專利名稱：家蠅抗藥性檢測(cè)試劑盒及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種家蠅抗藥性檢測(cè)試劑盒及其專用引物。
背景技術(shù)：
家蠅(Musca domestica)是許多疾病的潛在媒介，是65種以上人或動(dòng)物胃腸疾病的機(jī)械傳媒，如痢疾，胃腸炎，傷寒，肺結(jié)核等。滅蠅雖然強(qiáng)調(diào)以環(huán)境治理為主，但噴灑化學(xué)殺蟲劑仍然是常用的方法，特別在垃圾集散地，如生活小區(qū)或菜市場(chǎng)的垃圾箱、垃圾清潔站，各區(qū)垃圾中轉(zhuǎn)站及大中型垃圾填埋場(chǎng)等地方，用空間或滯留噴灑復(fù)配及混配的擬除蟲菊酯類殺蟲劑來控制蠅類密度。由于廣泛使用相對(duì)單一的化學(xué)藥物防制，用藥頻繁，而家蠅生活世代又較短，因此，近年來家蠅抗藥性問題日漸突出，引起廣泛關(guān)注。研究表明家蠅對(duì)氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯等均產(chǎn)生了不同程度抗性。昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性主要是擊倒抗性(knockdown resistance, kdr)，kdr基因在家蠅對(duì)擬除蟲菊酯的抗性中具有重要作用。擬除蟲菊酯的作用靶標(biāo)主要是昆蟲電壓依賴性神經(jīng)細(xì)胞膜上的鈉離子通道，離子通道上的作用靶點(diǎn)對(duì)殺蟲劑降低了敏感性而產(chǎn)生擊倒抗性，因此擊倒抗性不同于代謝抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制劑所降低。通過比較敏感、抗性及高抗性家蠅的部分及全部鈉通道序列，發(fā)現(xiàn)para型鈉通道Vsscl基因的L1014F (亮氨酸到苯丙氨酸)即CTT — TTT的突變及M918T(甲硫氨酸到絲氨酸)即ATG —ACG和擊倒抗性相關(guān)。我國(guó)也多次報(bào)道在多省市的野外家蠅擬除蟲菊酯抗性個(gè)體中發(fā)現(xiàn)L1014F的突變。kdr基因可以作為昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的一個(gè)分子標(biāo)記，通過監(jiān)測(cè)kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結(jié)構(gòu)中的狀態(tài)。Huang等(2004)用特異性等位基因PCR方法，對(duì)采自丹麥農(nóng)場(chǎng)的14個(gè)家蠅野外種群進(jìn)行kdr基因頻率的檢測(cè)，在所有種群中均檢測(cè)到kdr純合子及雜合子，且kdr頻率與一定劑量的除蟲菊素或生物芐呋菊酯(均加ΡΒ0)作用下的存活個(gè)體比率呈正相關(guān)。曹曉梅等(2005)用特異性等位基因PCR 法檢測(cè)了北京、天津、張家口共17個(gè)野外種群家蠅個(gè)體kdr等位基因型，顯示家蠅野外種群的kdr基因頻率在8% 56%之間，并且發(fā)現(xiàn)LD5tl為代表的溴氰菊酯抗性與家蠅kdr等位基因頻率之間存在正相關(guān)關(guān)系。研究說明Kdr基因可以作為家蠅對(duì)擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的一個(gè)分子標(biāo)記，通過監(jiān)測(cè)kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結(jié)構(gòu)中的狀態(tài)，可以預(yù)測(cè)抗性的發(fā)生和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的引物。本發(fā)明提供的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分別為
4序列表中序列2和序列表中序列4。所述引物組A還包括引物1，所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。所述引物組A和所述引物組B為獨(dú)立包裝；所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質(zhì)量比為1 2 1;所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質(zhì)量比為1 2 1;所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的PCR試劑。本發(fā)明提供的試劑，由試劑A和試劑B組成；所述試劑A由所述引物組A和PCR緩沖液組成；所述試劑B由所述引物組B和PCR緩沖液組成；所述各引物組中各引物在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的濃度均為0. 4uM。所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。PCR緩沖液為試劑T，購(gòu)自寶生物工程有限公司，產(chǎn)品號(hào)DR011。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種制備檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)分別將所述的引物中的所述引物組A和所述引物組B進(jìn)行獨(dú)立包裝，得到獨(dú)立包裝引物組A和獨(dú)立包裝引物組B ；2)再將步驟1)得到的獨(dú)立包裝引物組A和步驟1)得到的獨(dú)立包裝引物組B進(jìn)行包裝，得到的試劑。所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。由所述方法制備得到的試劑也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，為如下1)或2)1)所示的試劑盒由試劑盒A和試劑盒B組成；所述試劑盒A為含有所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒；所述試劑盒B為含有所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有所述的試劑的試劑盒。所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。所述引物或所述試劑或所述試劑盒在檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)、檢測(cè)家蠅抗藥性或制備檢測(cè)家蠅抗藥性產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述突變位點(diǎn)為 L1014F，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對(duì)A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對(duì)B分別對(duì)待測(cè)家蠅進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 檢測(cè)各組引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，
若所述引物對(duì)B擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，則所述待測(cè)家蠅的kdr基因的突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F ；所述257bp產(chǎn)物1的核苷酸序列為序列表中的序列6所述257bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列7。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)家蠅中kdr基因型的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對(duì)A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對(duì)B分別對(duì)待測(cè)家蠅進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)各組引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，若所述引物對(duì)B擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，且所述引物對(duì)A未擴(kuò)增得到大小為 257bp產(chǎn)物1，則所述kdr基因?yàn)楹型蛔兾稽c(diǎn)L1014F的純合型基因；若所述引物對(duì)B擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，且所述引物對(duì)A擴(kuò)增得到大小為 257bp產(chǎn)物1，則所述kdr基因?yàn)楹型蛔兾稽c(diǎn)L1014F的雜合型基因；若所述引物對(duì)B未擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，且所述引物對(duì)A擴(kuò)增得到大小為 257bp產(chǎn)物1，則所述待測(cè)家蠅的kdr基因?yàn)椴缓蛔兾稽c(diǎn)L1014F的純合型基因；所述257bp產(chǎn)物1的核苷酸序列為序列表中的序列6所述257bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述PCR擴(kuò)增中，以待測(cè)家蠅的基因組DNA為模板；所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為62-65°C，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為65°C ；所述檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測(cè)序。以上PCR擴(kuò)增中，所述引物組A或B中的引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增大小為381bp產(chǎn)物；所述381bp產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；該產(chǎn)物可以用來檢測(cè)PCR反應(yīng)體系是否正確，如果有381bp產(chǎn)物，說明該體系正確。目前我國(guó)還沒有成型的針對(duì)家蠅的kdr抗性分子檢測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明旨在研制開發(fā)一種快捷、簡(jiǎn)便、靈敏的抗性基因檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，能夠?qū)蚁塳dr抗性基因型進(jìn)行快速偵別。技術(shù)原理在家蠅Kdr基因突變的基礎(chǔ)上，以突變位點(diǎn)的堿基為3'末端，設(shè)計(jì)兩條特異性內(nèi)引物(突變型和非突變型)，分別只能與突變的靶DNA及非突變的靶DNA結(jié)合。 同時(shí)，在突變堿基上下游處設(shè)計(jì)兩條非特異性外引物，利用Taq酶缺乏3' -5'外切酶活性的特點(diǎn)，在以突變型引物擴(kuò)增正常DNA模板時(shí)，延伸反應(yīng)會(huì)因磷酸酯鍵難于形成而不能進(jìn)行，也就得不到特異長(zhǎng)度的條帶，從而表明模板DNA無此突變。反之，表明有突變產(chǎn)生。 將突變型和非突變型引物分別用于同一 DNA模板的擴(kuò)增，判斷有無特定位點(diǎn)基因的特定突變。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的了一種快捷、簡(jiǎn)便、靈敏的家蠅抗藥性檢測(cè)試劑盒，用來掌握家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性狀況。本發(fā)明的抗藥性檢測(cè)試劑盒針對(duì)家蠅kdr與抗性相關(guān)的基因型，分別設(shè)計(jì)了 2組特異性引物，經(jīng)過一定的配比合成，可以檢測(cè)家蠅的kdr基因型。采用本發(fā)明的抗藥性檢測(cè)試劑盒，只需提取單只家蠅的DNA，因此對(duì)待測(cè)家蠅的數(shù)量沒有特殊的要求，另外還無需家蠅的飼養(yǎng)場(chǎng)所和設(shè)施，也不需要投入長(zhǎng)時(shí)間的人力物力來觀察。獨(dú)立1人2小時(shí)內(nèi)即可完成50份樣本的檢驗(yàn)，被檢樣本能夠準(zhǔn)確、有效、直接地檢測(cè)出點(diǎn)突變，不僅能夠區(qū)分抗性個(gè)體和敏感個(gè)體，而且能夠鑒定個(gè)體基因型。 判斷kdr相關(guān)的基因型為研究家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性奠定基礎(chǔ)。


圖1為特異性等位基因PCR法方法檢測(cè)家蠅Kdr基因敏感純合子(SS)、抗性雜合子(RS)及抗性純合子(RR)個(gè)體
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、家蠅抗藥性檢測(cè)一、PCR 擴(kuò)增1、引物的設(shè)計(jì)針對(duì)家蠅與除蟲菊酯類殺蟲劑抗藥相關(guān)的kdr(未突變，GenBank序列號(hào) AY309437)基因設(shè)計(jì)特異性引物，其⑶1和⑶2為對(duì)照擴(kuò)增引物；⑶2和⑶3、⑶4和⑶3均為特異擴(kuò)增引物；CDl 5 ‘-GAATTTCACCGACTTCATGCAC-3，(序列 1，下游引物)CD2 5 ‘-AGCAATACGATTGAAGGCCTC-3，(序列 2，上游引物)CD3 5 ‘-ACGGTCGTGATCGGCAATC-3，(序列 3，下游引物)根據(jù)kdr的突變體kdr L1014F型突變基因(序列8)設(shè)計(jì)的特異性引物CDl 5 ‘-GAATTTCACCGACTTCATGCAC-3，(序列 1，下游引物)CD2 5 ‘-AGCAATACGATTGAAGGCCTC-3，(序列 2，上游引物)CD4 5 ‘-ACGGTCGTGATCGGCAATT-3，(序列 4，下游引物)2、基因組DNA獲得分別提取野外捕獲的編號(hào)為BJ01-BJ100的100只家蠅的基因組DNA，具體如下(1)分別取單只家蠅在 300 μ 1 DNA 裂解緩沖液(IOOmM Tris-HCl, pH8. 0 ；50mM NaCl ；50mMEDTA ；1% SDS ；0. 15mM精胺；0. 5mM亞精胺)中用玻棒勻漿，加入2. 5 μ 1蛋白酶 K溶液，56 °C水浴過夜。(2)加飽合酚300 μ 1，氯仿-異戊醇(24 1) 300 μ 1，將離心管上下顛倒數(shù)次，混勻后在超速離心機(jī)中10，000rpm/min，4°C離心lOmin。(3)抽提上層水相，移入新的離心管中，加入0. 2體積的IOM乙酸銨溶液和2倍體積的無水乙醇。-20°C冷凍2小時(shí)。(4)取出離心12，000r/min，4°C，5min，用真空泵將無水乙醇抽干。(5)用75%冷乙醇洗滌沉淀，12，OOOr/min，4°C，lOmin，重復(fù)該步驟一次。(6)用真空泵將乙醇抽干，將DNA留于管中晾干。(7)加入50 μ 1雙蒸滅菌水，_20°C保存?zhèn)溆?，得到編?hào)為BJD01-BJDlOO的待測(cè)樣本的DNA。3、待測(cè)樣本的DNA的PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增體系如表1)(1)分別取12. 5uL試劑T (寶生物工程有限公司，產(chǎn)品號(hào)DROl 1)加入到2個(gè)PCR
7管中，標(biāo)記為A管和B管。(2)在A管中加入IuL試劑P1，在B管中加入IuL試劑P2。(3)取10. 5uL去離子水至A管和B管中(多個(gè)樣本檢測(cè)時(shí)，根據(jù)以上的配比，分A 管和B管將試劑混合后分裝，效果更好)。(4)分別取IuL DNA加入到A管和B管中。(5)將以上的A管和B管中所有成分混合均勻后，放入PCR儀中，按以下條件設(shè)置反應(yīng)條件(為了使試劑混勻，稍微離心效果更好)。
1 2
如下

表1為PCR擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于所述引物組A還包括引物1，所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物，其特征在于 所述引物組A和所述引物組B為獨(dú)立包裝；所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質(zhì)量比為1 2 1; 所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質(zhì)量比為1 2 1; 所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。
4.一種檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的PCR試劑，由試劑A和試劑B組成； 所述試劑A由所述引物組A和PCR緩沖液組成；所述試劑B由所述引物組B和PCR緩沖液組成； 所述各引物組中各引物在對(duì)應(yīng)的所述PCR試劑中的濃度均為0. 4uM ； 所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。
5.一種制備檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑的方法，包括如下步驟1)分別將權(quán)利要求1-3中任一所述的引物中的所述引物組A和所述引物組B進(jìn)行獨(dú)立包裝，得到獨(dú)立包裝引物組A和獨(dú)立包裝引物組B ；2)再將步驟1)得到的獨(dú)立包裝引物組A和步驟1)得到的獨(dú)立包裝引物組B進(jìn)行包裝，得到試劑；所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。
6.由權(quán)利要求5所述方法制備得到的試劑。
7.—種檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的試劑盒，為如下1)或2)1)所示的試劑盒由試劑盒A和試劑盒B組成；所述試劑盒A為含有權(quán)利要求4所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒； 所述試劑盒B為含有權(quán)利要求4所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有權(quán)利要求6所述的試劑的試劑盒； 所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F。
8.權(quán)利要求1-3中任一所述引物或權(quán)利要求4或6所述試劑或權(quán)利要求7所述試劑盒在檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)、檢測(cè)家蠅抗藥性或制備檢測(cè)家蠅抗藥性產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述突變位點(diǎn)為L(zhǎng)1014F，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、 Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
9.一種檢測(cè)待測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1-3中任一所述的引物或權(quán)利要求4或6所述試劑或權(quán)利要求7所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對(duì)A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對(duì)B分別對(duì)待測(cè)家蠅進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)各組引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，若所述引物對(duì)B擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，則所述待測(cè)家蠅的kdr基因的突變位點(diǎn)為 L1014F ；所述257bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列7。
10. 一種檢測(cè)待測(cè)家蠅中kdr基因型的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1-3中任一所述的引物或權(quán)利要求4或6所述試劑或權(quán)利要求7所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對(duì)A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對(duì)B分別對(duì)待測(cè)家蠅進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)各組引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，若所述引物對(duì)B擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，且所述引物對(duì)A未擴(kuò)增得到大小為 257bp產(chǎn)物1，則所述kdr基因?yàn)楹型蛔兾稽c(diǎn)L1014F的純合型基因；若所述引物對(duì)B擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，且所述引物對(duì)A擴(kuò)增得到大小為257bp 產(chǎn)物1，則所述kdr基因?yàn)楹型蛔兾稽c(diǎn)L1014F的雜合型基因；若所述引物對(duì)B未擴(kuò)增得到大小為257bp產(chǎn)物2，且所述引物對(duì)A擴(kuò)增得到大小為 257bp產(chǎn)物1，則所述待測(cè)家蠅的kdr基因?yàn)椴缓蛔兾稽c(diǎn)L1014F的純合型基因； 所述257bp產(chǎn)物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 所述257bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ； 所述PCR擴(kuò)增中，以待測(cè)家蠅的基因組DNA為模板；所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為62-65°C，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為65°C ； 所述檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測(cè)序。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠅抗藥性檢測(cè)試劑盒及其專用引物。本發(fā)明提供了檢測(cè)家蠅中kdr基因突變位點(diǎn)的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A由引物1、引物2和引物3組成，所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列1、序列表中序列2和序列表中序列3；所述引物組B由引物1、引物2和引物4組成，所述引物1、引物2和引物7的核苷酸序列分別為序列表中序列1、序列表中序列2和序列表中序列4。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的了一種快捷、簡(jiǎn)便、靈敏的家蠅抗藥性檢測(cè)試劑盒，用來掌握家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性狀況。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102242217SQ201110197109
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月14日
發(fā)明者劉美德, 張映梅, 李春曉, 汪中明, 董言德, 趙彤言, 邢丹, 郭曉霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所