專利名稱：：利用巢式pcr結(jié)合基因特異引物的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，特別是涉及一種利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法，該方法可應(yīng)用在不同環(huán)境下低豐度表達(dá)基因以及可變剪接變體表達(dá)的相關(guān)研究和評估中。
背景技術(shù)：
：研究報(bào)道，高等真核生物約有95%的基因發(fā)生可變剪接。基因在特定環(huán)境下表達(dá)特定的剪接形式，后者往往是某些疾病的生物標(biāo)記，也可能是導(dǎo)致這些疾病的原因，因此盡可能多地發(fā)現(xiàn)重要基因的可變剪接形式在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究方面意義重大。但是，由于某些基因的轉(zhuǎn)錄本豐度異常低，這就給在組織特定階段、生理或病理?xiàng)l件下確定特異剪接變體的種類以及特殊轉(zhuǎn)錄本的外顯子組成帶來了一定的困難。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明低豐度表達(dá)基因在重要生物過程中起著舉足輕重的作用，例如低豐度表達(dá)基因剪接變體與細(xì)胞分化、新陳代謝和表型改變等有著密切的關(guān)系，并且可能是生物進(jìn)化過程中的一個(gè)重要驅(qū)動力，然而由于低豐度表達(dá)基因的低轉(zhuǎn)錄本和高異質(zhì)性，導(dǎo)致人們對于低豐度表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄本的認(rèn)識還處于一個(gè)初始階段。為了深入認(rèn)識低豐度表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)和功能，目前已發(fā)展了多種技術(shù)方法來尋找和鑒定低豐度表達(dá)基因及其剪接變體，主要包括表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)預(yù)測、基因表達(dá)的序列分析(SAGE),RNA-Seq預(yù)測、mRNA差異顯示PCR(DD-PCR)、代表性差異分析(RDA)、酶降解消減、接頭捕獲消減、物理移除共同序列、差異消減展示(DSD)、限制性標(biāo)記cDNA掃描、靶長鏈多態(tài)性標(biāo)記消減、抑制消減雜交(SSH)、cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)、SMART-RACE和實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)。這些技術(shù)雖然能夠在一定程度上獲取低豐度表達(dá)基因，但又存在其自身的缺點(diǎn)，如假陽性高、穩(wěn)定性差、步驟繁瑣、工作量大、周期長、成本過高等，使其難以普遍推廣應(yīng)用，因而目前尚無挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的有效方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的基因特異引物(gene-specificprimer，GSP)。本發(fā)明所提供的基因特異引物(GSP)，是由引物設(shè)計(jì)軟件或其它類似功能的引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)完成，基因特異引物(GSP)包括3’GSP(靠近3’端)和5’GSP(靠近5’端)，并且要求盡量靠近兩端。除了一般PCR的引物所必須具備的條件之外，基因特異引物(GSP)還需在熱力學(xué)特征上滿足基因特異性(非單純序列比對水平)的要求。用于挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定基因的不同剪接變體的基因特異引物(GSP)是在待鑒定基因的已知剪接變體所對應(yīng)的全長cDNA序列范圍內(nèi)，尋找可能的候選引物區(qū)域，并以DNA雜交探針(hybridizationprobe)和反轉(zhuǎn)錄引物的形式設(shè)計(jì)出3，GSP，然后將設(shè)計(jì)好的3’GSP直接用于反轉(zhuǎn)錄過程和巢式PCR反應(yīng)，用以挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體。具體來講，所述基因特異引物(GSP)的設(shè)計(jì)由I^rimerf程序自動完成，程序設(shè)計(jì)主要思路如下DWNCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中獲取某一基因剪接變體的序列，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫記錄或使用splign、gmap.blat,blast等軟件解析其基因結(jié)構(gòu)；2)在全長cDNA序列范圍內(nèi)尋找可能的候選引物區(qū)域；3)為候選引物打分(kore)，由三個(gè)部分組成，即S=Sbasic+Send+Sgenome；a)引物質(zhì)量基本分?jǐn)?shù)(Sbasic)按照常規(guī)引物質(zhì)量評估體系進(jìn)行打分，即引物長度為182^p、GC含量約50%、Tm約58°C，與這些參數(shù)越接近的引物打分越高；b)引物與基因兩端距離分?jǐn)?shù)(Smd)按照GSP的要求，即越靠近兩端打分越高，針對5，GSP和3，GSP分別打分；c)全基因組引物特異性控制分?jǐn)?shù)(SgaraJ從熱力學(xué)的角度全基因組掃描可能的引物靶定位點(diǎn)，位點(diǎn)越少(除靶基因之外)打分越高；4)按照打分情況排序候選引物，并取打分最高的前5條引物作為用于挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的引物。在上述基因特異引物(GSP)的設(shè)計(jì)方法中，步驟4)中通常提供前5條引物備選，如果經(jīng)過篩選之后，不能獲得5條備選引物，那么則根據(jù)實(shí)際情況降低引物篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇前1-4條引物作為備選即可。具體來講，優(yōu)選的針對野生型秀麗隱桿線蟲隊(duì)株系的glb-18基因的已知剪接變體設(shè)計(jì)的5’GSPl的核苷酸序列如序列表中序列1所示，3’GSPl的核苷酸序列如序列表中序列2所示，3’GSP2的核苷酸序列如序列表中序列3所示，3’GSP3的核苷酸序列如序列表中序列4所示；針對小鼠BDNF基因的已知剪接變體設(shè)計(jì)的5’GSP5的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’GSP6的核苷酸序列如序列表中序列6所示，3’GSP4的核苷酸序列如序列表中序列7所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種簡便易行、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、可靠性強(qiáng)、成本節(jié)約型的利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法。本發(fā)明所提供的挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法，是利用巢式PCR結(jié)合所述基因特異引物(GSP)的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)。所述利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，是由不同豐度基因的基因特異引物(GSP)直接參與反轉(zhuǎn)錄，繼而進(jìn)行巢式PCR的方法。具體來講，所述挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法可包括以下步驟1)基于3，GSPl的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)；2)利用梯度PCR尋找每個(gè)基因每對引物組合的最佳退火溫度；3)基于GSP的巢式PCR；4)對巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序(包括凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆、挑克隆搖菌、菌液PCR鑒定、提質(zhì)粒、酶切鑒定和測序的步驟)；5)基于生物信息學(xué)的序列結(jié)果分析，判定是否為新的剪接變體。在上述方法中，所述步驟1)中基于3’GSPl的20μ1反轉(zhuǎn)錄體系及反轉(zhuǎn)錄方法為⑴·總RNA1μg，對應(yīng)基因10pmol/L3，GSPl1μ1，RNaseFreeH2O補(bǔ)齊至12μ1，混勻后，65°C5min，然后立即置于冰上；(2).5XRTbuffer4μ1，dNTPMixture2μ1，RNaseinhibitorlyl，反轉(zhuǎn)錄酶Iyl；將(1)和O)中溶液混勻后按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄先300CIOmin,然后40°C40min,再85°C5min,最后4°C停止。所述步驟2)中梯度PCR的12.5μ1反應(yīng)體系為ddH209.187μ1，IOXExTaqbuffer1.25μ1，dNTPMixture1.0μ1,ExTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板(即步驟1)的RT-PCR產(chǎn)物)0.5μ1；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min；然后95°C45s—不同梯度退火溫度(梯度依次為55.O0C>55.50C>56.8°C>58.8°C、60°C、61.rC、62°C、63.3°C、65.7°C>67.9V)各妨s—72°Clmin，共；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。所述步驟3)中針對野生型秀麗隱桿線蟲隊(duì)株系的glb-18基因的巢式PCR共分三輪進(jìn)行，反應(yīng)體系為12.5μ1，包括CldH2O9.187μ1，IOXExTaqbuffer1.25μ1，dNTPMixture1.0μΙ,ΕχTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板0.5μ1；第一輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上、下游引物分別為5’GSP1和3’GSP1；第二輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第一輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP1和3’GSP2；第三輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第二輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5，GSPl和3，GSP3；反應(yīng)條件為先95°C預(yù)變性5min；然后95°C45s—最佳退火溫度(根據(jù)所摸索的擴(kuò)增秀麗隱桿線蟲N2株系的glb-18基因的退火溫度，確定三輪均為60°C)45s—72°Clmin,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。所述步驟3)中針對小鼠BDNF基因的巢式PCR共分五輪進(jìn)行，反應(yīng)體系為12.5μ1，包括CldH2O9.187μ1，IOXExTaqbuffer1·25μ1，dNTPMixture1.0μ1,ExTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板0.5μ1；第一輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP2；第二輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第一輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP3；第三輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第二輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP4；第四輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第三輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP5和3’GSP4;第五輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第四輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP6和3’GSP4；反應(yīng)條件為先95°C預(yù)變性5min；然后95°C45s—最佳退火溫度(根據(jù)所摸索的擴(kuò)增小鼠BDNF基因的退火溫度，確定五輪巢式PCR均為62°C)4k—72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。用上述方法得到的新物質(zhì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述新物質(zhì)包括新的低豐度表達(dá)基因剪接變體。其中，野生型秀麗隱桿線蟲N2株系glb-18基因的新的低豐度表達(dá)基因剪接變體的核苷酸序列可如序列表中序列8所示，小鼠BDNF基因的新的低豐度表達(dá)基因剪接變體的核苷酸序列可如序列表中序列9所示。本發(fā)明提供了一種利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)反轉(zhuǎn)錄技術(shù)挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法。該技術(shù)的核心首先是GSP的設(shè)計(jì)，原因是GSP可特異、高效地富集和擴(kuò)增待鑒定基因，提高低豐度表達(dá)基因的挖掘效率，其次是巢式PCR擴(kuò)增，原因是巢式PCR技術(shù)可特異性地?cái)U(kuò)增出低豐度表達(dá)基因和基因的剪接變體；該技術(shù)的原理為1)基于3’GSPl的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，特異性地獲得待鑒定基因的cDNA，特別是對于低豐度表達(dá)基因，可有效抑制其它基因的擴(kuò)增；2)利用梯度PCR尋找每個(gè)基因每對引物組合的最佳退火溫度，可保證低豐度表達(dá)基因的高效擴(kuò)增；幻基于GSP的巢式PCR可以特異性地獲得待鑒定基因，而非待鑒定基因則無法被擴(kuò)增出來。本發(fā)明可以用于多種生命體的不同生理狀態(tài)下基因表達(dá)的研究，如大腸桿菌、酵母、斑馬魚、秀麗隱桿線蟲、小鼠和細(xì)胞等，并且可以通過對不同低豐度表達(dá)基因設(shè)計(jì)GSP，針對不同生命體的不同研究需求進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。本方法簡便易行、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、可靠性強(qiáng)，并且極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，能夠替代現(xiàn)有的常規(guī)技術(shù)，可應(yīng)用于不同生理病理狀態(tài)下真核生物低豐度表達(dá)基因的挖掘和高、低豐度表達(dá)基因剪接變體的鑒定及發(fā)現(xiàn)中(所述技術(shù)不僅可應(yīng)用于挖掘低豐度表達(dá)基因，更可用于鑒定和發(fā)現(xiàn)高表達(dá)基因及低豐度表達(dá)基因的剪接變體，此外，除了靶定基因已知的剪接變體外，更可用于基因未知剪接變體的發(fā)現(xiàn))，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為本發(fā)明利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)反轉(zhuǎn)錄技術(shù)挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法的流程2為針對同一基因不同剪接變體的GSP設(shè)計(jì)方式(秀麗隱桿線蟲glb-18基因特異引物設(shè)計(jì)信息)圖3為BDNF基因特異引物設(shè)計(jì)信息圖4為針對野生型秀麗隱桿線蟲N2株系glb-18基因的巢式PCR產(chǎn)物電泳圖譜圖5為針對小鼠BDNF基因的巢式PCR產(chǎn)物電泳圖譜具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1用于挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的基因特異引物(GSP)的設(shè)計(jì)基因特異引物(GSP)的設(shè)計(jì)由ft~imer3程序自動完成，程序設(shè)計(jì)主要思路如下OWNCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中獲取某一基因剪接變體的序列，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫記錄或使用splign、gmap.blat,blast等軟件解析其基因結(jié)構(gòu)；6)在全長cDNA序列范圍內(nèi)尋找可能的候選引物區(qū)域；7)為候選引物打分，由三個(gè)部分組成，即S=Sbasic+Send+Sgenomea)引物質(zhì)量基本分?jǐn)?shù)(Sbasic)按照常規(guī)引物質(zhì)量評估體系進(jìn)行打分，即引物長度182^p、GC含量約50%Jm約58°C，與這些參數(shù)越接近的引物打分越高。b)引物與基因兩端距離分?jǐn)?shù)(Smd)按照GSP的要求，即越靠近兩端打分越高，針對5，GSP和3，GSP分別打分；c)全基因組引物特異性控制分?jǐn)?shù)(S_·)從熱力學(xué)的角度全基因組掃描可能的7引物靶定位點(diǎn)，位點(diǎn)越少(除靶基因之外)打分越高；8)按照打分情況排序候選引物，并取打分最高的前5條引物(備選)作為用于挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的引物。通常提供前5條引物備選。如果經(jīng)過篩選之后，不能獲得5條備選引物，那么則根據(jù)實(shí)際情況降低引物篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇前1-4條引物作為備選即可。分別以野生型秀麗隱桿線蟲N2株系的glb-18基因和小鼠BDNF基因的已知剪接變體為例進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(圖2為glb-18基因的引物設(shè)計(jì)信息(針對同一基因不同剪接變體F52A8.4b和F52A8.4a的GSP設(shè)計(jì)方式)；圖3為以BDNF基因其中一個(gè)剪接變體001048139.1為例的巢式PCR模式圖(1、2、3、4、5分別代表巢式PCR的順序及引物組合；5G4、5G5、5G6分別代表上游引物；3G1、3G2、3G3、3G4分別代表下游引物)。引物序列如下針對野生型秀麗隱桿線蟲N2株系的glb-18基因的已知剪接變體(GenBank號NM_001136303.1)設(shè)計(jì)的特異引物5，GSPl:tgccgtctgctgctcgtcaa(序歹Ij表中序歹丨J1)；3，GSPl:ggcggaaaacgattgacacctttca(序歹Ij表中序歹丨J2)；3，GSP2:tcctccacaccgtcactgcg(序列表中序列3)；3，GSP3tcggtcataatggagagacggtgtt(序列表中序列4)。針對小鼠BDNF基因的已知剪接變體(GenBank號001048139.1)設(shè)計(jì)的特異引物5，GSP5:cgaggttcggctcacaccga(序列表中序列5)；5，GSP6:agccccagtttggtcccctc(序歹Ij表中序歹丨J6)；3，GSP4:gagtcccatgggtccgcaca(序列表中序列7)。實(shí)施例2利用基因特異引物(GSP)結(jié)合巢式PCR技術(shù)在鑒定和發(fā)現(xiàn)低豐度表達(dá)基因中的應(yīng)用利用基因特異引物(GSP，以實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物為例)結(jié)合巢式PCR技術(shù)在鑒定和發(fā)現(xiàn)低豐度表達(dá)基因中的應(yīng)用，具體方法包括以下步驟(流程圖如圖1所示)一、依賴于3’GSPl的RNA反轉(zhuǎn)錄以提取的總RNA(野生型秀麗隱桿線蟲N2株系或小鼠)為模板，反轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)基因cDNA第一鏈?；?，GSP1的20μ1反轉(zhuǎn)錄體系及反轉(zhuǎn)錄方法為(所用試劑購自Τ0Υ0Β0公司)(1).總RNA1μg，對應(yīng)基因10pmol/L3，GSPl1μ1，RNaseFreeH2O補(bǔ)齊至12μ1，混勻后，65°C5min，然后立即置于冰上；(2).5XRTbuffer4μ1,dNTPMixture2μ1,RNaseinhibitor1μ1，反轉(zhuǎn)錄酶1μ1；將(1)和O)中溶液混勻后按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄先30°ClOmin，然后40°C40min，再85°C5min，最后4°C停止。瞬時(shí)離心后，_20°C保存待用。二、利用溫度梯度PCR尋找每個(gè)基因每對引物組合的最佳退火溫度實(shí)驗(yàn)中分別針對野生型線蟲隊(duì)株系中7個(gè)低豐度表達(dá)基因(egl-9(GenBank號NM_001028661.2、NM_171533.3、NM_001028663.2、ΝΜ_001047640.1、NM_001028662.1)、hif-1(GenBank號ΝΜ_075607·4、NM_001028720.2、NM_001028722.2、NM_001028721.1)、glb-3(GenBank號ΝΜ_073431·1)、glb-5(GenBank號ΝΜ_001129381·1、NM_072065.2)、glb-8(GenBank號ΝΜ_059706·2、NM_001136283.1)、glb-13(GenBank號ΝΜ_077678·4)、glb-18(GenBank號NM_001136303.1、NM_059673.5))和小鼠低豐度表達(dá)基因BDNF的不同引物組合進(jìn)行溫度梯度PCR，每對引物PCR的反應(yīng)體系為12.5μ1，包括ddH209.187μ1，IOXExTaqbuffer1.25μ1,dNTPMixtureΙ.ΟμΙ,ΕχTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板(即步驟一的RT-PCR產(chǎn)物)0.5μ1；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min；然后95°C45s—不同梯度退火溫度(梯度依次為55.0°C、55.5°C、56·8°C、58·8°C、60°C、61·1°C、62°C、63.3°C、65.7°C、67.9°C)各45s—72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，具體步驟如下將PCR產(chǎn)物(12.5μ1)與6XL0adingbuffer(2.5μ1)混勻后，加入含GoldView核酸染料的2%瓊脂糖凝膠中，穩(wěn)壓120V電泳50min，利用凝膠成像儀將電泳后的瓊脂糖凝膠拍照并保存。通過分析凝膠圖像，尋找每個(gè)基因每對引物組合的最佳退火溫度。三、結(jié)合基因特異引物的巢式PCR針對野生型線蟲N2株系的glb-18基因的巢式PCR共分三輪進(jìn)行，反應(yīng)體系為12.5μ1，包括CldH2O9.187μ1，IOXExTaqbuffer1·25μ1，dNTPMixture1.0μ1,ExTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板0.5μ1；第一輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上、下游引物分別為5’GSPl和3’GSPl；第二輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第一輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSPl和3’GSP2；第三輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第二輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5，GSPl和3，GSP3；反應(yīng)條件為先95°C預(yù)變性5min；然后95°C45s—最佳退火溫度(根據(jù)所摸索的擴(kuò)增秀麗隱桿線蟲N2株系的glb-18基因的退火溫度，確定三輪均為600C)45s—72°Clmin，;35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。對PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，具體步驟如下將PCR產(chǎn)物(5μ1)與6XL0adingbuffer(1.5μ1)混勻后，加入含GoldView核酸染料的2%瓊脂糖凝膠中，穩(wěn)壓120V電泳50min，利用凝膠成像儀將電泳后的瓊脂糖凝膠拍照分析。針對小鼠BDNF基因的巢式PCR共分五輪進(jìn)行，反應(yīng)體系為12.5μ1，包括ddH209.187μ1，IOXExTaqbuffer1.25μl，dNTPMixture1.0μl，ExTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板0.5μ1；第一輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上、下游弓I物分別為5’GSP4和3’GSP2；第二輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第一輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP3；第三輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第二輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP4；第四輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第三輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP5和3’GSP4；第五輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第四輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP6和3’GSP4；反應(yīng)條件為先95°C預(yù)變性5min；然后95°C45s—最佳退火溫度(根據(jù)所摸索的擴(kuò)增秀麗隱桿線蟲N2株系的glb-18基因的退火溫度，確定五輪巢式PCR均為62°C)4—72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。對PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測方法與上述相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)反轉(zhuǎn)錄技術(shù)不僅能夠特異性地釣出某個(gè)剪接變體上期望長度的目的片段，并且除了目的片段外還有一些特異性的條帶也可被釣取出來。圖4和圖5分別為針對野生型秀麗隱桿線蟲N2株系glb-18基因和小鼠BDNF基因剪接變體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4中用紅線標(biāo)出的條帶為依次釣出的剪接變體，綠框標(biāo)出的條帶為呈逐步遞減規(guī)律的特異性條帶。圖5中用紅線標(biāo)出的條帶為依次釣出的剪接變體，綠框和黃框標(biāo)出的條帶為呈逐步遞減規(guī)律的特異性條帶。四、測序及序列分析針對目的條帶和特異條帶進(jìn)行凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆、挑克隆搖菌、菌液PCR鑒定、提質(zhì)粒、酶切鑒定、測序并對測序結(jié)果進(jìn)行分析(BiochemBiophysResCommun,Alentiviralvectorwithnovelmultiplecloningsites:stabletransgeneexpressioninvitroandinvivo,2008,371(3):546-50;ShengWuGongChengXueBao,CloningandsequenceanalysisofS0CS-2geneinpig,2007，23(6):1091-6)后，確定是已知剪接變體或新的剪接變體。針對測序結(jié)果，利用生物信息學(xué)軟件分析后，發(fā)現(xiàn)其中對應(yīng)于野生型秀麗隱桿線蟲N2株系glb-18基因和小鼠BDNF基因(綠框中的特異條帶)的特異條帶即分別為對應(yīng)基因的新的剪接變體。其中，野生型秀麗隱桿線蟲N2株系glb-18基因的新的剪接變體的核苷酸序列如序列表中序列8所示，小鼠BDNF基因的新的剪接變體的核苷酸序列如序列表中序列9所示。五、提交序列針對新的剪接變體，用kquin軟件將序列整理為GenBank格式，提交給NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫。經(jīng)kquin軟件處理后的兩個(gè)新的剪接變體的GenBank提交格式如下1、野生型秀麗隱桿線蟲N2株系glb-18基因的新的剪接變體LOCUSDEFINITIONACCESSIONVERSIONKEYWORDSSOURCEORGANISMREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALFEATURESsourccgeneCel_Globin-18_tv2,226bpmRNAlinearINV30-JUN-2010Analternativesplicingisformoftheglobin—18geneinC.elegans.CaenorhabditiselegansCaenorhabditiselegansEukaryota；Metazoa；Nematoda；Chromadorea；Rhabditida；Khabditoidea；Rhabditidae；Peloderinae;Caenorhabditis.1(bases1to226)Yan,R.andZhang,C.Identificationofanalternativesplicingisoformoftheglobin-18geneinC.elegansUnpublished2(bases1to226)Yan,R.andZhang,C.DirectSubmissionSubmitted(30-JUN-2010)DepartmentofNeurobiology,BeijingInstituteofRadiationMedicine,TaipingRoad27,Beijing,Beijing100850,ChinaLocation/Qualifiers1.·226/organism=//Caenorhabditiselegans"/mol_type="mRNA"/strain=〃BristolN2〃/chromosome="I"<1.·>226/locus_tag=〃F52A8.4〃/note=〃GLoBin〃11CDS<1.·>226/locus_tag=//F52A8./inference=//similartoRNAsequence:INSD:CB387152·1"/codon—start=3/product二〃GLoBinfamilymember(glb-18)〃/translation^AVCCSSTCIQYALKFVQTLAQWKNIYffiffiRTESFLYMVGQKHVKFADRGFKHEYTOIFQDAMEFALEHRLSIMT〃BASECOUNT65a43c47g71tORIGIN丄ttgccgtctgctgctcgtcaacttgtatccaatatgctctcaaatttgtacagacattag61ctcaagtggtcaaaaatatttatcatatggaaaggacggaatcgtttctttacatggtcg121gacagaagcatgtaaaatttgcggatcgaggtttcaagcatgaatattgggatattttcc181aggacgctatggaatttgcattagaacaccgtctctccattatgacIl2、小鼠BDNF基因的新的剪接變體LOCUSDEFINITIONACCESSIONVERSIONKEYWORDSSOURCEORGANISMREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALFEATURESMmu_bdnf_tv5,305bpmRNAlinearROD01-JUL-2010PartialcDNAsequenceofthebrain-derivedneurotrophicfactor(BDNF)geneofthemusmusculusstrainBALB/C.Musmusculus(housemouse)MusmusculusEukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Euteleostomi；Mammalia;Eutheria；Euarchontoglires；Glires；Rodentia;Sciurognathi；Muroidea;Muridae；Murinae；Mus.1(bases1to305)Zhang,Y.andZhang,C.Analternativesplicingisoformofthemousebrain-derivedneurotrophicfactor(bdnf)geneUnpublished2(bases1to305)Zhang,Y.andZhang,C.DirectSubmissionSubmitted(01-JUL-2010)DepartmentofNeurobiology,BeijingInstituteofRadiationMedicine,TaipingRoad27,Beijing,Beijing100850，ChinaLocation/Qualifierssource1..305/organism=//Musmusculus"/mol_type=〃mRNA"/strain^BALB/C"gene<1..>305/gene=〃BDM^/note=〃brain—derivedneurotrophicfactor^CDS<178..>303/gene="BDNF"/note=〃Thisisoformisencodedbytranscriptvariant5ofbrain-derivedneurotrophicfactor〃/codon_start=l/product=//brain-derivedneurotrophicfactorfamilymemberΛ/translation=〃MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEVNVHGQGNMAYPGVRTHGT〃BASECOUNT68a74c93g70tORIGIN1tcgaggttcggctcacaccgagatcggggctggagagagagtcagattttggagcggagc61gtttggagagcgagccccagtttggtcccctcattgagctcgctgaagttggcttcctag121cggtgtaggctggaatagactcttggcaagctccggttccaccaggtgagaagagtgatg丄8丄accatccttttccttactatggttatttcatacttcggttgcatgaaggcggcgcccatg241aaagaagtaaacgtccacggacaaggcaacatggcctacccaggtgtgcggacccatggg301actca權(quán)利要求1.用于挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的基因特異引物(GSP)，是在待鑒定基因的已知剪接變體的全長cDNA序列范圍內(nèi)尋找可能的候選引物區(qū)域，并以DNA雜交探針兼容反轉(zhuǎn)錄引物的形式設(shè)計(jì)出3’GSP，然后將設(shè)計(jì)好的3’GSP直接用于反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR反應(yīng)，用以挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定基因的可變剪接變體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因特異引物(GSP)，其特征在于所述基因特異引物(GSP)的設(shè)計(jì)由I^rimerf程序自動完成，程序設(shè)計(jì)主要思路如下1)從NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中獲取某一基因剪接變體的序列，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫記錄或使用splign、gmap、blat、blast等軟件解析其基因結(jié)構(gòu)；2)在全長cDNA序列范圍內(nèi)尋找可能的候選引物區(qū)域；3)為候選引物打分，由三個(gè)部分組成，即S=Sbasic+Send+Sgenomea)引物質(zhì)量基本分?jǐn)?shù)(Sbasic)按照常規(guī)引物質(zhì)量評估體系打分，即引物長度182^p、GC含量約50%、Tm約58°C，與這些參數(shù)越接近的引物打分越高；b)引物與基因兩端距離分?jǐn)?shù)(Smd)按照GSP的要求，即越靠近兩端打分越高，針對5，GSP和3，GSP分別打分；c)全基因組引物特異性控制分?jǐn)?shù)(SgmraJ從熱力學(xué)的角度全基因組掃描可能的引物靶定位點(diǎn)，位點(diǎn)越少(除靶基因之外)打分越高；4)按照打分情況排序候選引物，并取打分最高的前5條引物(備選)作為用于挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的引物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因特異引物(GSP)，其特征在于所述步驟4)中通常提供前5條引物備選，如果經(jīng)過篩選之后，不能獲得5條備選引物，那么則根據(jù)實(shí)際情況降低引物篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇前1-4條引物作為備選即可；針對野生型秀麗隱桿線蟲N2株系的glb-18基因的已知剪接變體設(shè)計(jì)的5’GSP1具有序列表中序列1的核苷酸序列，3’GSP1具有序列表中序列2的核苷酸序列，3’GSP2具有序列表中序列3的核苷酸序列，3’GSP3具有序列表中序列4的核苷酸序列；針對小鼠BDNF基因的已知剪接變體設(shè)計(jì)的5’GSP5具有序列表中序列5的核苷酸序列，5’GSP6具有序列表中序列6的核苷酸序列，3’GSP4具有序列表中序列7的核苷酸序列。4.一種利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法，其特征在于該方法利用了巢式PCR結(jié)合權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述基因特異引物(GSP)的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，是由不同豐度基因的基因特異引物(GSP)直接參與反轉(zhuǎn)錄，繼而進(jìn)行巢式PCR的方法。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)基于3’GSPl的反轉(zhuǎn)錄PCR;2)利用梯度PCR尋找每個(gè)基因每對引物組合的最佳退火溫度；3)基于GSP的巢式PCR；4)測序；5)基于生物信息學(xué)的序列結(jié)果分析，判定是否為新的剪接變體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟1)中基于3’GSP1的20μ1反轉(zhuǎn)錄體系及反轉(zhuǎn)錄方法為(1).總RNA1μg，對應(yīng)基因10pmol/L3’GSPl1μ1，RNaseFreeH2O補(bǔ)齊至12μ1，混勻后，65°C5min，然后立即置于冰上；(2).5XRTbuffer4μ1,dNTPMixture2μ1，RNaseinhibitor1μ1，反轉(zhuǎn)錄酶1μ1；將(1)和(2)中溶液混勻后按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄先30°ClOmin，然后40°C40min，再85°C5min，最后4°C停止。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟2)中梯度PCR的12.5μ1反應(yīng)體系為:ddH209.187μ1，IOXExTaqbuffer1.25μl，dNTPMixture1·0μl，ExTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板(即步驟1)的RT-PCR產(chǎn)物)0.5μ1；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min；然后95°C4—不同梯度退火溫度(梯度依次為55°C、55.5°C、56.8°C、58.8°C>60°C>61.1°C>62°C>63.3°C>65.7°C>67.9°C)各45s—72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。9.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的方法，其特征在于所述步驟幻中針對野生型秀麗隱桿線蟲隊(duì)株系的glb-18基因的巢式PCR共分三輪進(jìn)行，反應(yīng)體系為12.5μ1，包括ddH209.187μ1，IOXExTaqbuffer1.25μl，dNTPMixture1.0μl，ExTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板0.5μ1；第一輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上、下游引物分別為5’GSP1和3’GSP1；第二輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第一輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP1和3’GSP2；第三輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第二輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP1和3’GSP3；反應(yīng)條件為先95°C預(yù)變性5min；然后95°C4—最佳退火溫度(三輪均為60°C)4—72°Clmin,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。10.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的方法，其特征在于所述步驟3)中針對小鼠BDNF基因的巢式PCR共分五輪進(jìn)行，反應(yīng)體系為12.5μ1，包括ddH209.187μ1，IOXExTaqbuffer1.25μ1，dNTPMixture1.0μ1,ExTaq0.063μ1，上、下游引物各0.25μ1，模板0.5μ1；第一輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP2；第二輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第一輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP3；第三輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第二輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP4和3’GSP4；第四輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第三輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5’GSP5和3’GSP4;第五輪巢式PCR反應(yīng)體系中，模板為第四輪巢式PCR產(chǎn)物稀釋10倍后的溶液，上、下游引物分別為5，GSP6和3，GSP4；反應(yīng)條件為先95°C預(yù)變性5min；然后95°C45s—最佳退火溫度(五輪均為62°C)45s—72°Clmin，共；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min；最后4°C停止。11.權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)所述方法在真核生物不同生理病理狀態(tài)下低豐度表達(dá)基因的挖掘，及其高、低豐度表達(dá)基因剪接變體的鑒定和發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用，其特征在于除了靶定基因已知的剪接變體外，所述方法更可用于基因未知剪接變體的挖掘。12.在權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)所述方法中使用或得到的新物質(zhì)，其特征在于所述新物質(zhì)包括新的剪接變體。13.根據(jù)權(quán)利要求14所述的新物質(zhì)，其特征在于所述野生型線蟲隊(duì)株系glb-18基因的新的剪接變體的核苷酸序列如序列表中序列8所示，小鼠BDNF基因的新的剪接變體的核苷酸序列如序列表中序列9所示。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用巢式PCR結(jié)合基因特異引物(GSP)反轉(zhuǎn)錄技術(shù)挖掘低豐度表達(dá)基因和系統(tǒng)鑒定剪接變體的方法與應(yīng)用。該方法基于3’GSP1的反轉(zhuǎn)錄PCR，利用梯度PCR尋找每個(gè)基因每對引物組合的最佳退火溫度，基于GSP的巢式PCR測序并基于序列分析判定是否為新的剪接變體。本方法簡便易行、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、可靠性強(qiáng)，并且極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，可應(yīng)用于不同生理病理狀態(tài)下真核生物低豐度表達(dá)基因的挖掘和高、低豐度表達(dá)基因剪接變體的鑒定及發(fā)現(xiàn)中，可用于挖掘低豐度表達(dá)基因和鑒定與發(fā)現(xiàn)高表達(dá)基因及低豐度表達(dá)基因的剪接變體，除了靶定基因已知的剪接變體外，更可用于基因未知剪接變體的發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用前景廣闊。文檔編號C12N15/11GK102260670SQ20111019502公開日2011年11月30日申請日期2011年7月12日優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日發(fā)明者嚴(yán)瑞芬,吳永紅,屈武斌,張成崗,張艷春,高艷申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所