專利名稱：氣單胞菌除藻劑及其去除藍(lán)藻水華的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氣單胞菌發(fā)酵制備的除藻劑及其去除水華藍(lán)藻的應(yīng)用，屬于生物環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前我國很多淡水水體呈現(xiàn)嚴(yán)峻的富營養(yǎng)化態(tài)勢(shì)，水華的頻發(fā)嚴(yán)重影響了水體水質(zhì)，對(duì)于源水會(huì)大大增加飲用水處理的難度，同時(shí)還會(huì)威脅到人類的健康，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)危害。水華治理的物理方法是利用某些設(shè)備、器材在水體中設(shè)置特定的安全隔離區(qū)，分離水華水體中的水華藻類或利用機(jī)械裝置來進(jìn)行除藻的方法，如直接過濾、氣浮除藻、圍隔柵欄、超聲波法、光隔離法等，這些方法不引進(jìn)二次污染，但其投入的成本較高且不適于大面積操作。水華治理的化學(xué)方法是利用化學(xué)產(chǎn)品或者礦物質(zhì)來抑制、殺死或去除水華生物的方法?；瘜W(xué)方法是目前采用最多、發(fā)展最快的一類方法，歸納起來分為三大類直接滅殺法、絮凝劑沉淀法和天然礦物絮凝法?；瘜W(xué)法具有相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠大面積操作等優(yōu)點(diǎn)，但多數(shù)除藻劑除藻效果不徹底，且對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響，成本較高。由于物理與化學(xué)除藻方法存在水處理成本較高、容易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物導(dǎo)致水體二次污染等原因而限制了它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中的廣泛性，近年來對(duì)環(huán)境友好的生物控藻法受到越來越多的關(guān)注。 細(xì)菌溶藻技術(shù)作為一種有效的控藻技術(shù)，引起了國內(nèi)外廣泛的關(guān)注。細(xì)菌的溶藻方式主要分為兩類①直接溶藻，即細(xì)菌與藻細(xì)胞直接接觸，甚至侵入藻細(xì)胞內(nèi)從而溶藻；②間接溶藻，即細(xì)菌通過分泌某種代謝產(chǎn)物溶解藻類或通過營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)從而抑制藻類的生長，其中，通過胞外分泌物溶藻的方式較為多見。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服物理和化學(xué)辦法控制水華中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種生物來源的除藻劑及其制備方法，以及利用該除藻劑消除藍(lán)藻水華的方法，該技術(shù)不但能有效控制藍(lán)藻水華，而且成本低、操作簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境不構(gòu)成危害。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明使用的氣單胞菌的菌種分類命名為Aeromonas sp. DS-1，保藏編號(hào)為 CCTCCNo :M2011180，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武昌珞珈山，郵編430072 ；保藏日期為2011年5月23日。本發(fā)明所述Aeromonas sp. DS-1菌種是從天然淡水水體中分離獲得的分泌溶藻物質(zhì)的細(xì)菌，經(jīng)鑒定，該菌株為氣單胞菌Aeromonas sp.，命名為Aeromonas sp.DS-Ι。篩選方法為將天然淡水水樣接種到牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，然后將所得培養(yǎng)物在牛肉膏蛋白胨平板上進(jìn)行劃線分離，得到單一菌落，再將單一菌落分別在牛肉膏蛋白胨平板上擴(kuò)大培養(yǎng)，最后將平板培養(yǎng)物接種到含淡水藍(lán)藻的培養(yǎng)液中進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)，篩選出能夠抑制銅綠微囊藻、魚腥藻生長的細(xì)菌菌株Aeromonas sp. DS-I。一種氣單胞菌除藻劑，是由氣單胞菌Aeromonas sp. DS-I的發(fā)酵液經(jīng)正丁醇萃取，再蒸發(fā)除去正丁醇制得的固態(tài)制劑；所使用的氣單胞菌Aeromonas sp. DS-1，保藏編號(hào)為 CCTCCNo :M2011180，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武昌珞珈山，郵編430072 ；保藏日期為2011年5月23日。本發(fā)明所述的氣單胞菌除藻劑，是按以下步驟發(fā)酵制備的(1)將氣單胞菌 Aeromonas sp. DS-1CCTCC No :M2011180 的單菌落 1 2 環(huán)接種到 20-100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C條件下180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)小時(shí)，將獲得的菌液以5-10wt%的接種量接入IOO-IOOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C 條件下180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)30-40小時(shí)制得種子液；(2)以5-10wt%的接種量將種子液接入5-20L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中；滅菌參數(shù)為121 °C，20-30分鐘；發(fā)酵條件為，pH6. 5，溶解氧(DO)為70-90，發(fā)酵溫度25-35 °C，攪拌速度70-130轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間16-48小時(shí)；(3)將上述發(fā)酵產(chǎn)物在轉(zhuǎn)速6000 10000rpm/min條件下離心2 lOmin，棄沉淀除去Aeromonas sp. DS-I菌體細(xì)胞，收集上清液，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去正丁醇，得到氣單胞菌除藻劑的固態(tài)制劑。所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，去離子水1000ml。所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，控制溫度40-60°C，轉(zhuǎn)速50-100rpm/min， 將正丁醇蒸發(fā)去除。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為本領(lǐng)域通用產(chǎn)品可市購。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，一種氣單胞菌除藻劑，是按以下步驟發(fā)酵制備的將氣單胞菌Aeromonas sp. DS-1CCTCC No :M2011180 單菌落 1 2 環(huán)接種到 30-80mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C條件下180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)30-40小時(shí)；將獲得的菌液以5-10wt%的接種量接入IOO-IOOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C 條件下180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)30-40小時(shí)，制得種子液；將種子液以5-10Wt%的接種量接入5-20L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，滅菌參數(shù)為121°C，20分鐘；發(fā)酵條件為pH6. 5、 DO為80，發(fā)酵溫度30°C，攪拌速度120轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)，將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速 8000rpm/min離心5min除去菌體細(xì)胞，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去正丁醇后得到固態(tài)制劑。收集正丁醇供重復(fù)使用。本發(fā)明制得的除藻劑的固態(tài)制劑含高效除藻物質(zhì)，通過高效液相色譜-質(zhì)譜分析表明，本發(fā)明制得的除藻劑含17種氨基酸及多種三肽、二肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的除藻劑能有效地消除藍(lán)藻，詳見實(shí)施例部分。本除藻劑經(jīng)發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)，方法參照GB/T15441-1995《水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法》進(jìn)行，受試最大劑量400mg/L，受試時(shí)間為15min，發(fā)光細(xì)菌發(fā)光損失小于5%， 本除藻劑對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光損失LD50大于2. 2g/L，證明本除藻劑對(duì)生物無毒害作用。本發(fā)明的除藻劑的應(yīng)用，用于消除藍(lán)藻水華。所述藍(lán)藻藻種主要是淡水藍(lán)藻。除藻劑使用劑量為2_300mg/L，能有效去除含IO6-IO9個(gè)細(xì)胞/L藍(lán)藻的水華。對(duì)于藻細(xì)胞密度為IO6-IO7個(gè)/L藍(lán)藻水華，除藻劑使用劑量為2-10mg/L。對(duì)于藻細(xì)胞密度為IO8個(gè)/L藍(lán)藻水華，除藻劑使用劑量為30_40mg/L。對(duì)于藻細(xì)胞密度為IO9個(gè)/L藍(lán)藻水華，除藻劑使用劑量為50-300mg/L。所述水華藍(lán)藻藻種主要是淡水藍(lán)藻，包括銅綠微囊藻FACHB927、銅綠微囊藻FACHB975、魚腥藻FACHBM5。除藻劑使用劑量低時(shí)可延長處理天數(shù)，一般處理天數(shù)為1_4 天，可以達(dá)到除藻率達(dá)90%以上。本發(fā)明的有益效果是所制備的除藻劑除藻活性高且穩(wěn)定，在天然水體pH條件下，不受溫度影響；因萃取過程使用的正丁醇可循環(huán)使用，制備成本較低；制備過程簡(jiǎn)便， 產(chǎn)品使用安全，對(duì)環(huán)境無危害，可用于各類淡水水體去除有害藍(lán)藻使用，包括湖泊、水庫、景觀池塘、農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖水等，屬于環(huán)保型除藻劑。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1除藻劑高分辨率液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)氨基酸的色譜圖。所含17種氨基酸附表1說明。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2除藻劑高分辨率液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)主要成分的色譜圖。 所含三肽、二肽附表2說明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例使用的氣單胞菌的菌種為Aeromonas sp. DS-1，保藏編號(hào)為CCTCC No M2011180。實(shí)施例中淡水藍(lán)藻藻種是銅綠微囊藻FACHB927、銅綠微囊藻FACHB975、魚腥藻 FACHBM5(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫，武漢珞珈山東湖南路7號(hào))。 實(shí)施例中牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方為牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，去離子水 1000ml。實(shí)施例中的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi R-220型)，控制溫度40-60°C，轉(zhuǎn)速50_100rpm/
mirio實(shí)施例1.將氣單胞菌Aeromonas sp. DS-1CCTCC No :M2011180 單菌落 1 環(huán)接種到 50mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C條件下ISOrpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，將獲得的菌液以
的接種量接入700mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C條件下180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，制得種子液；以6wt%的接種量將種子液接種于IOL發(fā)酵罐中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為發(fā)酵罐的70%體積。發(fā)酵培養(yǎng)，滅菌參數(shù)為121°C，20分鐘；發(fā)酵參數(shù)為，pH6. 5，DO為80，發(fā)酵溫度30. 0°C，攪拌速度120轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)。將發(fā)酵產(chǎn)物SOOOrpm/min離心5min除去菌體細(xì)胞，上清液用正丁醇萃取2次，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去正丁醇后獲得固態(tài)制劑。本除藻劑的高分辨率液質(zhì)檢測(cè)氨基酸的色譜圖如圖1所示，對(duì)應(yīng)的氨基酸檢測(cè)結(jié)果列于表1中。其中賴氨酸最低除藻濃度為10mg/L。表1氨基酸檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種氣單胞菌除藻劑，是由氣單胞菌Aeromonas sp. DS-I的發(fā)酵液經(jīng)正丁醇萃取，再蒸發(fā)除去正丁醇制得的固態(tài)制劑；所述氣單胞菌Aeromonas sp. DS-1，保藏編號(hào)為 CCTCCNo :M2011180，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武昌珞珈山，保藏日期為2011年5月23日。
2.如權(quán)利要求1所述的氣單胞菌除藻劑，是按以下步驟發(fā)酵制備的(1)將氣單胞菌Aeromonassp. DS-I CCTCC No :M2011180的單菌落1 2環(huán)接種到 20-100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C條件下180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)小時(shí)，將獲得的菌液以5-10wt%的接種量接入IOO-IOOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C 條件下180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)30-40小時(shí)，制得種子液；(2)以5-10wt%的接種量將種子液接入5-20L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中；滅菌參數(shù)為121°C，20-30分鐘；發(fā)酵條件為，PH6.5，溶解氧為70-90，發(fā)酵溫度25_35°C，攪拌速度 70-130轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間16-48小時(shí)；(3)將上述發(fā)酵產(chǎn)物在轉(zhuǎn)速6000 lOOOOrpm/min條件下離心2 lOmin，棄沉淀除去 Aeromonas sp. DS-I菌體細(xì)胞，收集上清液，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去正丁醇，得到氣單胞菌除藻劑的固態(tài)制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的氣單胞菌除藻劑，其特征在于所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，去離子水1000ml。
4.如權(quán)利要求2所述的氣單胞菌除藻劑，其特征在于所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，控制溫度40-60°C，轉(zhuǎn)速50-100rpm/min，將正丁醇蒸發(fā)去除。
5.如權(quán)利要求2所述的氣單胞菌除藻劑，其特征在于是按以下步驟發(fā)酵制備的將氣單胞菌 Aeromonas sp. DS-I CCTCC No :M2011180 單菌落 1 2 環(huán)接種到 30_80mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C條件下ISOrpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)30-40小時(shí)，將獲得的菌液以5-10wt%的接種量接入IOO-IOOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30°C條件下 180rpm/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)30-40小時(shí)，制得種子液；以5-10Wt%的接種量將種子液接入 5-20L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中；滅菌參數(shù)為121°C，20分鐘；發(fā)酵條件為pH6. 5、DO為 80，發(fā)酵溫度30°C，攪拌速度120轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)，將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速SOOOrpm/ min離心5min除去菌體細(xì)胞，取上清液用正丁醇萃取2次，取正丁醇萃取液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去正丁醇后得到固態(tài)制劑。收集正丁醇供重復(fù)使用。
6.權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的氣單胞菌除藻劑的應(yīng)用，用于消除藍(lán)藻水華。
7.如權(quán)利要求6所述的氣單胞菌除藻劑的應(yīng)用，其特征在于所述除藻劑使用劑量為 2-300mg/L,能有效去除含IO6-IO9個(gè)細(xì)胞/L的水華。
8.如權(quán)利要求6所述的氣單胞菌除藻劑的應(yīng)用，其特征在于對(duì)于藻細(xì)胞密度為IO6-IO7 個(gè)/L藍(lán)藻水華，除藻劑使用劑量為2-10mg/L。
9.如權(quán)利要求6所述的氣單胞菌除藻劑的應(yīng)用，其特征在于對(duì)于藻細(xì)胞密度為IO8個(gè) /L藍(lán)藻水華，除藻劑使用劑量為30-40mg/L。
10.如權(quán)利要求6所述的氣單胞菌除藻劑的應(yīng)用，其特征在于對(duì)于藻細(xì)胞密度為IO9個(gè) /L藍(lán)藻水華，除藻劑使用劑量為50-300mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氣單胞菌除藻劑及其去除藍(lán)藻水華的應(yīng)用。所述氣單胞菌除藻劑是由氣單胞菌Aeromonas sp.DS-1的發(fā)酵液經(jīng)正丁醇萃取、再蒸發(fā)除去正丁醇制得的固態(tài)制劑；所使用的氣單胞菌Aeromonas sp.DS-1，保藏編號(hào)為CCTCC NoM2011180，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心。所述的氣單胞菌除藻劑用于消除藍(lán)藻水華，除藻劑使用劑量為2-300mg/L，能有效去除含105-109個(gè)細(xì)胞/L藍(lán)藻的水華。
文檔編號(hào)C12P1/04GK102356770SQ20111019460
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者劉玉梅, 李力 申請(qǐng)人:山東大學(xué)