專利名稱：靶向人血管緊張素原的rna干擾片段、表達(dá)載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA干擾片段及應(yīng)用領(lǐng)域，具體是涉及靶向人血管緊張素原 (angiotensinogen，AGT)的RNA干擾片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肥胖是人類非常常見(jiàn)的病癥，肥胖者體內(nèi)脂肪細(xì)胞含量高出正常水平較多。而現(xiàn)有減肥的主要方向是降低體內(nèi)脂肪含量。若能通過(guò)基因手段，抑制脂肪細(xì)胞的形成，則將有效抵制肥胖的形成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供靶向人血管緊張素原的RNA干擾片段，以抑制人前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，從而抑制肥胖的形成。本發(fā)明進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種針對(duì)人血管緊張素原的RNAi片段構(gòu)建的表達(dá)載體。本發(fā)明進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種上述RNA干擾序列及其表達(dá)載體的應(yīng)用，以抵制肥胖的形成。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種針對(duì)人前脂肪細(xì)胞內(nèi)血管緊張素原的RNA干擾片段，其具有以下任一序列
Rl:TCCTGGGTGTTCCTTGGAA R2 :CTGGATGTTGCTGCTGAGA。又一方面，本發(fā)明還提供一種RNA干擾片段的表達(dá)載體，該表達(dá)載體具有如上所述的RNA干擾片段。進(jìn)一步地，該表達(dá)載體具有SEQ ID NO 1或2所示的序列。另一方面，本發(fā)明還提供以上任一項(xiàng)在抑制肥胖中的應(yīng)用，利用所述RNA干擾片段抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，從而降低脂肪細(xì)胞含量，抑制肥胖形成。本發(fā)明的有益效果如下經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的二種干擾質(zhì)粒都能降低 ΗΡΑ-ν細(xì)胞中人血管緊張素原的表達(dá)，各干擾減低人血管緊張素原mRNA表達(dá)量約35%以上，蛋白水平表達(dá)量約47. 6%。同時(shí)脂肪細(xì)胞分化程度降低，這表明針對(duì)人血管緊張素原的 RNAi序列能夠抑制脂肪細(xì)胞的分化，可抑制脂肪的形成。因此本發(fā)明所涉及的干擾片段及表達(dá)載體可用于抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，降低脂肪細(xì)胞含量，抑制肥胖形成的用途。


圖IA 圖IC分別是本發(fā)明構(gòu)建的三個(gè)重組表達(dá)載體rai、ra2、PRO的示意圖。圖2分別是本發(fā)明的rai、PR2的RNAi表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果圖，圖中，曲線1、2、3、4 分別代表堿基G、C、T、A。
圖3是本發(fā)明的定量PCR擴(kuò)增圖。圖4為本發(fā)明抑制脂肪細(xì)胞AGT表達(dá)的電泳檢測(cè)結(jié)果。圖5至圖7顯示本發(fā)明抑制脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)結(jié)果。圖8是ΗΡΑ-ν轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后分化過(guò)程中脂質(zhì)含量的變化曲線圖。圖9是本發(fā)明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對(duì)人前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中GPDH活性的影響對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例并參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)該理解的是，以下所述的實(shí)施例僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例一 RNAi片段的設(shè)計(jì)
從國(guó)際開(kāi)發(fā)共享基因庫(kù)(NCBI Genebank)中查找出人AGTmRNA序列(基因ID匪 0000 )。然后，再根據(jù)Tuschl和Reynolds等提出的siRNA設(shè)計(jì)原則，并且借助于Ambion公司所提供的在線 siRNA設(shè)計(jì)軟件 siRNA Target f inder(http //www. ambion. com/techlib/ misc/siRNAfinder. htmL)來(lái)確定靶序列，篩選2條19bp長(zhǎng)的靶序列，分別為Rl，R2。為避免 siRNA非特異性抑制同源性較高的其它基因，利用BLAST軟件(http//www. ncbinlm. nih. gov/blast)，對(duì)備選靶序列同源性分析，確保無(wú)非特異性沉默。此外，還設(shè)計(jì)一條不針對(duì)任何基因的19bp的序列R0，作為陰性對(duì)照。三條序列具體如下 Rl:TCCTGGGTGTTCCTTGGAA R2 CTGGATGTTGCTGCTGAGA RO :ACGCTGAGTACTTCGAAAT
以上三條序列均送由生工生物工程(上海)有限公司合成。實(shí)施例二 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建
以設(shè)計(jì)好的三條序列為基礎(chǔ)，分別設(shè)計(jì)出與之互補(bǔ)的反向序列，正向與反向序列之間用LOOP環(huán)(CCACC)連接，序列兩端加上與Bbs I酶切PsiRNA-hHlneo環(huán)狀質(zhì)?；パa(bǔ)堿基。 該序列折疊時(shí)除LOOP段外，其余部分都可以形成互補(bǔ)的雙鏈RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，確保每條單鏈分別包括Kds I酶切后粘性末端的互補(bǔ)堿基、19個(gè)堿基靶序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)(CCACC)、靶序列的互補(bǔ)序列、Bbs I酶切后粘性末端的互補(bǔ)堿基5個(gè)區(qū)域。表1插入PsiRNA-hHlneo線性載體的寡聚核苷酸片段
由上海生工按現(xiàn)有工藝合成的寡聚核苷酸單鏈，用水溶解到25 μ mol/L，再在85°C退火5S成雙鏈。PsiRNA-hHlneo載體經(jīng)m^s I酶切成線性載體，再經(jīng)T4連接酶與雙鏈RNAi 片段連接，分別構(gòu)建成rai、ra2、PR0三種載體，三種載體的結(jié)構(gòu)分別如圖 Α 圖ic所示。 而PRl寡聚核苷酸片段、PR2寡聚核苷酸片段(圖中分別以虛線框標(biāo)示出來(lái))的測(cè)序結(jié)果分別如圖2中A、B所示，測(cè)序序列與設(shè)計(jì)序列同源性達(dá)到100%。
實(shí)施例三轉(zhuǎn)染人前脂肪細(xì)胞，并建立混合克隆株1. 轉(zhuǎn)染將人前脂肪細(xì)胞ΗΡΑ-ν (購(gòu)自ScienCell Research Laboratories)按照 6 X IO4個(gè)/孔接種于M孔板中，37°C，5%0)2用10%FCS+ DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，到細(xì)胞匯合至 80%,更換無(wú)抗生素?zé)o血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。再利用Lipof ectamine 2000試劑，將各組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入ΗΡΑ-ν人前脂肪細(xì)胞株中。具體轉(zhuǎn)染方法用50 μ L Opti-MEM稀釋Iyg 質(zhì)粒并混勻，再用50 μ L Opti-MEM稀釋的2 μ L Lipofectamine2000并混勻，被稀釋的質(zhì)粒與Lipofectamine2000再輕輕混勻后室溫靜置20min，每孔加100 μ L混合液，左右輕輕震蕩培養(yǎng)板，使其與ΗΡΑ-ν充分并均勻接觸。5%C02，37°C培養(yǎng)。6小時(shí)后更換無(wú)抗生素 10%FCS+DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1天。2.建立混合克隆細(xì)胞株為了排除未轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細(xì)胞的影響，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后， 加入含800yg/mL G418進(jìn)行篩選，約兩周后建立混合克隆細(xì)胞株。進(jìn)一步提取細(xì)胞RNA進(jìn)行分析，保證RNA的純度。實(shí)施例四干擾效果檢測(cè) 1.在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)AGT沉默效果
轉(zhuǎn)染后48 h后，分別取轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒和沉默質(zhì)粒的ΗΡΑ-ν人前脂肪細(xì)胞株，據(jù)TRIZOL 提取方法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，以β -actin作為對(duì)照，檢測(cè)轉(zhuǎn)染沉默質(zhì)粒后， AGT在轉(zhuǎn)錄水平上的沉默效率。提取總RNA 提取應(yīng)用PR1、PR2、PR0轉(zhuǎn)染后建立的混合HPA_v細(xì)胞克隆中的RNA， 步驟參考hvitrogene公司RNA提取試劑盒說(shuō)明。逆轉(zhuǎn)錄將不同時(shí)段提取出的ΗΡΑ-ν前脂肪細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照表2的反應(yīng)體系加樣(在冰上配置RT反應(yīng)液)。表2 RT反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種靶向人血管緊張素原的RNA干擾片段，其特征在于，具有以下任一序列 Rl:TCCTGGGTGTTCCTTGGAAR2 :CTGGATGTTGCTGCTGAGA。
2.—種RNA干擾片段的表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體具有如權(quán)利要求1所述的 RNA干擾片段。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體具有SEQID N0:1或2所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任一項(xiàng)在抑制肥胖中的應(yīng)用，其特征在于，利用所述RNA干擾片段抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，從而降低脂肪細(xì)胞含量，抑制肥胖形成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)人前脂肪細(xì)胞內(nèi)血管緊張素原的RNA干擾片段，其序列為R1TCCTGGGTGTTCCTTGGAA或R2CTGGATGTTGCTGCTGAGA。本發(fā)明還提供一種上述RNA干擾片段的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供利用所述RNA干擾片段抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，從而降低脂肪細(xì)胞含量，抑制肥胖形成的應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的干擾質(zhì)粒能降低HPA-v細(xì)胞中人血管緊張素原的表達(dá)，各干擾減低人血管緊張素原mRNA表達(dá)量約35%以上，蛋白水平表達(dá)量約47.6%。同時(shí)脂肪細(xì)胞分化程度降低，這表明針對(duì)人血管緊張素原的RNAi序列能夠抑制脂肪細(xì)胞的分化，可抑制脂肪的形成，降低脂肪細(xì)胞含量，抑制肥胖形成的用途。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102260673SQ20111019458
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者伍麗華, 吳曉明, 張麗君, 黃志立 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院