專利名稱：腸出血性大腸桿菌o104:h4多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸出血性大腸桿菌0104:H4的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
2011年5月在德國爆發(fā)腸出血性大腸桿菌0104:H4病原菌導(dǎo)致的大規(guī)模疫情，致病性大腸桿菌主要分為5類，分別為腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)，致病性大腸桿菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC),腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC)禾口ilfl^t生大腸桿菌(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC)，已知常見腸出血性大腸桿菌(EHEC)血清型有3個(gè)0157、026、0111 ；不常見的血清型有40多種。最近在德國引起暴發(fā)疫情的0104:H4是EHEC家族中的一種罕見的血清型， 據(jù)研究表明這種致病菌含有志賀毒素2型(vtx2a)基因和腸積聚性黏附大腸桿菌毒力質(zhì)粒上的3個(gè)基因aatA，aggR, aap ；不含有緊密黏附素基因(eae)，而且該致病菌出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象。目前，奧地利、丹麥、德國、法國、新西蘭、挪威、瑞典、瑞士及英國均報(bào)道出現(xiàn)溶血性尿毒綜合癥病例。據(jù)美聯(lián)社發(fā)自柏林的報(bào)道，2011年6月1日止，報(bào)道發(fā)病病例3255 例，其中773人出現(xiàn)溶血性尿毒綜合癥及其他嚴(yán)重并發(fā)癥及致腎功能衰竭，已導(dǎo)致35人死亡。截止2011年5月30日，德國境內(nèi)，腸出血性大腸桿菌0104:H4感染者中61%為女性， 88%的感染者年齡在20歲以上，約88%感染者出現(xiàn)溶血性尿毒綜合癥。由此可見本次流行的病原菌腸出血性大腸桿菌0104:H4致病性較強(qiáng)，臨床癥狀明顯且嚴(yán)重，應(yīng)及時(shí)采取有效措施進(jìn)行防控。準(zhǔn)確和快速的明確病原是有效預(yù)防傳染病大面積發(fā)生和傳播的前提和基礎(chǔ)，但是目前針對(duì)腸出血性大腸桿菌0104:H4的診斷仍停留在培養(yǎng)、生化鑒定階段，分離的菌株多以血清學(xué)和普通PCR為主，仍然沒有針對(duì)腸出血性大腸桿菌0104:H4快速、準(zhǔn)確、有效的多重?zé)晒舛縋CR方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能夠?qū)δc出血性大腸桿菌0104:H4進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是腸出血性大腸桿菌0104:H4的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針由志賀樣毒素2型基因(Stx2)、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)的特異性引物和探針組成上游引物5 ‘ -CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3 ‘，下游引物5 ‘ -CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3 ‘，熒光探針5' -FAM-CGCGTTCTGTTCGCGCCGT-BHQ1 -3‘；


flicH4上游引物5' flicH4下游引物5' flicH4熒光探針5' wzx0104上游引物5' wzx0104下游引物5' wzx0104熒光探針5'
-GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3‘， -CAGAATCAACGACCGCATATT-3‘， -VIC-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ1-3‘； -AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3‘， -GGTATAACCACGGCTTTCGA-3‘， -R0X-TCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTG-BHQ2-3‘， 其中FAM、VIC和ROX為不同波長的熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)。 為達(dá)到定量檢測(cè)的效果，所述試劑盒還可包括志賀樣毒素2型基因(StU)、 抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下 ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgttcgcgccgtg aatgaagaga gtcaaccaga atgtcag ；所述 wzx 標(biāo)準(zhǔn)品序列如下aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tggggcgcaa ccttgcgctca acatcgaaag ccgtggttata cc ；Bf ^ flicH4 t示}^ 品序列如下 igctgggggt已 aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa tatgcggtcg ttgattctgo本發(fā)明還涉及所述的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒在腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種腸出血性大腸桿菌0104:H4熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括(1)提取細(xì)菌基因組DNA ；(2)以志賀樣毒素2型基因(Stx2)、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因 (flicH4)的特異性引物和探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR 反應(yīng)液，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以非靶細(xì)菌為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)細(xì)菌熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長，則判斷為陽性；若Mx2、WZx和f licH4均呈陽性，則判斷待測(cè)細(xì)菌為腸出血性大腸桿菌0104:H4 ；所述特異性引物和探針序列如下上游引物5' -CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3‘，下游引物5 ‘ -CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3 ‘，熒光探針5' -FAM-CGCGTTCTGTTCGCGCCGT-BHQ1 -3‘；flicH4 上游引物5' -GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3‘，flicH4 下游引物5' -CAGAATCAACGACCGCATATT-3‘，flicH4 熒光探針5' -VIC-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ1-3'；wzx0104 上游引物5' -AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3‘，wzx0104 下游引物5' -GGTATAACCACGGCTTTCGA-3‘，wzx0104 熒光探針5' -R0X-TCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTG-BHQ2-3‘，其中FAM、VIC和ROX為不同波長的熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)。所述PCR擴(kuò)擴(kuò)增在常規(guī)條件下進(jìn)行，本發(fā)明中PCR擴(kuò)增條件如下95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 20秒、60°C 45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后置4°C。為達(dá)到定量檢測(cè)的效果，所述方法可同時(shí)以腸出血性大腸桿菌0104:H4志賀樣毒素2型基因(Stx2)、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度的DNA溶液進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，分別根據(jù)拷貝濃度的對(duì)數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得細(xì)菌DNA的Ct值后，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待檢細(xì)菌DNA中相應(yīng)基因的拷貝濃度；所述Mx2、wzx和flicH4標(biāo)準(zhǔn)品序列如前所述。本發(fā)明針對(duì)腸出血性大腸桿菌0104:H4提供了一種快速、準(zhǔn)確、有效的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，為及時(shí)采取有效措施對(duì)腸出血性大腸桿菌0104:H4病原菌導(dǎo)致的大規(guī)模疫情進(jìn)行防控提供了基礎(chǔ)。


圖1標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，1 5分別為ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2、IO1Copies/ μ L標(biāo)準(zhǔn)品；圖2為標(biāo)準(zhǔn)曲線；a為基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = _3. 282Χ lgX+39. 297, b 為wzx0104基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = -3. 344Χ lgX+38. 373，c為flicH4基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Y =-3. 275Χ lgX+39. 662 ；Y 對(duì)應(yīng)的CT值；X 基因的copies ；圖3為雙盲陽性質(zhì)粒DNA檢測(cè)結(jié)果；1和2 Jtx2基因質(zhì)粒DNA，CT值為19. 74和26. 10，拷貝數(shù)為9. 12X IO5Copies/ μ L 和 1. 05 X IO4Copies/μ L ；3 :wzx0104 基因質(zhì)粒 DNA，CT 值為 30. 59，拷貝數(shù)為 2. 09 X IO2Copies/μ L ；4 :f licH4 基因質(zhì)粒 DNA，CT 值為 33. 46，拷貝數(shù)為 7. 76 X IOcopies/ μ L ；其中1、3、4為同一個(gè)模擬雙盲質(zhì)粒DNA，2為另外一個(gè)雙盲質(zhì)粒DNA，其余雙盲均為陰性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 標(biāo)準(zhǔn)品的獲得1、材料pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、PCR相關(guān)試劑及Taq DNA聚合酶購自美國!Iomega公司， 377 型測(cè)序儀(ABI 公司)、Bio-Rad icycler PCR 儀(Bio-Rad 公司)、ABI7500fast 定量 PCR儀(ABI公司)。2、引物及探針設(shè)計(jì)與合成以腸出血性大腸桿菌0104:H4志賀樣毒素2型基因(Stx2)(注冊(cè)號(hào)為X07865)、0 抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)(注冊(cè)號(hào)為AF361371)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)序列(注冊(cè)號(hào)為AY249989)為模板，使用Primer ExpressTM (V2. 0，美國ABI公司)軟件分析TaqMan引物和探針位點(diǎn)，從中選擇最佳組合。3、陽性參考品的制備采用ABI 394寡核苷酸合成儀根據(jù)腸出血性大腸桿菌0104:H4志賀樣毒素2型基因、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因和H4鞭毛抗原基因序列中標(biāo)準(zhǔn)品PCR序列的位置，基因合成長度分別為77bp、95bp和79bp的寡核苷酸片段。用上下游引物在Bio-Rad icycler PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)液組成如下2 xPCR buffer10單標(biāo)準(zhǔn)品上游引物(ΙΟμΜ)IpL標(biāo)準(zhǔn)品下游引物(ΙΟμΜ)IpLDNA 聚合酶(5U/pL )0.2μLdNTPs (各 250mM)\.6\\L
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1: 1: 1: 1) 合成模板 DNA ( 50ng/pL )IpL
水補(bǔ)足至20pL。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 20秒、58°C 20秒、72°C 20秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后于72°C延伸5分鐘后置4°C。上游引物5 ‘ -CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3 ‘，下游引物5 ‘ -CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3 ‘，flicH4 上游引物5' -GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3‘，flicH4 下游引物5' -CAGAATCAACGACCGCATATT-3‘，wzx0104 上游引物5' -AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3‘，wzx0104 下游引物5' -GGTATAACCACGGCTTTCGA-3‘，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后即用克隆系統(tǒng)插入pGEM-T-Easy克隆載體，并將陽性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證?；厥辗謩e為77bp、95bp和79bp片段，即為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。4、結(jié)果經(jīng)測(cè)序，上述設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品完全與預(yù)期相符，回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下志賀樣毒素 2 型基因(Stx2)標(biāo)準(zhǔn)品序列ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgt tcgcgccgtg aatgaagaga gtcaaccaga atgtcago 0 JflJ^IlSlS13 (wzx) t/KiH βπ/!5^lJ aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tggggcgcaa ccttgcgctca acatcgaaag ccgtggttata cc。H4 鞭毛抗原基因(flicH4)標(biāo)準(zhǔn)品序歹丨J :gctgggggta aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa tatgcggtcg ttgattctg。實(shí)施例2 熒光定量PCR法檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0104:H4方法的建立1、質(zhì)粒DNA及其他細(xì)菌DNA提取采用基因組DNA提取試劑提取細(xì)菌基因組DNA，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取實(shí)施例1構(gòu)建的陽性質(zhì)粒DNA，共制備20例雙盲模板，分別取1. 0 μ L做模板，用檢測(cè)用上下游引物在ABI7500fast定量PCR儀(ABI公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)液組成如下IOxPCR buffer5.OpLStx上游引物(ΙΟμΜ)2單Stx下游引物(ΙΟμΜ)2單flicH4上游引物(ΙΟμΜ)flicH4下游引物(ΙΟμΜ)wzx0104 上游引物(ΙΟμΜ)wzx0104 下游引物(ΙΟμΜ)Stx2熒光探針(ΙΟμΜ)Η4熒光探針(ΙΟμΜ)wzx0104 熒光探針(ΙΟμΜ)DNA 聚合酶(5U/pL )dNTPs (各 250mM)4%L
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1: 1: 1: 1) 雙盲的質(zhì)粒 DNA ( Stx2 或 H4 或 wzx0104 各 50ng/pL ) ΙμΙ 水補(bǔ)足至50pL。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 20秒、60°C 45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，
最后置4°C。以非靶細(xì)菌沙門氏菌(CICC21490)為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR檢測(cè)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)模板熒光增長曲線超過閾值線， 并呈良好的對(duì)數(shù)增長，則判斷為陽性。對(duì)于腸出血性大腸桿菌0104:H4的判定依據(jù)是Mx2、 flicH4,wzx0104三個(gè)基因熒光PCR擴(kuò)增均為陽性，即出現(xiàn)熒光信號(hào)。以腸出血性大腸桿菌(EHEC) 0157 :H7(ATCC43889)，致病性大腸桿菌(EPEC) (ATCC 43887)，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC) (ATCC3M01)，腸侵襲性大腸桿菌(EIEC) (ATCC 43893)， 創(chuàng)傷弧菌(CICC 10383)、副溶血性弧菌(CMCC20022)、志賀菌(ACCC04121)等按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為部分菌株出現(xiàn)stx2基因陽性、flicH4、WZX0104基因陰性或全部為陰性，根據(jù)本方法陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，說明上述陰性菌均為陰性結(jié)果，同時(shí)也證明本發(fā)明方法特異性好。同時(shí)在相同條件下以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)DNA的測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)腸出血性大腸桿菌含有Stx2、H4、wzx0104基因的數(shù)量。
2、檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果參見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖2，雙盲質(zhì)粒DNA檢測(cè)結(jié)果見圖 3，1 和 2 :Stx2 基因質(zhì)粒 DNA，CT 值為 19. 74 和 26. 10，拷貝數(shù)為 9. 12 X IO5Copies/ μ L 和 1. 05 X IO4Copies/μ L ；3 :wzx0104 基因質(zhì)粒 DNA，CT 值為 30. 59，拷貝數(shù)為 2. 09 X IO2Copies/μ L ；4 :f licH4 基因質(zhì)粒 DNA，CT 值為 33. 46，拷貝數(shù)為 7. 76 X IOcopies/ UL0其中1、3、4為同一個(gè)模擬雙盲質(zhì)粒DNA，2為另外一個(gè)雙盲質(zhì)粒DNA，其余雙盲均為陰性結(jié)果上述的熒光定量PCR陽性結(jié)果，與雙盲陽性質(zhì)粒結(jié)果一致。本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.腸出血性大腸桿菌0104:H4的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針由志賀樣毒素2型基因(Stx2)、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)的特異性引物和探針組成上游引物5 ‘ -CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3 ‘， 下游引物5 ‘ -CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3 ‘， 熒光探針5' -FAM-CGCGTTCTGTTCGCGCCGT-BHQ 1-3'； flicH4 上游引物5 ‘ -GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3 ‘， flicH4 下游引物5 ‘ -CAGAATCAACGACCGCATATT-3 ‘， flicH4 熒光探針5' -VIC-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ1 -3‘； wzx0104 上游引物5' -AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3‘， wzx0104 下游引物5' -GGTATAACCACGGCTTTCGA-3‘， wzx0104 熒光探針5' -R0X-TCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTG-BHQ2-3'， 其中FAM、VIC和ROX為不同波長的熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括志賀樣毒素2型基因(Stx2)、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)標(biāo)準(zhǔn)品，所述 Stx2 標(biāo)準(zhǔn)品序列如下:ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgt tcgcgccgtg aatgaagaga gtcaaccaga atgtcag ；Bf^iwzx 1^} ) j^^lJ^nT" :aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tggggcgcaa ccttgcgctca acatcgaaag ccgtggttata cc ；所述 f licH4 標(biāo)準(zhǔn)品序列如下gctgggggta aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa tatgcggtcg ttgattctg。
3.權(quán)利要求1或2所述的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒在腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測(cè)中的應(yīng)用。
4.一種腸出血性大腸桿菌0104:H4熒光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括(1)提取細(xì)菌基因組DNA;(2)以志賀樣毒素2型基因(Stx2)、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(WZX)和H4鞭毛抗原基因 (flicH4)的特異性引物和探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR 反應(yīng)液，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以非靶細(xì)菌為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)細(xì)菌熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長，則判斷為陽性；若Mx2、WZx和f licH4均呈陽性，則判斷待測(cè)細(xì)菌為腸出血性大腸桿菌0104:H4 ；所述特異性引物和探針序列如下上游引物5 ‘ -CCGTTATACTGAATTGCCATCATC-3 ‘， 下游引物5 ‘ -CTGACATTCTGGTTGACTCTCTTCAT-3 ‘， 熒光探針5' -FAM-CGCGTTCTGTTCGCGCCGT-BHQ1 -3‘； flicH4 上游引物5 ‘ -GCTGGGGGTAAACAAGTCAA-3 ‘， flicH4 下游引物5 ‘ -CAGAATCAACGACCGCATATT-3 ‘， flicH4 熒光探針5' -VIC-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ1 -3‘； wzx0104 上游引物5' -AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC-3‘， wzx0104 下游引物5' -GGTATAACCACGGCTTTCGA-3‘，wzx0104 熒光探針5' -R0X-TCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTG-BHQ2-3'， 其中FAM、VIC和ROX為不同波長的熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增條件如下95°C預(yù)變性2分鐘， 950C 20秒、60°C 45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后置4°C。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于同時(shí)以腸出血性大腸桿菌0104:H4志賀樣毒素2型基因(Stx2)、0抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度的DNA溶液進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，分別根據(jù)拷貝濃度的對(duì)數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得細(xì)菌DNA的Ct值后，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得細(xì)菌DNA中相應(yīng)基因的拷貝濃度；所述 Stx2 標(biāo)準(zhǔn)品序列如下:ccgttatact gaattgccat catcaggggg cgcgttctgt tcgcgccgtg aatgaagaga gtcaaccaga atgtcag ；所述 wzx 標(biāo)準(zhǔn)品序列如下aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tggggcgcaa ccttgcgctca acatcgaaag ccgtggttata cc ；所述 flicH4 標(biāo)準(zhǔn)品序列如下:gctgggggta aacaagtcaa tttactgtct tacactgaca ccgcgtctaa cagtactaaa tatgcggtcg ttgattctg。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腸出血性大腸桿菌O104:H4的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，通過對(duì)志賀樣毒素2型基因(Stx2)、O抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和H4鞭毛抗原基因(flicH4)進(jìn)行PCR檢測(cè)，若Stx2、wzx和flicH4均呈陽性，則判斷待測(cè)細(xì)菌為腸出血性大腸桿菌O104:H4。本發(fā)明針對(duì)腸出血性大腸桿菌O104:H4提供了一種快速、準(zhǔn)確、有效的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，為及時(shí)采取有效措施對(duì)腸出血性大腸桿菌O104:H4病原菌導(dǎo)致的大規(guī)模疫情進(jìn)行防控提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102260743SQ201110197208
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者張政, 梅玲玲, 程蘇云, 羅蕓, 金大智 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心