = (C/T)、R = A/G ；O) DNA 提取液①溶液A，為聚乙二醇6000 ；②溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris_HCl、 NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；(3)質(zhì)控品①陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS載體質(zhì)粒DNA片段；②陽性質(zhì)控品，檢測rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為 1. 0X 106copy/mL 的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應基因組的 DNA 片段，檢測 rtL180M 時，為 1. 0 X 106copy/mL 的含有rtl80L/rtl80M相應基因組的DNA片段；③臨界陽性質(zhì)控品，檢測rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為1. 0X 104copy/mL的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應基因組的 DNA 片段，檢測 rtL180M 時，為 1. 0 X 104copy/mL 的含有rtl80L/rtl80M相應基因組的DNA片段；(4)工作標準品檢測rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為 PSG-TS rt204 的質(zhì)粒 DNA，該質(zhì)粒是在 PSG-TS 載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt204M/rt204I/rt204V區(qū)間的133個堿基對的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測rtL180M時，為PSG-TS rtl80的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在 PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rtl80L/rtl80M區(qū)間的151個堿基對的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；該2個重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖，具體包括a、工作標準品 1，為 1. OX 107copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X107copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；b、工作標準品 2，為 1. OX 106copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；c、工作標準品 3，為 1. OX 105copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；d、工作標準品 4，為 1. OX 104copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液。所述具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶為Taq酶。
所述熒光定量PCR反應液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. 5 μ L ；濃度為5U/ μ L的熱啟動Taq酶用量0. 3 μ L ；濃度為lOmmol/L的dNIPs用量1 μ L ;10X熒光定量PCR Buffer用量5 μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L、濃度為10 μ mol/L的正向引物用量1.6yL、濃度為10 μ mol/L的反向引物用量1.6yL、濃度為10 μ mol/L的探針用量lyL。其中檢測rtM204I/V時，PCR反應液中包含的引物為rt204位點正向引物和rt204位點反向引物，探針為rt204M位點探針、rt204I位點探針和rt204V位點探針；檢測rtL180M 時，PCR反應液中包含的引物為rtl80位點正向引物和rtl80位點反向引物，探針為rtl80L 位點探針、和rtl80M位點探針；所述聚乙二醇6000的濃度為15% ；所述乙二胺四乙酸(SDS)濃度為0. 5% ；所述 Tris-HCl的pH值為8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的濃度為0. 1%。本發(fā)明實施例還提供利用所述的試劑盒檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸的檢測方法，包括下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測血清100 μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm離心 1011^11，去上清，加入5(^1^裂解溶液8充分混勻后，在1001加熱lOmin，再次13000rpm離心lOmin，取上清液待測；(3)加樣向裝有45 μ L熒光定量PCR反應液的PCR反應管中分別加入處理后的樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、工作標準品5 μ L，蓋好管蓋，5000rpm離心10秒；(4)熒光定量PCR擴增將各反應管放入熒光定量PCR儀器的反應槽內(nèi)，設置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列條件進行熒光定量PCR擴增；94 "C 5 分鐘；94 °C 30 秒、58 °C 45 秒，5 個循環(huán)；95°C 30秒、58°C 45秒，35個循環(huán)，收集熒光信號，在反應程序的第二步的終了讀取熒光Ct值；(5)分析判斷Ct值小于觀的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于等于觀且小于等于32的為臨界陽性。進一步地，當需要繪制標準曲線時，另取4個反應管，直接加入不同濃度梯度的工作標準品5 μ L，5000rpm離心10秒，放入熒光定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。本發(fā)明還提供一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測引物和探針，
包括下述正向引物、反向引物和熒光探針的一組序列①204位點引物和探針rt204位點正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3'；rt204位點反向引物序列如序列表中SEQ ID N0. 2所示5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3'；rt204M位點探針序列如序列表中SEQ ID N0. 3所示5' CATCATCCATATAACTG 3'；
rt204I位點探針序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示5' CACATCATCAATATAACT 3'；rt204V位點探針序列如序列表中SEQ ID NO. 5所示5' TCATCCACATAACTG 3'；②180位點引物和探針rtl80位點正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示5' TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3'；rtl80位點反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 7所示5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3'；rtl80L位點探針序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示5' CGTTTCTCYTGGCTCA 3'；rtl80M位點探針序列如序列表中SEQ ID N0. 9所示5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補的一組序列；上述的任意一組序列可單獨使用、或以所有序列組之間的任意組合形式而使用；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光染料修飾。其中，熒光探針的5，端修飾的熒光染料可選自FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU, NEP ；3，端修飾的熒光染料可選自TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。本發(fā)明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是本發(fā)明試劑盒利用特異性的 TaqMan探針來檢測乙型肝炎病毒，檢測完成后無需開蓋電泳，避免了產(chǎn)物污染及對實驗室人員的傷害。本發(fā)明可用LNA探針、MGB探針、AllGlo 探針來實現(xiàn)。本發(fā)明實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實時檢測克服了擴增產(chǎn)物終點檢測所存在的“平臺效應”對產(chǎn)物定量的影響；本發(fā)明采用實時熒光定量PCR技術定量檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥毒株，試劑盒可以單用和多重檢測乙肝病人的拉米夫定耐藥情況，熒光定量PCR方法改進為“2步法”，避免了 PCR延伸的步驟、探針可以標記多種熒光標記，同時還具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優(yōu)點。且技術操作簡便、自動化程度高；由于采用閉管操作，不需要PCR產(chǎn)物后處理，有效解決PCR污染問題等特點，結(jié)果可靠。


圖1是本發(fā)明實施例1中提供的拉米夫定耐藥位點rt204三重熒光定量PCR實驗結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實施例1中提供的拉米夫定耐藥位點rtl80 二重熒光定量PCR實驗結(jié)果圖；圖3A、圖3B、圖3C、圖3D、圖3E和圖3F是本發(fā)明實施例1中提供的拉米夫定耐藥位點rt204重組質(zhì)粒倍比稀釋擴增曲線和標準曲線結(jié)果圖4A、圖4B、圖4C和圖4D本發(fā)明實施例1中提供的拉米夫定耐藥位點rtl80重組質(zhì)粒倍比稀釋擴增曲線和標準曲線結(jié)果圖；圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E和圖5F是本發(fā)明實施例2中提供的拉米夫定耐藥位點rt204位點YMDD/YIDD/YVDD分別檢測樣本的熒光定量PCR實驗結(jié)果和標準曲線圖；圖6A、圖6B、圖6C和圖6D是本發(fā)明實施例2中提供的拉米夫定耐藥位點rtl80 位點180L/180M分別檢測樣本的熒光定量PCR實驗結(jié)果和標準曲線圖。圖1、圖2、圖3A、圖3C、圖3E、圖4A、圖4C、圖5A、圖5C、圖5E、圖6A和圖6C中的橫坐標表示循環(huán)數(shù)(Cycle number)、縱坐標表示熒光值(Delta Rn)；圖3B、圖3D、圖3F、圖4B、圖4D、圖5B、圖5D、圖5F、圖6B和圖6D中橫坐標表示 LogCo (乙肝病毒起始濃度的對數(shù)值)、縱坐標表示Ct值。
具體實施例方式為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚、下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，該試劑盒含有熒光定量PCR反應液、其中包括DEPC處理水、Taq酶、dNTPs、10X熒光定量PCR Buffer、 含有Mg2+離子的溶液、正向引物、反向引物、探針；溶液A，為聚乙二醇6000 ；溶液B，其中包括EDTA、SDS、Tri s-HCl、NP-40 ；陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS質(zhì)粒DNA片段；陽性質(zhì)控品，檢測 rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為 1. O X 106copy/mL 的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應基因組的DNA片段，檢測rtL180M時，為1. O X 106copy/mL的含有rtl80L/rtl80M相應基因組的DNA片段；臨界陽性質(zhì)控品，檢測rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為1. OX 104copy/mL 的含有rt204M/rt204I/rt204V相應基因組的DNA片段，檢測rtL180M時，為1. O X IO4Copy/ mL的含有rtl80L/rtl80M相應基因組的DNA片段；工作標準品，檢測rtM204I/V (YM/I/VDD) 的工作標準品為PSG-TS rt204的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt204M/rt204I/rt204V區(qū)間的133個堿基對的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測rtL180M的工作標準品為PSG-TS rtl80的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入乙型肝炎病毒基因組中含有rtl80L/rtl80M區(qū)間的151個堿基對的核苷酸片段的重組質(zhì)粒；該2個重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖。試劑盒的制造1.試劑本試劑盒制造過程中所用的試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司。2.熒光定量PCR反應液制備(1)引物及探針設計與合成選擇乙型肝炎病毒耐藥相關的P基因的特異突變位點區(qū)域片段作為目標檢測基因，通過美國國家生物技術信息中心(NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，獲得乙型肝炎病毒目前已有的8個基因型的乙型肝炎病毒耐藥突變位點的基因序列，并通過 VectorNTIAdvance 11軟件分別對8個基因型的相應耐藥突變位點區(qū)間進行序列比對，選擇保守區(qū)域設計引物和探針。rt204M序列如序列表中SEQ ID NO. 10所示
CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG TTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTrt204I序列如序列表中SEQ ID NO. 11所示CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG TTATATTGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTrt204V序列如序列表中SEQ ID NO. 12所示CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG TTATGTGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTrtl80L序列如序列表中SEQ ID NO. 13所示GCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAA TTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGC TTTCCCCrtl80M序列如序列表中SEQ ID NO. 14所示GCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAA TTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCT TTCCCC。利用實時TaqMan熒光定量PCR的專業(yè)設計軟件I^rimer Express 3.0設計引物、探針序列。引物、探針序列不僅要滿足軟件中各項指標，而且要確保引物、探針序列能檢測全部8個基因型序列。在本發(fā)明中，探針的5，端修飾的熒光染料可選自FAM、HEX、TET、J0E、 VIC、ROX, Cy3、Cy5、MAR、JUP, SAT、PLU, NEP 或 URA ;3’ 端修飾的熒光染料可選自TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL 等。設計結(jié)果如下表所示
權利要求
1.一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有(1)熒光定量PCR反應液其中包括DEPC處理水、具有5，一3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOX熒光定量 PCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、rt204位點正向引物、rt204位點反向引物、rt204M位點探針、rt204I位點探針、rt204V位點探針、rtl80位點正向引物、rtl80位點反向引物和 rtl80L位點探針、rtl80M位點探針；①204位點引物和探針rt204 位點正向引物序列為5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3‘； rt204 位點反向引物序列為5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3‘； rt204M 位點探針序列為5, CATCATCCATATAACTG 3'； rt204I 位點探針序列為5, CACATCATCAATATAACT 3'； rt204V 位點探針序列為5, TCATCCACATAACTG 3'；②180位點引物和探針r1180 位點正向引物為5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘； r1180 位點反向引物為5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3 ‘； rtl80L 位點探針序列為5' CGTTTCTCYTGGCTCA 3'； rtl80M 位點探針序列為5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；其中，上述探針的5’端和3’端分別用熒光基團修飾；所述引物序列中，Y = (C/T), R = A/G；O) DNA提取液①溶液A，為聚乙二醇6000；②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl和乙基苯基聚乙二醇；(3)質(zhì)控品①陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS載體質(zhì)粒DNA；②陽性質(zhì)控品，檢測rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為 1. 0X 106copy/mL 的含有 rt204M/ rt204I/rt204V相應基因組的DNA片段，檢測rtL180M時，為1. 0X 106copy/mL的含有 rtl80L/rtl80M相應基因組的DNA片段；③臨界陽性質(zhì)控品，檢測rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為1.0X 104copy/mL的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應基因組的 DNA 片段，檢測 rtL180M 時，為 1. 0 X 104copy/mL 的含有rtl80L/rtl80M相應基因組的DNA片段；(4)工作標準品檢測rtM204I/V(YM/I/VDD)時，為PSG-TS rt204的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt204M/rt204I/rt204V區(qū)間的133個堿基對的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測rtL180M時，為PSG-TS rtl80的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS 載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rtl80L/rtl80M區(qū)間的151個堿基對的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；該2個重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖。
2.根據(jù)權利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，其中熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3’ 端修飾的熒光染料選自TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
3.根據(jù)權利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液由溶液A和溶液B組成；所述溶液A，為聚乙二醇6000 ；所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。
4.根據(jù)權利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述工作標準品包括a、工作標準品1，為 1.0X107copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0 X IO7Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；b、工作標準品2，為 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO6Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；C、工作標準品 3，為 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO5Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；d、工作標準品 4，為 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO4Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液。
5.根據(jù)權利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述具有5’ 一3’外切活性的DNA聚合酶為Taq酶。
6.根據(jù)權利要求5所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR反應液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. 5μ L ；濃度為5U/ μ L的熱啟動Taq酶用量0. 3 μ L ；濃度為lOmmol/L的dNIPs用量1 μ L ;10X熒光定量PCR Buffer用量5μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L，濃度為ΙΟμπιοΙ/L的正向引物用量1.6yL、濃度為lOymol/L的反向引物用量1.6yL、濃度為lOymol/L的探針用量 IyL0
7.根據(jù)權利要求3所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述聚乙二醇6000的濃度為15% ；所述乙二胺四乙酸濃度為0.5% ；所述Tris-HCl的 PH值為8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的濃度為0. 1%。
8.一種利用權利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測血清100μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm離心IOmin, 去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加熱10min，13000rpm再離心IOmin, 取上清液待測；(3)加樣向裝有45μ L熒光定量PCR反應液的PCR反應管中分別加入處理后的樣品、 陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、工作標準品各5 μ L，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心 10秒；(4)熒光定量PCR擴增將各反應管放入熒光定量PCR儀器的反應槽內(nèi)，設置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列條件進行熒光定量PCR擴增； 94 0C 5分鐘；(94 0C 30 秒，58 °C 45 秒，5 個循環(huán)；(940C 30秒，58°C 45秒，35個循環(huán)；收集熒光信號，在反應程序的第二步的終了讀取熒光Ct值；(5)分析判斷Ct值小于觀的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于觀且小于或等于32的為臨界陽性。
9.一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測引物和探針，包括下述正向引物、反向引物和熒光探針的一組序列①204位點引物和探針rt204 位點正向引物序列為5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3‘； rt204 位點反向引物序列為5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3 ‘； rt204M 位點探針序列為5, CATCATCCATATAACTG 3'； rt204I 位點探針序列為5, CACATCATCAATATAACT 3'； rt204V 位點探針序列為5, TCATCCACATAACTG 3'；②180位點引物和探針r1180 位點正向引物為5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘；r1180 位點反向引物為5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3 ‘；rtl80L 位點探針序列為5' CGTTTCTCYTGGCTCA 3'；rtl80M 位點探針序列為5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補的一組序列；上述的任意一組序列可單獨使用、或以所有序列組之間的任意組合形式而使用； 其中，所述探針的5’端和3’端分別用熒光基團修飾；所述引物序列中Y = (C/T)、R = (A/G)。
10.根據(jù)權利要求9所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測引物和探針、其特征在于，其中，熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修飾的熒光染料選自=TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。
全文摘要
本發(fā)明公開了乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測試劑盒、檢測方法、引物及其探針。本試劑盒包括熒光定量PCR反應液，其中包括DEPC處理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×熒光定量PCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、rt204位點正向引物、rt204位點反向引物、rt204M位點探針、rt204I位點探針、rt204V位點探針、rt180位點正向引物、rt180位點反向引物和rt180L位點探針、rt180M位點探針；試劑盒中還包括DNA提取液、陰性質(zhì)控品、工作標準品、陽性質(zhì)控品和臨界陽性質(zhì)控品。本發(fā)明采用實時熒光定量PCR技術定量檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥毒株，熒光定量PCR方法改進為“2步法”，避免了PCR延伸的步驟；探針可以標記多種熒光標記，同時還具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102251059SQ20111019423
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權日2011年7月12日
發(fā)明者劉緒, 唐景峰, 王業(yè)富 申請人:武漢百泰基因工程有限公司