專利名稱：鑒定Monilia polystroma的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定Monilia polystroma的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
褐腐病(Brown Rot)是核果及仁果生產(chǎn)及貯藏期重要的病害。2001年，美國南部的喬治亞州褐腐病大面積發(fā)生，給桃產(chǎn)業(yè)帶來直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)430萬美元，購買殺菌劑帶來間接經(jīng)濟(jì)損失為150萬美元。在我國，一些地區(qū)發(fā)病率可達(dá)20 %，嚴(yán)重時發(fā)病率達(dá)100 %， 嚴(yán)重影響果實的食用價值和果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入。褐腐病主要是由子囊菌門(Ascomycete)，盤菌綱(Discomycete)，柔膜菌目 (Helotiales)，核盤菌科(Sclerotiniaceae)，鏈核盤菌屬(Monilinia)的三種病原
菌---Monilinia fructicola、M. fructigena、M. Iaxa 所弓|起的。2002 年，van Leewen 根
據(jù)形態(tài)特征及ITS序列差異將來自日本的M. fructigena菌株區(qū)分出來，命名為Monilia Polystroma0M. polystroma主要發(fā)生在日本，但目前已經(jīng)報道從匈牙利和我國發(fā)現(xiàn)了該菌。 因此，Mpolystroma是重要的檢疫對象。M. polystroma主要侵染蘋果等仁果類植物及其果實，在我國報道的菌株來自與日本毗鄰的黑龍江省，并且該菌分離自核果類的李子，至于該菌在不同寄主及地區(qū)的發(fā)生和分布情況仍不清楚，M. polystroma的危害性還有待深入研究。蘋果是我國重要的進(jìn)出口果品，隨著各國果品貿(mào)易的不斷加強(qiáng)，M. polystroma傳播擴(kuò)散的風(fēng)險不斷加大。因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對Mpolystroma的檢疫工作。四種褐腐病菌的的形態(tài)特征非常相似，缺少經(jīng)驗時很難準(zhǔn)確判斷。近年發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)也在褐腐病菌的種類鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。針對M. polystroma的分子檢測中，Cote (2004) (Cote, 2004, Mycologia，96 =240-248)根據(jù)隨機(jī)引物多態(tài)性設(shè)計了鑒定M. polystroma的引物，但是當(dāng)我們用這些引物進(jìn)行測試時，發(fā)現(xiàn)它們往往不能正常工作(樊錦燕等，2007)(樊錦燕等，2007，植物保護(hù)學(xué)報，34:289-295)。截至目前，沒有可用于準(zhǔn)確鑒定Monilia polystroma的分子方法。因此，應(yīng)當(dāng)針對來自世界多個國家和地區(qū)的褐腐病菌，開發(fā)具有穩(wěn)定特異性用于鑒定Monilia polystroma的引物，建立準(zhǔn)確的分子鑒定方法，為國際貿(mào)易中蘋果等果品的快速通關(guān)提供有力的技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的引物對。本發(fā)明所提供的用于鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的引物對，由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段組成。本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的方法。本發(fā)明所提供的鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的方法，包括以下步驟
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以待鑒定真菌菌株的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述待鑒定真菌菌株為和/或候選為Monilia polystroma。所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠上顯示為700bp-800bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為和 / 或候選為 Monilia polystroma。 所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為測序檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述待鑒定真菌菌株為和/或候選為Monilia polystroma。本發(fā)明的又一個目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定褐腐病致病菌的方法。本發(fā)明所提供的鑒定和/或輔助鑒定褐腐病致病菌的方法，包括以下步驟從發(fā)生褐腐病的植物組織中分離得到待鑒定真菌菌株，以待鑒定真菌菌株的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測所述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述褐腐病的致病菌包含和/或候選包含 Monilia polystroma。所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠上顯示為700bp-800bp的條帶，則確定所述褐腐病的致病菌候包含和/或侯選包含Monilia polystroma。所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為測序檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述褐腐病的致病菌包含和/或候選包含Monilia polystroma。本發(fā)明的又一個目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的試劑盒。本發(fā)明所提供的鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的試劑盒，含有由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段組成的引物對。本發(fā)明的又一個目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定褐腐病致病菌的試劑盒。本發(fā)明所提供的鑒定和/或輔助鑒定褐腐病致病菌的試劑盒，含有由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段組成的引物對。所述引物對或所述試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma或褐腐病致病菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供的引物和方法能快速、準(zhǔn)確鑒定Monilia polystroma。本發(fā)明的鑒定方法是利用核果及仁果上褐腐病菌的漆酶基因lcc2具有種內(nèi)保守、種間變異的特點(diǎn)， 根據(jù)序列差異較大的區(qū)段設(shè)計引物進(jìn)行鑒定。已經(jīng)對來自中國、美國、法國、新西蘭、英國、意大利、日本等多個國家已知的4種仁果及核果褐腐病菌即Monilinia fructicola, M. fructigena.M. laxa.M. polystroma及其近似種進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示該引物具有很強(qiáng)的特異性。應(yīng)用本發(fā)明，提取褐腐病菌的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，整個過程可在5小時內(nèi)完成。


圖1為褐腐病菌Monilia polystroma的特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。
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圖2為應(yīng)用本發(fā)明的特異性引物檢測褐腐病致病菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、用特異性引物鑒定Monilia polystroma選用菌株美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)(購自荷蘭菌種保藏中心 CBS167. 24, http//www. cbs. knaw. nl/)、核果褐腐病菌(Monilinia laxa)(購自荷蘭菌種保藏中心 CBS489. 50，http//www. cbs. knaw. nl/)、仁果褐腐病菌(Monilinia fructigena)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是I00S&Frey， 2000, European Journal of Plant Pathology 106 :373-378) > Monilia polystroma(購自荷蘭菌種保藏中心 CBS102686, http //www. cbs. knaw. nl/)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Jiang，J et al., 2009. Molecular characterization of field azoxystrobin-resistant isolates of Botrytis cinerea. Pesticide Biochemistry and Physiology 93 :72-76)、菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Liu Xin et al. Pesticide Biochemistry and Physiology, 95,106-112)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)(張榮等，2009，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，42 (9) :32M_3229)、蘋果腐爛病菌(Valsa sp.)(購自中國農(nóng)業(yè)微生物保藏管理中心ACCC30052)以及Neofusicocum ribis (購自荷蘭菌種保藏中心 CBSl 18822 (http://www. cbs. knaw. nl/)。一、提取不同菌株的基因組DNA從培養(yǎng)基表面刮菌絲，約25mg，放到2ml凍存管中，加入500 μ 1抽提緩沖液，置于 DNA提取儀i^astft·印中，設(shè)置速度為5，時間為40秒；取出混合液，加入50 μ 110% SDS, 37°C水浴Ih ；加入75 μ 1 5Μ NaCl，將混合液輕輕混勻；加入65 μ 1 CTAB/NaCl溶液，充分混勻后于65°C水浴20min;加入等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)，充分混勻后， 10，OOOrpm離心12min ；將上清轉(zhuǎn)移至另一印pendorf管中，加0. 6倍體積的冷異丙醇，顛倒混勻，然后10，OOOrpm離心12min，去上清；加入500 μ 1 70%乙醇，顛倒數(shù)次；10, OOOrpm 離心12min，去上清；用冷凍濃縮儀將沉淀抽干，沉淀溶于100 μ ITE中(含100 μ g/ml RNase)，-20°C保存?zhèn)溆?。二、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)1、合成引物根據(jù)Monilia polystroma的laccase2 (lcc2)基因序列的特異性，設(shè)計了對 M. polystroma具有特異性的一對PCR引物，PCR引物的序列為GPlaF :5，-CCACTTCCAACATCACTC-3，(序列表中序列 1)，PlaR :5，-CCCAGATTTCAAAAGCGGATTC-3，(序列表中序列 2)。上述引物序列由賽百盛公司合成。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)以上述步驟一得到的不同菌株的基因組DNA為模板，用GPlaF/PlaR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均包括一個陰性對照(即用ddH20代替DNA模板)。PCR反應(yīng)體系組成總體積25μ 1，包括2. 5μ 1 10XPCR Buffer (購自北京盛旭百川公司)，200ymol/L dNTPs，引物 GPlaF 和引物 PlaR 各 0. 2 μ mol/L，IU Taq DNA 聚合酶， IOng 模板 DNA, (MH2O 補(bǔ)足 25 μ L·PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3分鐘，95°C變性30秒，64°C退火30秒，72°C延伸1 分鐘，共30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。3、對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測將上述步驟2得到的不同菌株的PCR產(chǎn)物5 μ 1用1. 4%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用溴化乙錠(EB)染色后拍照。電泳檢測結(jié)果如圖1所示，圖1中，泳道1為11Λ DNA分子量梯度，泳道2為陰性對照，泳道3為Moni 1 ia polystroma ；泳道4為美澳型核果褐腐病菌(Moni 1 inia fructicola)；泳道5為仁果褐腐病菌(Monilinia fructigena)；泳道6為核果褐腐病菌(Monilinia laxa)菌株；泳道7為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)；泳道8為菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)；泳道 9 為蘋果炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)； 泳道10為蘋果腐爛病菌(Valsa sp.)；泳道11為Neofusicocum ribi。從圖1可見，泳道3M0nilia polystroma的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯色后，在瓊脂糖凝膠上顯示為 700bp-800bp (實際上是750bp)的條帶，其它真菌和陰性對照的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳顯色后瓊脂糖凝膠上均未出現(xiàn)該大小的DNA條帶。此結(jié)果說明該引物對對Moni 1 ia polystroma 具有特異性，該鑒定方法準(zhǔn)確可靠。4、對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序檢測分別將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示=Monilia polystroma 的擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，其它真菌和陰性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物未得到750bp的片段。此結(jié)果說明該鑒定方法準(zhǔn)確可靠。實施例2、鑒定褐腐病致病菌供試菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株選擇四種褐腐病菌作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中，美澳型核果褐腐病菌 (Monilinia fructicola)、核果褐腐病菌(Monilinia laxa)、仁果褐腐病菌(Monilinia fructigena)禾口 Monilia polystroma 的來源見表 1。測試菌株將以下編號的菌株作為測試菌株(表1) =ASTU JX3-1、ABC8、LBD10、 BMQ-3、YNl-7、BMS-4、YYHl2、CLP6-1、CLA6-1、LS 13、MZ6、SL4、MW7-1、SS3 和 SXP-1。表1本實施例中所用菌株及其來源
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的引物對，由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段組成。
2.一種鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的方法，包括以下步驟以待鑒定真菌菌株的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述待鑒定真菌為和/或候選為Monilia polystroma。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的方法，其特征在于所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠上顯示為700bp-800bp的條帶，則確定所述待鑒定真菌菌株為和/或候選為 Monilia polystroma。
4.根據(jù)權(quán)利2所述的方法，其特征在于所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為測序檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述待鑒定真菌菌株為和/或候選為Monilia polystroma。
5.一種鑒定和/或輔助鑒定褐腐病菌的方法，包括以下步驟從發(fā)生褐腐病的植物組織中分離得到待鑒定真菌菌株，以待鑒定真菌菌株的基因組 DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測所述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述褐腐病菌包含和/或候選包含 Monilia polystroma。
6.根據(jù)權(quán)利5所述的方法，其特征在于所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠上顯示為700bp-800bp的條帶，則確定所述褐腐病菌候包含和/或侯選包含 Monilia polystroma。
7.根據(jù)權(quán)利5所述的方法，其特征在于所述檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為測序檢測所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp的片段，則確定所述褐腐病菌包含和/或候選包含Monilia polystroma。
8.一種鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma的試劑盒，含有由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段組成的引物對。
9.一種鑒定和/或輔助鑒定褐腐病菌的試劑盒，含有由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段組成的引物對。
10.權(quán)利要求1所述的引物對、權(quán)利要求8所述試劑盒或權(quán)利要求9所述試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定Monilia polystroma或褐腐病菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒定Monilia polystroma的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的用于鑒定M.polystroma的引物對，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成。本發(fā)明提供的引物和方法能快速、準(zhǔn)確鑒定M.polystroma。已經(jīng)對4種仁果及核果褐腐病菌即Monilinia fructicola、Monilinia fructigena、Monilinia laxa、M.polystroma及其近似種進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示該引物具有很強(qiáng)的特異性。應(yīng)用本發(fā)明，提取褐腐病菌的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，整個過程可在5小時內(nèi)完成。
文檔編號C12Q1/68GK102242214SQ20111019543
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者國立耘, 朱小瓊 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)