專(zhuān)利名稱(chēng)：乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、引物及其探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及本生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、引物及其探針。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒能引起人體的慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌，抗病毒治療是治療乙型肝炎病毒的主要措施；核苷類(lèi)似物是最常見(jiàn)的治療乙肝病毒藥物，阿德福韋酯作為一種新型的核苷類(lèi)抗乙肝病毒藥物，于2005年在我國(guó)進(jìn)入臨床治療。阿德福韋酯還是一種很好的拉米夫定治療無(wú)效補(bǔ)救藥，其可以抑制乙肝病毒多聚酶或競(jìng)爭(zhēng)性參與乙肝病毒的復(fù)制，從而中止乙肝病毒DNA鏈的延長(zhǎng)；然而由于cccDNA的存在，乙肝的治愈是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，隨著乙肝患者服藥時(shí)間的延長(zhǎng)，很多患者會(huì)出現(xiàn)乙肝病毒反彈和肝病加重等耐藥癥狀， 病毒的耐藥嚴(yán)重影響著后續(xù)抗病毒治療的療效。大量研究表明，乙肝病毒阿德福韋酯耐藥株的耐藥位點(diǎn)主要位于乙肝病毒P基因B區(qū)的rtA181V/T位點(diǎn)或D區(qū)的rtN236T位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的變異顯著的導(dǎo)致對(duì)阿德福韋酯的敏感性下降；由于乙肝病毒對(duì)阿德福韋酯耐藥與拉米夫定等藥物耐藥有著不同的耐藥機(jī)制，所以，對(duì)阿德福韋酯耐藥患者進(jìn)行耐藥突變株檢測(cè)確證，從而提供針對(duì)性個(gè)性化的藥物治療方案有著十分重要的意義。目前基因型的耐藥檢測(cè)已經(jīng)是核苷(酸)類(lèi)似物抗病毒治療的常規(guī)檢測(cè)手段。 目前已報(bào)道的檢測(cè)乙肝病毒耐阿德福韋酯突變株的方法包括直接測(cè)序法、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP)、基因芯片，焦磷酸測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等方法，這些方法各有利弊，并且有些檢測(cè)方法的弊端暫時(shí)還沒(méi)有較好的解決辦法。1、直接測(cè)序法DNA直接測(cè)序法一直被認(rèn)為是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，直接測(cè)序包括PCR產(chǎn)物直接測(cè)序與克隆測(cè)序，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序是將乙肝病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)直接擴(kuò)增后測(cè)序分析的方法，該方法能測(cè)定各種突變，并能夠發(fā)現(xiàn)可能的未知耐藥變異位點(diǎn)，也是最常用的基因型耐藥檢測(cè)方法之一。但直接PCR測(cè)序?qū)τ谏倭磕退幫蛔冎甑臋z測(cè)敏感性較差，只有當(dāng)耐藥突變株達(dá)到病毒準(zhǔn)種的20% -30%以上時(shí)才能被檢測(cè)到?？寺y(cè)序即將PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后連接載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，挑取單克隆菌落克隆進(jìn)行測(cè)序分析，這種方法雖然靈敏度高，但克隆測(cè)序繁瑣且價(jià)格昂貴，也不適用于大規(guī)模篩選。2、PCR和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)PCR-RFLP法是最早用于核苷類(lèi)似物的耐藥檢測(cè)的方法之一。RFLP技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶專(zhuān)一性識(shí)別并切割DNA序列的特點(diǎn)，不同的序列就會(huì)被切割成長(zhǎng)短不一的DNA 片斷，再通過(guò)凝膠電泳觀察酶切結(jié)果，然后對(duì)酶切圖像進(jìn)行多態(tài)性分析找出差異，PCR-RFLP 法經(jīng)濟(jì)且簡(jiǎn)便快速，具有較強(qiáng)的靈敏性，能檢測(cè)出在病毒總體中大于5%的突變株，曾廣泛用于檢測(cè)乙肝病毒拉米夫定的耐藥突變，閏杰等(2008)使用該技術(shù)能很好的檢測(cè)乙肝病毒的阿德福韋酯耐藥突變株。然而PCR-RFLP的缺陷也是很明顯的，該方法沒(méi)法檢測(cè)未知的突變位點(diǎn)，對(duì)于每一個(gè)可能的突變，必須特別設(shè)計(jì)單獨(dú)的核酸內(nèi)切酶，然而某些突變的特異性內(nèi)切酶可能并不存在，且該方法對(duì)多位點(diǎn)聯(lián)合突變可能無(wú)能為力。Hong等將這種技術(shù)MALDI-TOF MS結(jié)合，從而開(kāi)發(fā)出限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性 (RFMP)的方法，即利用MALDI-TOF MS技術(shù)來(lái)檢測(cè)PCR-RFLP酶切后的產(chǎn)物，該方法比普通的凝膠電泳有更高的靈敏度、準(zhǔn)確度和分辨率。Kim等報(bào)道該方法用于拉米夫定YMDD位點(diǎn)耐藥檢測(cè)，最低可檢測(cè)出的耐藥病毒。RFMP的方法雖然比PCR-RFLP靈敏度高，但它還是基于PCR-RFLP的，所以具有PCR-RFLP —樣的缺點(diǎn)，且價(jià)格昂貴，很難在臨床推廣應(yīng)用。3、基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，固體芯片表面按一定的陣列集成了大量的特異目標(biāo)探針，能與待測(cè)的有熒光標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)堿基互補(bǔ)雜交反應(yīng)，通過(guò)激光共聚焦系統(tǒng)檢測(cè)到雜交信號(hào)，數(shù)據(jù)通過(guò)處理獲取基因的序列信息。基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因突變的檢測(cè)，且檢測(cè)精度很高，對(duì)于檢測(cè)耐藥乙肝病毒是可靠和有用的一種工具；目前已經(jīng)有通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒拉米夫定耐藥的報(bào)道，但目前尚無(wú)基因芯片方法檢測(cè)ADV耐藥的報(bào)道。生物芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法相比具有高通量、微型化、自動(dòng)化、成本低等特點(diǎn)，其缺點(diǎn)是費(fèi)用很高，數(shù)據(jù)可能需要專(zhuān)業(yè)的生物信息學(xué)人員分析，只能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn)，檢測(cè)低拷貝乙肝病毒不夠靈敏等。4、焦磷酸測(cè)序技術(shù)焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一種新興的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，由Nyren等人于1987年發(fā)明， 該技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在初始的反應(yīng)體系中不含有四種dNTP，當(dāng)特異性引物引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與聚合的dNTP個(gè)數(shù)成正比，反應(yīng)所剩余的dNTP可被三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，從而達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。焦磷酸測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，遺傳多態(tài)性分析，分子診斷與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定等方面有這很好的應(yīng)用價(jià)值。焦磷酸測(cè)序技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，該方法對(duì)待測(cè)樣品的制備和處理比Sanger測(cè)序法要簡(jiǎn)單更快速，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)。Lindstrom等報(bào)道采用焦磷酸測(cè)序法來(lái)檢測(cè)拉米夫定耐藥，最低可檢出10%變異病毒。宋家武等(2005)應(yīng)用該技術(shù)建立了高通量測(cè)定乙型肝炎病毒YMDD突變區(qū)的方法，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的突變檢出率及重復(fù)率均達(dá)100%，而血清標(biāo)本達(dá)98. 8%?？梢?jiàn)， 該技術(shù)還有高精度的特點(diǎn)。但由于焦磷酸測(cè)序技術(shù)一次僅能精確檢測(cè)大約40bp的堿基，故并不能代替常規(guī)的測(cè)序技術(shù)，且該技術(shù)的成本要高于Sanger測(cè)序法，針對(duì)不同變異位點(diǎn)還要設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異引物方能檢測(cè)等缺點(diǎn)；目前尚無(wú)焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)ADV耐藥的報(bào)道?，F(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有一種熒光定量PCR檢測(cè)乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有高度的特異性、 靈敏度與準(zhǔn)確性、且技術(shù)操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高的乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有(1)熒光定量PCR反應(yīng)液其中包括DEPC處理水、具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10X熒光定量PCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、rtl81位點(diǎn)正向引物、rtl81位點(diǎn)反向引物、rtl81A 位點(diǎn)探針、rtl81V位點(diǎn)探針、rtl81T位點(diǎn)探針、rtN236T檢測(cè)試劑盒特有的rt236位點(diǎn)正向引物、rt236位點(diǎn)反向引物、rt236N位點(diǎn)探針和rt236T位點(diǎn)探針；①181位點(diǎn)引物和探針rtl81位點(diǎn)正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5' TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3'rtl81位點(diǎn)反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3'rtl81A 探針序列如序列表中 SEQ ID 而.3所示5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3'rtl81V 探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 4 所示5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3'rtl81T 探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 5 所示5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3'②236位點(diǎn)引物和探針rt236位點(diǎn)正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示5' TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3'rt236位點(diǎn)反向引物序列如序列表中SEQ ID N0. 7所示5' CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3'rt236N 探針序列如序列表中 SEQ ID N0. 8 所示5' ATACATTTRAACCC 3'rt236T 探針序列如序列表中 SEQ ID N0. 9 所示5' ATACATTTRACCCC 3'；其中，上述探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中，Y = (C/ T)，R = (A/G)，H = A/T/C ；(2) DNA 提取液①溶液A，為聚乙二醇6000 ；②溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris_HCl、 NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；(3)質(zhì)控品①陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS載體質(zhì)粒DNA片段；②陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtl81 時(shí)，為 1. 0 X 106copy/mL 的含有 rtl81A/rtl81V/rtl81T 相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rt236時(shí)，為1. 0 X 106copy/mL的含有rt236N/rt236T相應(yīng)基因組的DNA片段；③臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtl81時(shí)，為1. 0X 104copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/ rtl81T相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rt236時(shí)，為1. 0 X 104copy/mL的含有rt236N/rt236T 相應(yīng)基因組的DNA片段；(4)工作標(biāo) 準(zhǔn)品檢測(cè)rtl81時(shí)，為PSG_TSrtl81的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rtl81A/rtl81V/rtl81T區(qū)間的162個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測(cè)rt236時(shí)，為PSG-TS rt236的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt236N/rt236T區(qū)間的153個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；該2個(gè)重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖。具體包括a、工作標(biāo)準(zhǔn)品 1，為 1. OX 107copy/mL 的 PSG-TS rtl81 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X107copy/mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液；b、工作標(biāo)準(zhǔn)品 2，為 1. 0X106copy/mL 的 PSG_TSrtl81 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液；c、工作標(biāo)準(zhǔn)品 3，為 1. OX 105copy/mL 的 PSG-TS rtl81 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液；d、工作標(biāo)準(zhǔn)品 4，為 1. OX 104copy/mL 的 PSG-TS rtl81 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液。其中熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修飾的熒光染料選自=TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。所述DNA提取液由溶液A和溶液B組成；
所述溶液A，為聚乙二醇6000 ；所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。所述具有5’ 一 3’外切活性的DNA聚合酶為T(mén)aq酶。所述熒光定量PCR反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. 5 μ L ；濃度為5U/ μ L的熱啟動(dòng)Taq酶用量0. 3 μ L ；濃度為lOmmol/L的dNTPs用量1 μ L ;10X熒光定量PCR Buffer用量5 μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L，濃度為10 μ mol/L的正向引物用量1.6yL、濃度為10 μ mol/L的反向引物用量1.6yL、濃度為10 μ mol/L的探針用量lyL。其中檢測(cè)rtA181V/T時(shí)，PCR反應(yīng)液中包含的引物為rtl81位點(diǎn)正向引物和 rtl81位點(diǎn)反向引物，探針為rtl81A位點(diǎn)探針、rtl81V位點(diǎn)探針和rtl81T位點(diǎn)探針；檢測(cè) rtN236T時(shí)，PCR反應(yīng)液中包含的引物為rt236位點(diǎn)正向引物和rt236位點(diǎn)反向引物，探針為rt236N位點(diǎn)探針和rt236T位點(diǎn)探針；所述聚乙二醇6000的濃度為15% ；所述乙二胺四乙酸濃度為0.5% ；所述 Tris-HCl的pH值為8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的濃度為0. 1%。本發(fā)明實(shí)施例還提供利用所述的試劑盒檢測(cè)乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸的檢測(cè)方法，包括下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測(cè)血清100 μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm離心 IOmin,去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加熱lOmin，13000rpm再離心 lOmin，取上清液待測(cè)；(3)加樣向裝有45μ L熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的樣品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、工作標(biāo)準(zhǔn)品各5 μ L，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心10秒；(4)熒光定量PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(lèi)、樣品名稱(chēng)及類(lèi)型，按下列條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；94 "C 5 分 鐘；94 °C 30 秒，58 °C 45 秒，5 個(gè)循環(huán)；940C 30秒，58°C 45秒，35個(gè)循環(huán)；收集熒光信號(hào)，在反應(yīng)程序的第二步的終了讀取熒光Ct值；(5)分析判斷Ct值小于28的為陽(yáng)性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于 28且小于或等于32的為臨界陽(yáng)性。進(jìn)一步地，當(dāng)需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，另取4個(gè)反應(yīng)管，直接加入不同濃度梯度的工作標(biāo)準(zhǔn)品5 μ L，5000rpm離心10秒，放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。本發(fā)明還提供一種乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)引物和探針，包括下述正向引物、反向引物和熒光探針的一組序列r1181 位點(diǎn)正向引物5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘rtl81 位點(diǎn)反向引物5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3‘rtl81A 探針序列5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3'rtl81V 探針序列5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3'rtl81T 探針序列5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3'rt236 位點(diǎn)正向引物5' TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3‘rt236 位點(diǎn)反向引物5' CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3‘rt236N 探針序列5' ATACATTTRAACCC 3'rt236T 探針序列5' ATACATTTRACCCC 3'；或者在上述序列的5'端和/或3'端有延長(zhǎng)的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)的一組序列；上述的任意一組序列可單獨(dú)使用，或以所有序列組之間的任意組合形式而使用；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中Y = (C/T)，R = (A/G)，H = A/T/C。其中，熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修飾的熒光染料選自=TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是本發(fā)明試劑盒利用特異性的 TaqMan探針來(lái)檢測(cè)乙型肝炎病毒，檢測(cè)完成后無(wú)需開(kāi)蓋電泳，避免了產(chǎn)物污染及對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的傷害。本發(fā)明可用LNA探針、MGB探針、AllGlo 探針來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)檢測(cè)克服了擴(kuò)增產(chǎn)物終點(diǎn)檢測(cè)所存在的“平臺(tái)效應(yīng)”對(duì)產(chǎn)物定量的影響；本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)阿德福韋酯耐藥毒株，試劑盒可以單用和多重檢測(cè)乙肝病人的阿德福韋酯耐藥情況，熒光定量PCR方法改進(jìn)為“2步法”，避免了常規(guī)PCR延伸的步驟、探針可以標(biāo)記多種熒光標(biāo)記，同時(shí)還具有特異、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。且技術(shù)操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高； 由于采用閉管操作，不需要PCR產(chǎn)物后處理，有效解決PCR污染問(wèn)題等特點(diǎn)，結(jié)果可靠。



圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的阿德福韋酯耐藥位點(diǎn)rtl81熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的阿德福韋酯耐藥位點(diǎn)rt236 二重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3A、圖3B、圖3C、圖3D、圖3E和圖3F是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rtl81重組質(zhì)粒倍比稀釋擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果圖；圖4A、圖4B、圖4C和圖4D是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rt236 重組質(zhì)粒倍比稀釋擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果圖；圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E和圖5F是本發(fā)明實(shí)施例2中提供的阿德福韋酯耐藥位點(diǎn)rtl81位點(diǎn)181A/181V/181T分別檢測(cè)樣本的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖6A、圖6B、圖6C和圖6D是本發(fā)明實(shí)施例2中提供的阿德福韋酯耐藥位點(diǎn)rt236 位點(diǎn)236N/236T分別檢測(cè)樣本的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖1、圖2、圖3A、圖3C、圖3E、圖4A、圖4C、圖5A、圖5C、圖5E、圖6A和圖6C中的橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)(Cycle number)、縱坐標(biāo)表示熒光值(Delta Rn)；圖3B、圖3D、圖3F、圖4B、圖4D、圖5B、圖5D、圖5F、圖6B和圖6D中橫坐標(biāo)表示 LogCo (乙肝病毒起始濃度的對(duì)數(shù)值)、縱坐標(biāo)表示Ct值。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有熒光定量PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、Taq酶、dNTPsUOX熒光定量PCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、正向引物、反向引物、探針；溶液A，為聚乙二醇6000 ；溶液 B，其中包括 EDTA、SDS、Tris-HCl, NP-40 ；陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè) rtl81 時(shí)，為 1. OX 106copy/mL 的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rt236時(shí)，為1. OX IO6Copy/ mL的含有rt236N/rt236T相應(yīng)基因組的DNA片段；臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rt 181時(shí)，為 1.0X 104copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rt236時(shí)，為 1.0X104copy/mL的含有rt236N/rt236T相應(yīng)基因組的DNA片段；工作標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)rtl81 的工作標(biāo)準(zhǔn)品為PSG-TSrtl81的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了為乙型肝炎病毒基因組中含有rtl81A/rtl81V/rtl81T區(qū)間的162個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測(cè)Rt236的工作標(biāo)準(zhǔn)品為PSG-TS rt236的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了為乙型肝炎病毒基因組中含有rt236N/rt236T區(qū)間的153個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；該2個(gè)重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖。試劑盒的制造
1.試劑本試劑盒制造過(guò)程中所用的試劑主要購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。2.熒光定量PCR反應(yīng)液制備(1)引物及探針設(shè)計(jì)與合成選擇乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的P基因的特異突變位點(diǎn)區(qū)域片段作為目標(biāo)檢測(cè)基因，通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，獲得乙型肝炎病毒目前已有的8個(gè)基因型的乙型肝炎病毒耐藥突變位點(diǎn)的基因序列，并通過(guò) VectorNTIAdvance 11軟件分別對(duì)8個(gè)基因型的相應(yīng)耐藥突變位點(diǎn)區(qū)間進(jìn)行序列比對(duì)，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針。rtl81A序列如序列表中SEQ ID NO. 10所示GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTC CTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTT CCCCCACTGTTTGGCTTTrtl81V序列如序列表中SEQ ID NO. 11所示GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTC CTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTT CCCCCACTGTTTGGCTTTrtl81T序列如序列表中SEQ ID NO. 12所示GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTC CTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGACTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTT CCCCCACTGTTTGGCTTTrt236N序列如序列表中SEQ ID NO. 13所示TTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTATCTTT GGGTATACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGTTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGT TGGGGTACTrt236T序列如序列表中SEQ ID N0. 14所示TTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTATCTTT GGGTATACATTTAACCCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGTTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGT TGG GGTACT利用實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR的專(zhuān)業(yè)設(shè)計(jì)軟件Primer Express 3.0設(shè)計(jì)引物、探針序列，引物、探針序列不僅要滿足軟件中各項(xiàng)指標(biāo)，而且要確保引物、探針序列能檢測(cè)全部8個(gè)基因型序列。在本發(fā)明中，探針的5，端修飾的熒光染料可選自FAM，HEX，TET，J0E， VIC, ROX, Cy3, Cy5, MAR, JUP, SAT, PLU, NEP 或 URA ；3’ 端修飾的熒光染料可選自TAMRA、 Eclipse, BHQl, BHQ2, BHQ3 或 DABCYL 等。設(shè)計(jì)結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有(1)熒光定量PCR反應(yīng)液其中包括DEPC處理水、具有5，一3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOX熒光定量 PCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、rtl81位點(diǎn)正向引物、rtl81位點(diǎn)反向引物、rtl81A位點(diǎn)探針、rtl81V位點(diǎn)探針、rtl81T位點(diǎn)探針、rtN236T檢測(cè)試劑盒特有的rt236位點(diǎn)正向引物、rt236位點(diǎn)反向引物、rt236N位點(diǎn)探針和rt236T位點(diǎn)探針；①181位點(diǎn)引物和探針r1181 位點(diǎn)正向引物5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘ r1181 位點(diǎn)反向引物5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA3 ‘ rtl81A 探針序列5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3' rtl81V 探針序列5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3' rtl81T 探針序列5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3'②236位點(diǎn)引物和探針rt236 位點(diǎn)正向引物5‘ TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3‘ rt236 位點(diǎn)反向引物5 ‘ CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3 ‘ rt236N 探針序列5, ATACATTTRAACCC 3' rt236T 探針序列5' ATACATTTRACCCC 3'；其中，上述探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中，Y = (C/T), R =(A/G)，H = A/T/C (2)DNA提取液①溶液A，為聚乙二醇6000；②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。(3)質(zhì)控品①陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS載體質(zhì)粒DNA；②陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtl81時(shí)，為1.0X106copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rt236時(shí)，為1. 0 X 106copy/mL的含有rt236N/rt236T相應(yīng)基因組的DNA片段；③臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtl81時(shí)，為1.0 X 104copy/mL的含有rtl81A/rtl81V/rtl81T 相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rt236時(shí)，為1. 0 X 104copy/mL的含有rt236N/rt236T相應(yīng)基因組的DNA片段；(4)工作標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)rtl81時(shí)，為PSG-TS rtl81的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rtl81A/rtl81V/rtl81T區(qū)間的162個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測(cè)rt236時(shí)，為PSG-TS rt236的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt236N/rt236T區(qū)間的153個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；該2個(gè)重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中熒光探針的5’端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修飾的熒光·染科遠(yuǎn)目:TAMKA> Eclipse^ BHQU BHQ2> BHQ3 M DABCYLo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述DNA提取液由溶液A和溶液B組成；所述溶液A，為聚乙ニ醇6000 ；所述溶液B，其中包括乙ニ胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl和乙基苯基聚乙ニ醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括a、工作標(biāo)準(zhǔn)品1，為 1.0 X IO7CopバmL 的 PSG-TS rtl81 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0 X IO7Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液；b、工作標(biāo)準(zhǔn)品2，為 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TSrt 181 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO6Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液；C、工作標(biāo)準(zhǔn)品 3，為 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TSrt 181 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO5Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液；d、工作標(biāo)準(zhǔn)品 4，為 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rtl81 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO4Copy/ mL 的 PSG-TS rt236 質(zhì)粒 DNA 溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述具有5’一3’外切活性的DNA聚合 酶為T(mén)aq酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在干，所述熒光定量PCR反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. L ；濃度為5U/ U L的熱啟動(dòng)Taq酶用量0. 3 y L ；濃度為lOmmol/L的dNIPs用量1 y L ； 10X熒光定量PCR Buffer用量5 ii L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 y L，濃度為10iimol/L的正向引 物用量1.6iiL、濃度為lOiimol/L的反向引物用量1.6iiL、濃度為lOiimol/L的探針用量 1 U L0
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在干，所述聚乙ニ醇6000的濃度為15%;所述乙ニ胺四乙酸濃度為0. 5%;所述Tris-HCl的 PH值為8. O ；所述乙基苯基聚乙ニ醇的濃度為0. 1%。
8.ー種利用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核 酸的檢測(cè)方法，其特征在干，包括下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測(cè)血清IOOiiL,加入等量15%溶液A，混勻，13000rpm離心lOmin， 去上清，加入50 ii L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加熱10min，13000rpm再離心lOmin， 取上清液待測(cè)；(3)加樣向裝有45y L熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的樣品、 陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、工作標(biāo)準(zhǔn)品各5 yL，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心 10秒；(4)熒光定量PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標(biāo)記熒光 基團(tuán)種類(lèi)、樣品名稱(chēng)及類(lèi)型，按下列條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；·94 °C 5分鐘；940C 30 秒，58°C 45 秒，5 個(gè)循環(huán)；94°C 30秒，58°C 45秒，35個(gè)循環(huán)；收集熒光信號(hào)，在反應(yīng)程序的第二步的終了讀取熒光Ct值；(5)分析判斷Ct值小于28的為陽(yáng)性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的為臨界陽(yáng)性。
9.一種乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)引物和探針，包括下述正向引物、 反向引物和熒光探針的一組序列r1181 位點(diǎn)正向引物5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘ r1181 位點(diǎn)反向引物5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3 ‘ rtl81A 探針序列5' TTCTCHTGGCTCAGTTT 3' rtl81V 探針序列5' TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3' rtl81T 探針序列5' TTCTCHTGACTCAGTTTA 3' rt236 位點(diǎn)正向引物5‘ TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3‘ rt236 位點(diǎn)反向引物5 ‘ CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3 ‘ rt236N 探針序列5, ATACATTTRAACCC 3' rt236T 探針序列5' ATACATTTRACCCC 3'；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長(zhǎng)的核苷酸片段的一組序列； 或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)的一組序列；上述的任意一組序列可單獨(dú)使用，或以所有序列組之間的任意組合形式而使用； 其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中Y = (C/T)， R = (A/G)，H = A/T/C。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)引物和探針， 其特征在于，其中，熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX、 〇又3丄75、嫩1 、貝？、541\ 1^或陬？ ；3，端修飾的熒光染料選自TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、引物及其探針。該試劑盒含有熒光定量PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×熒光定量PCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、rt181位點(diǎn)正向引物、rt181位點(diǎn)反向引物、rt181A位點(diǎn)探針、rt181V位點(diǎn)探針、rt181T位點(diǎn)探針、rtN236T檢測(cè)試劑盒特有的rt236位點(diǎn)正向引物、rt236位點(diǎn)反向引物、rt236N位點(diǎn)和rt236T位點(diǎn)探針；試劑盒中還包括DNA提取液、陰性質(zhì)控品、工作標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性質(zhì)控品和臨界陽(yáng)性質(zhì)控品。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥毒株，熒光定量PCR方法避免了PCR延伸的步驟；探針可以標(biāo)記多種熒光標(biāo)記，同時(shí)還具有特異、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102304589SQ20111019427
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者劉緒, 唐景峰, 王業(yè)富 申請(qǐng)人:武漢百泰基因工程有限公司