專利名稱：用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液及其制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液及其制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)外周動(dòng)脈疾病(PAD)患病率高，嚴(yán)重PAD患者往往失去介入或外科血運(yùn)重建術(shù)的指征，藥物治療難以改變PAD的自然史，最終導(dǎo)致患者截肢等不良預(yù)后。研究表明生長(zhǎng)因子、骨髓源性干細(xì)胞和祖細(xì)胞等具有治療性血管生成作用，能夠促進(jìn)缺血組織的血管生成、改善血流灌注，即“生物性動(dòng)脈旁路術(shù)”。然而，現(xiàn)有生物治療方法利用單一基因或生長(zhǎng)因子治療外周動(dòng)脈疾病的效果不確切，可能原因之一是機(jī)體對(duì)外周組織缺血的保護(hù)性反應(yīng)相對(duì)復(fù)雜，單一生長(zhǎng)因子干預(yù)雖有效但無法完成這一過程；干、祖細(xì)胞移植雖能改善缺血組織的血管密度和血流灌注，但主要細(xì)胞來源骨髓、臍帶血等的獲取存在嚴(yán)重局限，而且細(xì)胞的在體生存能力極為有限，嚴(yán)重影響其治療作用的發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液及其制備方法和使用方法，提高移植細(xì)胞的存活能力和血管生成效應(yīng)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液的制備方法，其特征在于 由以下步驟實(shí)現(xiàn)
步驟一將取材于8-10周齡？ -actin-luc轉(zhuǎn)基因FVB小鼠腹股溝、腹膜腔和腎周的脂肪組織剪碎，用含有青/鏈霉素各100 U/mL的無菌磷酸鹽緩沖液清洗3次后，加入含 0. 2% I型膠原酶的Dulbecco改良fegle/F12培養(yǎng)基，輕微振搖下37 ！水浴消化60-75 min ；
步驟二 等體積的Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基終止消化，Dulbecco改良 Eagle/F12完全培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和青/鏈霉素各100 U/mL ；
步驟三將細(xì)胞懸液在室溫下200 Xg離心10 min，分離出脂肪組織中基質(zhì)血管部分， 然后在Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基中重懸脂肪組織中基質(zhì)血管部分，以37 °C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02、飽和濕度培養(yǎng)48-72 h后，去除未貼壁細(xì)胞；
步驟四貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、計(jì)數(shù)后，以2X 104/cm2密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，即為原代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞；將細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增時(shí)，在完全培養(yǎng)基中按2ng/ml的濃度加入人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；
步驟五細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)面積的80%后，采用0. 05%胰蛋白酶和0. 02%乙二胺四乙酸消化傳代；收集第3代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，在Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基中重懸，接種到75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；然后以lOng/mL的濃度加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，預(yù)處理脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞M小時(shí)；
步驟六取1.0X106數(shù)量、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理M小時(shí)后的脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，與10. Ong血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子混合，得到目的產(chǎn)物。如所述的制備方法制得的用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液。如所述的用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液的使用方法， 其特征在于
將1. OX 106數(shù)量、接受血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理24h的第3代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，聯(lián)合10. Ong血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，共同加入到60yL無菌磷酸鹽緩沖液中，然后將其注射到缺血下肢肌肉組織中；在聯(lián)合治療后的第7、14、21和觀天，分別于缺血下肢的相同部位多點(diǎn)肌肉注射血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子5.0 ng。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明克服了單一因子或單純干細(xì)胞治療組織缺血的獲益局限，保證了干細(xì)胞的足量獲取，并提高了移植細(xì)胞的存活能力和血管生成效應(yīng)。因此，干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液及其用法，不僅能保證干細(xì)胞在增殖過程中維持其多潛能分化特性，還可提高細(xì)胞對(duì)缺氧損傷的耐受力，延長(zhǎng)細(xì)胞在缺氧環(huán)境中存活的時(shí)間，并增強(qiáng)干細(xì)胞的血管生成作用，能夠促進(jìn)缺血下肢的血管新生和血流灌注恢復(fù)，有效改善跛行并提高肢體的存活率。


圖1為體外人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子干預(yù)下培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，A、B、 C、D分別為原代培養(yǎng)12h、原代培養(yǎng)Mh、第1代和第3代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞；
圖2為脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的報(bào)告基因Fluc體外光學(xué)成像，A、B顯示細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度成正比，C顯示細(xì)胞在10代以內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)Fluc ；
圖3顯示體外血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理可提高細(xì)胞的生存活力和對(duì)缺氧環(huán)境的耐受力；
圖4為體內(nèi)移植脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的Fluc光學(xué)成像示蹤監(jiān)測(cè)和定量分析； 圖5為脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合治療后缺血下肢的激光多普勒成像和定量分析；
圖6為脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合治療后缺血下肢微血管的 ⑶31、vWF免疫組織化學(xué)染色和定量分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。月旨肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stromal cell，ADMSC)具有多系分化的潛能，特定條件下可以分化為脂肪、骨、軟骨或骨骼肌細(xì)胞等間充質(zhì)系細(xì)胞， 還能夠橫向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等非間充質(zhì)系細(xì)胞。同時(shí)，脂肪組織易于通過低侵入性手段(如脂肪抽吸術(shù)等)大量獲取，可能是用于組織缺血治療較理想的細(xì)胞來源。人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種多功能生長(zhǎng)因子，在損傷部位有明顯的細(xì)胞趨化活性，能夠刺激成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等向損傷部位移動(dòng)；同時(shí)，bFGF能夠維持體外培養(yǎng)干細(xì)胞的生物學(xué)活性穩(wěn)定和多向分化特性。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效促血管生成因子，具有促缺血組織血管形成和抗缺血組織凋亡的功能，能夠促進(jìn)血管新生和功能的恢復(fù)，并可以改善干細(xì)胞的存活與增殖，對(duì)干細(xì)胞具有保護(hù)作用。本發(fā)明利用多種生長(zhǎng)因子穩(wěn)定并提高移植細(xì)胞的干細(xì)胞特性和體內(nèi)存活能力，以最大程度地發(fā)揮ADMSCs的治療性血管生成作用；聯(lián)合干細(xì)胞和生長(zhǎng)因子以提高缺血組織的血管新生與側(cè)支代償，進(jìn)一步促進(jìn)缺血組織的血流恢復(fù)并改善預(yù)后。用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液的制備方法，全過程均在無菌狀態(tài)下完成
步驟一將取材于8-10周齡？ -actin-luc轉(zhuǎn)基因FVB小鼠腹股溝、腹膜腔和腎周的脂肪組織剪碎，用含有青/鏈霉素各100 U/mL的無菌磷酸鹽緩沖液清洗3次后，加入含 0. 2% I型膠原酶的Dulbecco改良fegle/F12培養(yǎng)基，輕微振搖下37 ！水浴消化60-75 min ；
步驟二 等體積的Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基終止消化。Dulbecco改良 Eagle/F12完全培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和青/鏈霉素各100 U/mL ；
步驟三將細(xì)胞懸液在室溫下200 Xg離心10 min，分離出脂肪組織中基質(zhì)血管部分， 然后在Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基中重懸脂肪組織中基質(zhì)血管部分，以37 °C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度培養(yǎng)48-72 h后，去除未貼壁細(xì)胞；
步驟四貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、計(jì)數(shù)后，以2X IOVcm2密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，即為原代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞；將細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增時(shí)，在完全培養(yǎng)基中按2ng/ml的濃度加入人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；
步驟五細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)面積的80%后，采用0. 05%胰蛋白酶和0. 02%乙二胺四乙酸消化傳代；收集第3代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，在Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基中重懸，接種到75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；然后以lOng/mL的濃度加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，預(yù)處理脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞M小時(shí)；
步驟六取1.0X106數(shù)量、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理M小時(shí)后的脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，與10. Ong血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子混合，得到目的產(chǎn)物。脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)情況、表面標(biāo)志和報(bào)告基因成像鑒定 1)形態(tài)和生長(zhǎng)情況
原代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(ADMSCs)在接種后8-12h，倒置相差顯微鏡下可見散在的單個(gè)細(xì)胞開始貼壁，最初呈規(guī)則或不規(guī)則圓形，然后部分細(xì)胞伸展呈梭形，見附圖IA ； 12-24h 貼壁細(xì)胞逐漸增多并進(jìn)一步伸展成長(zhǎng)梭形，見附圖1B;48 h首次傳代，傳代后的第1代 ADMSCs 6-12h即貼壁，增殖速度較快，并逐漸融合成單層簇狀分布，見附圖IC ；第3代后細(xì)胞成分較均一，易形成集落生長(zhǎng)，見附圖1D。脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的體積較大，呈成纖維細(xì)胞樣，核較大居中，近似卵圓形，偶見雙核，多為1個(gè)核仁。平均群體倍增時(shí)間約為Mh，約 48-7 可達(dá)80-90%融合。第1-5代細(xì)胞的增殖速度逐漸加快，第5代后趨于穩(wěn)定，生存期有限，可傳代8-10代。2)表面標(biāo)志
流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代ADMSCs的表面標(biāo)志，結(jié)果顯示ADMSCs的⑶44、⑶90、⑶四、 CD49d 和 ka-Ι 的陽性率分別為 99. 6%,98. 9%,89. 3%,49. 3% 和 39. 9%,而 CD31、CD34、CD45 的陽性率分別為1. 02%、1. 10%和3.對(duì)％，表明體外分離培養(yǎng)的ADMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志。3)細(xì)胞的報(bào)告基因成像鑒定
IVIS Xenogen Kinetic系統(tǒng)對(duì)第3代ADMSCs進(jìn)行螢火蟲熒光素酶(Fluc)生物發(fā)光成像，采用Fluc平均輻射強(qiáng)度定量光信號(hào)強(qiáng)度，單位為光子·秒―1 厘米_2 ·單位角―1 (P · s—1 · cm_2 · sr—1)。結(jié)果顯示，ADMSCs的細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與Fluc平均輻射強(qiáng)度成較強(qiáng)的正直線相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r2=0.94)，見附圖2A、2B。熒光素酶定量檢測(cè)(Flue assay)表明體外擴(kuò)增培養(yǎng)的ADMSCs在10代以內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)Fluc，見附圖2C。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理對(duì)脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞存活能力的影響
體外生物發(fā)光成像顯示，缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷可以顯著降低ADMSCs的存活能力，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)預(yù)處理能夠提高ADMSCs對(duì)H/R損傷的耐受力，從而提高缺氧環(huán)境下ADMSCs的生存活力。H/R損傷后，無VEGF預(yù)處理的ADMSCs其Fluc平均輻射強(qiáng)度較正常培養(yǎng)條件下的 ADMSCs降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0°<0. 01);而H/R損傷后，采用4.0 M 10. 0 ng/mL濃度 VEGF預(yù)處理的ADMSCs其Fluc平均輻射強(qiáng)度較無VEGF預(yù)處理的ADMSCs增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0°<0. 05)，提示4. 0至10. 0 (ng/mL) VEGF預(yù)處理可提高細(xì)胞缺氧損傷后的生存活力，見附圖3A，B)。量效曲線分析顯示，不同VEGF濃度(1.0至10.0 ng/mL)與H/R損傷后 ADMSCs的光信號(hào)強(qiáng)度成一定的正相關(guān)關(guān)系，其效應(yīng)具有一定的遞增趨勢(shì)(r2=0. 82)，見附圖 3C。脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子注射液的使用方法和療效評(píng)價(jià)
1)將1. OX IO6數(shù)量、接受血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理Mh的第3代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，聯(lián)合10. Ong血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，共同加入到60μ L無菌磷酸鹽緩沖液中，然后將其注射到缺血下肢肌肉組織中；在聯(lián)合治療后的第7、14、21和觀天，分別于缺血下肢的相同部位多點(diǎn)肌肉注射血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子5.0 ng。2)聯(lián)合治療后，對(duì)體內(nèi)移植的ADMSCs進(jìn)行連續(xù)、動(dòng)態(tài)的分子影像學(xué)監(jiān)測(cè)。在移植后即刻及移植后第1、3、5、7、14、21、28、35天，裸鼠腹腔以150mg/kg劑量注射探針熒光素 D-Iuciferin 后，在 IVIS Xenogen Kinetic 系統(tǒng)中成像。結(jié)果顯示，VEGF、ADMSCs 聯(lián)合注射治療的小鼠其體內(nèi)ADMSCs的Fluc平均輻射強(qiáng)度顯著高于單純ADMSCs治療的小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0°<0. 05)，見附圖4A，B。表明VEGF能夠增強(qiáng)ADMSCs在缺血組織內(nèi)的存活能力，有效延長(zhǎng)細(xì)胞移植后的生存時(shí)間。3) VEGF、ADMSCs聯(lián)合治療后，對(duì)裸鼠缺血下肢進(jìn)行血流灌注的激光多普勒成像和血管生成的組織學(xué)監(jiān)測(cè)。治療后第0、3、7、14天采用激光多普勒成像(LDPI)對(duì)裸鼠下肢的血流灌注進(jìn)行監(jiān)測(cè)，采用LDPI指數(shù)(LDPI index)對(duì)血流定量；⑶31、vffF免疫組織化學(xué)檢測(cè)缺血下肢的血管生成情況，采用毛細(xì)血管/肌纖維比值(capillary/muscle fiber ratio index)定量毛細(xì)血管數(shù)量；同時(shí)，計(jì)算缺血下肢的跛行率和自截肢率。 結(jié)果表明，組織缺血后第1至14天，無論是否接受治療，缺血下肢的血流灌注和毛細(xì)血管密度均逐漸改善。但是，單純ADMSCs注射治療較PBS注射治療能進(jìn)一步提高缺血下肢的LDPI指數(shù)和毛細(xì)血管/肌纖維比值；而接受VEGF、ADMSCs聯(lián)合注射治療的小鼠其缺血下肢的LDPI指數(shù)、毛細(xì)血管/肌纖維比值顯著高于單純ADMSCs治療小鼠(7X0. 05)，見附圖 5A，B和附圖6A，B ；接受VEGF、ADMSCs聯(lián)合注射治療的小鼠其跛行率和缺血肢體自截肢率顯著低于單純ADMSCs治療小鼠(/X0. 05)。證實(shí)聯(lián)合生物療法較干細(xì)胞移植治療能進(jìn)一步改善缺血下肢血流灌注和血管生成、降低跛行率并提高肢體存活率。
權(quán)利要求
1.用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液的制備方法，其特征在于由以下步驟實(shí)現(xiàn)步驟一將取材于8-10周齡？ -actin-luc轉(zhuǎn)基因FVB小鼠腹股溝、腹膜腔和腎周的脂肪組織剪碎，用含有青/鏈霉素各100 U/mL的無菌磷酸鹽緩沖液清洗3次后，加入含 0. 2% I型膠原酶的Dulbecco改良fegle/F12培養(yǎng)基，輕微振搖下37 ！水浴消化60-75 min ；步驟二等體積的Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基終止消化，Dulbecco改良 Eagle/F12完全培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和青/鏈霉素各100 U/mL ；步驟三將細(xì)胞懸液在室溫下200Xg離心10 min，分離出脂肪組織中基質(zhì)血管部分， 然后在Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基中重懸脂肪組織中基質(zhì)血管部分，以37 °C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度培養(yǎng)48-72 h后，去除未貼壁細(xì)胞；步驟四貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、計(jì)數(shù)后，以2X IOVcm2密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，即為原代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞；將細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增時(shí)，在完全培養(yǎng)基中按2ng/ml的濃度加入人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；步驟五細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)面積的80%后，采用0. 05%胰蛋白酶和0. 02%乙二胺四乙酸消化傳代；收集第3代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，在Dulbecco改良fegle/F12完全培養(yǎng)基中重懸，接種到75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；然后以lOng/mL的濃度加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，預(yù)處理脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞M小時(shí)；步驟六取1.0X106數(shù)量、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理M小時(shí)后的脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，與10. Ong血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子混合，得到目的產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法制得的用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液。
3.如權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液的使用方法，其特征在于將1. OX IO6數(shù)量、接受血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理Mh的第3代脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，聯(lián)合10. Ong血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，共同加入到60 μ L無菌磷酸鹽緩沖液中，然后將其注射到缺血下肢肌肉組織中；在聯(lián)合治療后的第7、14、21和觀天，分別于缺血下肢的相同部位多點(diǎn)肌肉注射血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子5.0 ng。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于促進(jìn)缺血組織血管生成的干細(xì)胞聯(lián)合生長(zhǎng)因子注射液及其制備方法和使用方法。機(jī)體對(duì)外周組織缺血的保護(hù)性反應(yīng)相對(duì)復(fù)雜，單一生長(zhǎng)因子干預(yù)雖有效但無法完成這一過程；干、祖細(xì)胞移植雖能改善缺血組織的血管密度和血流灌注，但主要細(xì)胞來源骨髓、臍帶血等的獲取存在嚴(yán)重局限，而且細(xì)胞的在體生存能力極為有限，嚴(yán)重影響其治療作用的發(fā)揮。本發(fā)明利用人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子干預(yù)脂肪間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，并聯(lián)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子共同作用，促進(jìn)缺血組織血管生成。本發(fā)明克服了單一因子或細(xì)胞治療的獲益局限，保證了干細(xì)胞的足量獲取，并提高了移植細(xì)胞的存活能力和血管生成效應(yīng)，從而能進(jìn)一步改善缺血下肢的血流灌注，提高肢體存活率。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102274491SQ20111019485
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者劉俊廷, 曹豐, 梁繼民, 田捷, 范偉偉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)