專利名稱：一種適用于轉(zhuǎn)人溶菌酶基因牛、豬的快速簡便檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因成分的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)人溶菌酶牛、豬的轉(zhuǎn)基因成分的快速簡便的檢測方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物的安全評價(jià)是轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品市場化和商品化的前提，在安全評價(jià)中轉(zhuǎn)基因成分的檢測是一項(xiàng)重要內(nèi)容，建立轉(zhuǎn)基因生物快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法為安全評價(jià)和管理奠定基礎(chǔ)。人溶菌酶是溶菌酶中的一類，主要存在于人體體液和組織中，人溶菌酶活性較豬、牛等家畜高3000倍以上。除了天然的抗菌活性，人溶菌酶與機(jī)體的防御體系也密切相關(guān)，研究表明其具有抗炎、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等功能(Guo TK, Zhao X，X ie XD,et a. I The anti-proliferative effects of recombinant human lysozyme onhuman gastric cancer cells [J]. J In tMed Res, 2007, 35 (3) :353-360.)中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 的李寧教授已經(jīng)成功培育出了一批轉(zhuǎn)人溶菌酶轉(zhuǎn)基因奶牛及轉(zhuǎn)基因豬，數(shù)量達(dá)到了一定規(guī)模。這標(biāo)志著我國轉(zhuǎn)基因奶牛、轉(zhuǎn)基因豬等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備和動(dòng)物生物反應(yīng)器技術(shù)達(dá)到了國際先進(jìn)水平。鑒于轉(zhuǎn)人溶菌酶基因奶牛、豬生產(chǎn)技術(shù)的成熟以及其產(chǎn)品市場化的趨勢，因此建立一種快速、簡便的檢測人溶菌酶的方法，具有必要性和緊迫性。目前對于轉(zhuǎn)基因成分的檢測可從外源基因的核酸和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平進(jìn)行，核酸水平的檢測應(yīng)用更為廣泛。核酸水平的檢測，主要針對轉(zhuǎn)入的外源基因的核苷酸序列并根據(jù)外源基因與內(nèi)源基因的同源性設(shè)計(jì)檢測方法，主要采用的方法是PCR擴(kuò)增，即依據(jù)轉(zhuǎn)入外源基因的啟動(dòng)子、目的基因、終止子及表達(dá)(重組)載體信息，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，依據(jù)產(chǎn)物的有無或多少判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。可以根據(jù)檢測目的不同，將檢測轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的PCR技術(shù)分為兩類定性PCR和定量PCR。定性PCR主要是在PCR擴(kuò)增之后，通過電泳初步鑒定結(jié)果為陽性或者陰性，PCR反應(yīng)具有高靈敏度、高特異性、高效性的特點(diǎn)，是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品初篩階段的主要檢測方法。定性PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上根據(jù)研究需要還發(fā)展了多重PCR、巢式PCR、熱不對稱交錯(cuò)PCR和電化學(xué)發(fā)光PCR等。定量PCR可以對檢測樣品中轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)量和拷貝數(shù)進(jìn)行量化檢測。在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測中根據(jù)不同需要和檢測目的來選擇進(jìn)行定性或定量檢測。在進(jìn)行外源基因核酸水平檢測中通常需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測兩個(gè)環(huán)節(jié)，但是普通的PCR，以及靈敏度更高的巢式PCR、熒光定量PCR，都必須依賴PCR儀等精密儀器，檢測費(fèi)用高，對檢測人員有較高的技術(shù)要求，無法在條件較差的基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種適用于轉(zhuǎn)人溶菌酶牛、豬的快速簡便檢測方法，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法原理建立外源基因的快速檢測方法，能準(zhǔn)確快速檢測出轉(zhuǎn)基因牛、豬中人溶菌酶基因。本發(fā)明不需要特殊設(shè)備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本發(fā)明的方法同時(shí)也為轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品安全評價(jià)和管理提供借鑒。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下(I)引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)人溶菌酶的基因序列(Gene Bank accession NC_000012)設(shè)計(jì)特異性引物，所述引物對的DNA序列如下所示FIP :5’ -GATTCCCCTGTAGCCATCCATTCAGGTCTTTGAAAGGTGTGAG-3’ ；BIP :5’ -AGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGACTTCCTTCTCTCCTAGTGTC-3’ ；F3 :5’ -CCTTTCTGTTACGGTCCAG-3’ ；B3 :5，-CTCAAAGCCCCTTCTTCT-3，； (2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)以引物FIP、BIP為內(nèi)引物，引物F3、B3為外引物對人溶菌酶基因進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，其反應(yīng)體系為1M甜菜堿，400μΜ dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ 2mM,8U Bst NDA聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，補(bǔ)雙蒸水至25 μ 1，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)后立即冰浴l-2min，再加入8U Bst NDA聚合酶，于61°C反應(yīng)60min，80°C下反應(yīng)5min后終止反應(yīng)；(3)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測I)瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(濃度為40 %的甘油，O. 2%溴酚藍(lán)，59. 8% O. 25Μ Tris-Hcl)，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min,得到凝膠成像，觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則判定為含有人溶菌酶基因(即含有轉(zhuǎn)基因成分)，若沒有階梯型條帶則判定為不含人溶菌酶基因。2)熒光染料染色將SYBR Green I熒光染料稀釋100倍(按體積計(jì))后作為工作液，取5μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若加入SYBR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定為含有人溶菌酶基因，若加入SYBR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕黃色則判定為不含人溶菌酶基因。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的兩對特異引物成功建立了對人溶菌酶快速、靈敏、特異而又簡單實(shí)用的檢測方法。與其它傳統(tǒng)PCR方法相比該發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明經(jīng)濟(jì)實(shí)用反應(yīng)是在恒溫的條件下進(jìn)行，所以不需要昂貴的PCR儀，只需要一臺可以提供恒溫的設(shè)備，例如水浴鍋即可。2.本發(fā)明的靈敏度高采用本方法可以檢測下限至10個(gè)拷貝的人溶菌酶目的基因，比普通的PCR的靈敏度高100倍。3.本發(fā)明的特異性強(qiáng)本發(fā)明采用4條引物，可識別6個(gè)特異性區(qū)域，增加了與目的基因結(jié)合的特異性。4.本發(fā)明的檢出率高對5頭轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因牛及2頭轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行檢測，均檢測出轉(zhuǎn)基因成分，檢出率為100%。5.本發(fā)明檢測簡單直接肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)SYBR Green I染色后的顏色變化來定性判斷靶序列擴(kuò)增與否。


序列表SEQ ID NO :I是本發(fā)明擴(kuò)增的人溶菌酶基因HLY的片段。圖I :是本發(fā)明擴(kuò)增的人溶菌酶基因的特異片段，片段全長為190bp，序列線條標(biāo)記部分為引物所處位置，序列中方框所示位置為限制性內(nèi)切酶HinfI所識別的酶切位點(diǎn)。
圖2 :PCR擴(kuò)增人溶菌酶基因電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ;1_5 :模板為人基因組DNA ；6 :模板為?；蚪MDNA ；7 :模板為豬基因組DNA ；8 :水。圖3 :LAMP擴(kuò)增人溶菌酶基因電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ;1_5 :模板為人基因組DNA ；6 :模板為牛基因組DNA ；7 :模板為豬基因組DNA ；8 :水。圖4 :LAMP擴(kuò)增人溶菌酶基因可視化結(jié)果，圖中1_5 :模板為人基因組DNA ；6 :模板為?；蚪MDNA ；7 :模板為豬基因組DNA ；8 :水。圖5 =LAMP產(chǎn)物酶切組成圖，圖中方框所示部分為酶切后產(chǎn)物組成。圖6 =LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切驗(yàn)證電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ；1 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；2 :酶切后的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :水。圖7 =LAMP擴(kuò)增人溶菌酶檢出限試驗(yàn)，圖中M DL2000 DNA marker ;1_7 1 181'-1^質(zhì)?？截悢?shù)依次106，105，104，103，102，10、5拷貝；8 :牛的基因組DNA;9 :豬的基因組DNA ；10 :水。圖8 =LAMP擴(kuò)增人溶菌酶檢出限試驗(yàn)可視化結(jié)果，圖中1_7 :pMD18T_LYZ質(zhì)粒拷貝數(shù)依次106，105，104，103，102，10、5拷貝；8 :牛的基因組DNA ；9 :豬的基因組DNA ；10 :水。圖9 PCR擴(kuò)增人溶菌酶檢出限試驗(yàn)，圖中M DL2000 DNA marker ;1_7 1 181'-1^質(zhì)粒拷貝數(shù)依次106，105，104，103，102，10、5拷貝；8 :牛的基因組DNA;9 :豬的基因組DNA ；10 :水。圖10 =LAMP檢測轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因牛，圖中M DL2000 DNA marker ;1_5 :轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因牛；6 :陽性對照，PMD18T-LYZ質(zhì)粒；7 :陰性對照，?；蚪MDNA ；8 :水。圖11 =LAMP檢測轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因?？梢暬Y(jié)果，圖中1_5 :轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因牛；6 :陽性對照，pMD18T-LYZ質(zhì)粒；7 :陰性對照，?；蚪MDNA ；8 :水。圖12 =LAMP檢測轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因豬，圖中M DL2000 DNA marker ；1~2 :轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因豬；3 :陽性對照，PMD18T-LYZ質(zhì)粒；4 :陰性對照，豬基因組DNA ;5 :水。圖13 =LAMP檢測轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因?？梢暬Y(jié)果，圖中1_2 :轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因豬；3 :陽性對照，pMD18T-LYZ質(zhì)粒；4 :陰性對照，豬基因組DNA ；5 :水。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :對人溶菌酶基因目的片段進(jìn)行擴(kuò)增I、DNA的提取與純化按照常規(guī)方法采集人血樣和牛血樣，采用報(bào)道的酚-氯仿抽提法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].科學(xué)出版社.北京2005版方法)分別抽提人和?；蚪MDNA，得到人或牛的基因組DNA。2.常規(guī)PCR擴(kuò)增用常規(guī)的PCR擴(kuò)增方法(薩姆布魯克，黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].科學(xué)出版社.北京2005)以兩條外引物即編號為F3、B3的引物擴(kuò)增人基因組DNA中溶菌酶基因目的片段(其核苷酸序列見SEQ ID NO :1和圖I所示，序列全長為190bp)。同時(shí)以牛基因組DNA、豬基因組DNA作為陰性對照。I)反應(yīng)體系上游引物 F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgcl2, 75 μ M dNTPs，0. 5U DNA聚合酶，人基因組DNA I μ L，用雙蒸水補(bǔ)齊至10 μ L。
2)反應(yīng)程序95°C，5min ;34 個(gè)循環(huán)95°C lmin，60°C lmin，72°C 20s ；72°C,5min。3)結(jié)果判定取2· 5μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(配方濃度為40 %的(ν/ν)甘油，60% (ν/ν)0. 25Μ Tris-Hcl, O. 2% (w/v)溴酚藍(lán))，混勻，然后在2%的瓊脂糖凝膠中電泳30min后，通過凝膠成像系統(tǒng)成像，可見長度為190bp的擴(kuò)增片段，結(jié)果如圖2所示。3、LAMP 擴(kuò)增以引物FIP、引物BIP的核苷酸序列為內(nèi)引物，以引物F3、引物B3所示的引物為外引物對人基因組DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，同時(shí)以?；蚪MDNA作為陰性對照。
I)反應(yīng)體系試劑組成如下:1M 甜菜堿，400μΜ dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ 2mM,8U Bst DNA聚合酶，I μ I模板，加外引物F3、B3各0. 2 μ M，內(nèi)引物FIP、BIP各
I.6 μ Μ,補(bǔ)雙蒸水至總體積25 μ I。2)反應(yīng)程序?qū)⑸鲜龇磻?yīng)體系中除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于95°C反應(yīng)5min，立即冰浴l-2min，再加入8U Bst DNA聚合酶，于61°C下反應(yīng)60min，然后置80°C下5min終止反應(yīng)。3)結(jié)果分析與判定①瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(配方40 % (ν/V)甘油，60% (V/V)0. 25M Tris-Hcl, O. 2% (w/v)溴酚藍(lán))，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，在凝膠系統(tǒng)下成像，觀察是否有階梯型條帶出現(xiàn)，若有階梯型條帶則判定為含有人溶菌酶基因，若沒有階梯型條帶則判定不含人溶菌酶基因。②熒光染料染色SYBR Green I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若加ASYBR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定含有人溶菌酶基因，若加入SYBRGreen I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕黃色則判定為不含人溶菌酶基因。③結(jié)果判定在上述分析方法①中，在凝膠成相系統(tǒng)的紫外燈下，模板為人基因組DNA，即含有人的溶菌酶基因時(shí)，可以觀察到階梯型條帶，而模板為?；蚪MDNA時(shí)，即不含人的溶菌酶基因，則觀察不到階梯型條帶，其結(jié)果如圖3所示。在上述分析方法②中，當(dāng)模板為人的基因組DNA，即含有人的溶菌酶基因時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，當(dāng)模板為?；蚪MDNA時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕黃色，其結(jié)果如圖4所示。4) LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性檢驗(yàn)對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳檢測不是呈現(xiàn)一條帶，而是呈現(xiàn)出由多條帶組成的階梯型條帶，這是因?yàn)檫@種方法在擴(kuò)增過程中形成以目的片段，連接在一起的長短不一的開環(huán)產(chǎn)物所造成。本發(fā)明中溶菌酶基因目的片段(其核苷酸序列見圖I所示)大小為190bp，在88bp處存在限制性內(nèi)切酶HinfI所識別的酶切位點(diǎn)，由于LAMP產(chǎn)物是由互相連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)組成，在酶切位點(diǎn)處切開的產(chǎn)物分別由圖5中所示方框部分組成，酶切后的兩段長度應(yīng)分別是86bp和126bp。因此可使用HinfI對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，驗(yàn)證LAMP擴(kuò)增得到的階梯型條帶是否由溶菌酶基因目的片段所組成，若階梯型條帶能被HinfI識別而酶切，則酶切后電泳檢測階梯型條帶不存在，且能獲得大小為86bp和126bp的兩個(gè)片段，則判定為階梯型條帶是由溶菌酶基因目的片段所組成的，亦即LAMP擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物是溶菌酶基因目的片段。①酶切反應(yīng)體系取3 μ ILAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，加入O. 8 μ I限制性內(nèi)切酶HinfI (購自Fermentas 公司)和 1μ I buffer,雙蒸水補(bǔ)至 10 μ I。②反應(yīng)程序于37°C恒溫培養(yǎng)箱中酶切6小時(shí)。③結(jié)果判定取2. 5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(配方濃度為40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25Μ Tris-Hcl, O. 2% (w/v)溴酚藍(lán))，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，在凝膠系統(tǒng)下成像，觀察到酶切以后的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物不再有階梯型條帶，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果說明本發(fā)明中LAMP擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物是溶菌酶基因目的片段。實(shí)施例2 :人溶菌酶LAMP檢測方法靈敏度試驗(yàn)
用含人溶菌酶基因的質(zhì)粒pMD18T-LYZ作模板，驗(yàn)證檢測人溶菌酶LAMP方法的檢出限，并與PCR方法的檢出限作對比。具體步驟如下I、質(zhì)粒 pMD18T-LYZ 的構(gòu)建I)人溶菌酶基因目的片段PCR產(chǎn)物的回收純化用PCR方法以兩條外引物即引物F3(其序列見SEQ ID NO :4)、引物B3 (其序列見SEQ ID NO 5)擴(kuò)增人基因組DNA中溶菌酶基因目的片段(其核苷酸序列見序列表SEQ ID N0:1或圖I所示，序列全長為190bp)。反應(yīng)體系上游引物F3 0.2μΜ，下游引物Β3 O. 2μΜ, 1μ I PCR buffer, I. 5mM Mgcl2, 75 μ M dNTPs,0. 5U DNA 聚合酶，人基因組 DNA
Iμ L,用雙蒸水補(bǔ)齊至10 μ L。反應(yīng)程序95°C，5min ;34個(gè)循環(huán)95°C lmin, 60°C lmin,72°C 20s ;72°C,5min。取50 μ L PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，凝膠成相系統(tǒng)上成像。結(jié)果可以看到190bp大小的片段，結(jié)果如圖2所示(其核苷酸序列見序列表SEQ ID NO :1或圖I所示)。將擴(kuò)增的目的基因從瓊脂糖凝膠上切下，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司)回收DNA。2)目的片段PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接將回收產(chǎn)物與pMD18_T載體(購自武漢大風(fēng)生物科技有限公司)連接，連接體系為0· 5μ L PMD-18T載體，3· 5μ L solution I，3 μ L回收產(chǎn)物，將上述試劑混勻后4°C連接過夜。3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、PMD18T-LYZ質(zhì)粒的鑒定及提取取5yL連接產(chǎn)物加入100 μ L大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42 °C循環(huán)水中熱擊90s，快速冰浴l-2min使細(xì)胞冷卻，加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基，37 °C搖床上培育45min，在4000rpm離心5min，棄去500 μ L上清液，將余下液體吹打均勻，吸取100 μ L涂布于含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB瓊脂平皿上，37°C培養(yǎng)12h。用經(jīng)高壓滅菌(121°C，高壓蒸汽滅菌30min)的10 μ L移液器頭挑取菌落置于800 μ L氨芐青霉素(ΙΟΟμ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C搖床震蕩培養(yǎng)4h，然后通過菌液PCR挑選陽性菌液，然后送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)比對確認(rèn)以后，用質(zhì)粒小提試劑盒(購自TIANGEN公司，按照試劑盒的說明書介紹的方法操作)提取質(zhì)粒PMD18T-LYZ，并測定質(zhì)粒濃度。4)計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，其公式為(6. 23 X IO23拷貝/mol) X (濃度g/ml) + [堿基數(shù)X (660道爾頓/堿基)]=拷貝數(shù)/ml經(jīng)計(jì)算質(zhì)粒pMD18T-LYZ拷貝數(shù)為10. OX IO13拷貝數(shù)/ml質(zhì)粒用雙蒸水將質(zhì)粒PMD18T-LYZ進(jìn)行倍比稀釋，使其終濃度為25X 107拷貝/ μ 1，25Χ106 拷貝 / μ 1，25Χ105 拷貝 / μ 1，25Χ104 拷貝 / μ 1，25Χ103 拷貝 / μ 1，25Χ102 拷貝/μ 1,25x1ο1 拷貝 /μ I。2、LAMP方法檢測檢出限試驗(yàn)利用本實(shí)施例中所計(jì)算出的已知含有人溶菌酶基因檢測目的片段(190bp)拷貝數(shù)的質(zhì)粒PMD18T-LYZ為模板，采用LAMP方法和PCR方法進(jìn)行檢測的靈敏度試驗(yàn)。I)LAMP方法擴(kuò)增不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pMD18T_LYZ
以引物FIP、BIP為內(nèi)引物，以引物F3、B3(序列表SEQ ID NO :4和5)為外引物對本實(shí)施例中步驟I得到的質(zhì)粒PMD18T-LYZ進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，使體系中含質(zhì)?？截悢?shù)依次為IO6 個(gè)，IO5 個(gè)，IO4 個(gè)，IO3 個(gè)，IO2 個(gè)，10，5 個(gè)。①反應(yīng)體系試劑如下在總體積為25 μ I的反應(yīng)體系中IM甜菜堿,400 μ MdNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ 2mM,8U Bst DNA 聚合酶，I μ I 模板，加外引物 F3、B3各0.2 μ Μ，內(nèi)引物FIP、BIP各1.6 μ Μ，補(bǔ)雙蒸水至總體積25 μ I。②反應(yīng)程序?qū)⑸鲜龇磻?yīng)體系除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，95°C反應(yīng)5min，立即冰浴l-2min，再加入8U Bst DNA聚合酶，于61°C下反應(yīng)60min，然后置80°C下5min終止反應(yīng)。2)PCR方法擴(kuò)增不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒PMD18T-LYZ同時(shí)以兩條外引物F3、B3(見序列表SEQ ID NO :4和5)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使體系中含質(zhì)粒拷貝數(shù)依次為IO6個(gè)，IO5個(gè)，IO4個(gè)，IO3個(gè)，IO2個(gè)，10個(gè)，5個(gè).①反應(yīng)體系上游引物F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgcl2, 75 μ M dNTPs，0. 5U DNA聚合酶，人基因組DNA I μ L，用雙蒸水補(bǔ)齊至10 μ L。②反應(yīng)程序95°C，5min;34 個(gè)循環(huán)95°C lmin, 60 °C lmin, 72 °C 20s ；72°C,5min。I)結(jié)果分析經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到結(jié)果當(dāng)pMD18T-LYZ質(zhì)粒為10個(gè)拷貝時(shí)，LAMP方法能擴(kuò)增出階梯型條帶，而當(dāng)PMD18T-LYZ質(zhì)粒為5個(gè)拷貝時(shí)，LAMP方法未能擴(kuò)增出階梯型條帶，因此判定LAMP對pMD18T-LYZ質(zhì)粒的擴(kuò)增下限為10個(gè)拷貝，結(jié)果如圖7所示。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中，取5μ I加入O. 5μ ISYBR Green I工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果，結(jié)果質(zhì)?？截悢?shù)依次為IO6個(gè)，IO5個(gè)，IO4個(gè)，IO3個(gè)，IO2個(gè)，10個(gè)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，而質(zhì)?？截悢?shù)為5時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物則為棕黃色。結(jié)果如圖8所示。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到結(jié)果當(dāng)pMD18T-LYZ質(zhì)粒為IO3個(gè)拷貝時(shí)，PCR方法能擴(kuò)增出特異性條帶，當(dāng)PMD18T-LYZ質(zhì)粒為IO2個(gè)拷貝時(shí)，PCR方法未能擴(kuò)增出特異性條帶，因此判定PCR方法對pMD18T-LYZ質(zhì)粒的擴(kuò)增下限為IO3個(gè)拷貝，結(jié)果如圖9所示。本實(shí)施例中，LAMP方法靈敏度高，采用本方法可以檢測下限至10個(gè)拷貝的人溶菌酶目的基因，是普通PCR靈敏度高100倍。實(shí)施例3 :對轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行LAMP檢測對5頭轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因牛及2頭轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行LAMP檢測，試驗(yàn)中所用轉(zhuǎn)基因牛的基因組DNA以及人的基因組DNA樣品，均稀釋到20ng/y I。I) LAMP 擴(kuò)增過程以 FIP (序列表 SEQ ID NO :2)、引物 BIP (序列表 SEQ ID NO 3)為內(nèi)引物，F(xiàn)3(序列表SEQ ID NO :4)、B3(序列表SEQ ID NO 5)為外引物對人溶菌酶DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)體系為1M 甜菜堿，400μΜ dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ 2mM,8UBst NDA聚合酶大片段，I μ I模板，外引物各O. 2 μ Μ，內(nèi)引物各I. 6 μ Μ，補(bǔ)ddH20至25 μ 1，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，95°C反應(yīng)5min，立即冰浴l_2min，再加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59°C反應(yīng)60min，80°C反應(yīng)5min后終止反應(yīng)；2)結(jié)果分析①瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液(40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25Μ Tris-Hcl7O. 2% (w/v)溴酹藍(lán))，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min,得到凝膠成像，觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則含有人溶菌酶基因，若沒有階梯型條帶則不含人溶菌酶基因。
②熒光染料染色將SYBR Green I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若加ASYBR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定為含有人溶菌酶基因，若加入SYBRGreen I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕黃色則判定為不含人溶菌酶基因。③結(jié)果判定本實(shí)施例的LAMP檢測方法以及作為對照的PCR方法均檢測出了陽性轉(zhuǎn)基因牛、豬的溶菌酶基因成分，結(jié)果分別如圖10、圖11、圖12、圖13所示。
權(quán)利要求
1. 一種轉(zhuǎn)人溶菌酶基因牛、豬的快速、簡便檢測方法，其步驟包括 (1)引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)人溶菌酶的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP :5’ -GATTCCCCTGTAGCCATCCATTCAGGTCTTTGAAAGGTGTGAG-3’ ；BIP :5’ -AGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGACTTCCTTCTCTCCTAGTGTC-3’ ；F3 :5’ -CCTTTCTGTTACGGTCCAG-3’ ；B3 :5’ -CTCAAAGCCCCTTCTTCT-3’ ； (2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) 以引物FIP、BIP為內(nèi)引物，引物F3、B3為外引物對人溶菌酶基因進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，其反應(yīng)體系為IM 甜菜堿，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+2mM,8U Bst NDA 聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各0·2μΜ，內(nèi)引物FIP和BIP各1·6μΜ，補(bǔ)雙蒸水至25μ 1，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)后立即冰浴l-2min，再加入8U Bst NDA聚合酶，于61°C反應(yīng)60min，80°C下反應(yīng)5min后終止反應(yīng)； (3)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測 1)瓊脂糖凝膠電泳取2μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，加入I μ I上樣緩沖液，該緩沖液包含濃度為40%的甘油、O. 2%溴酚藍(lán)和59. 8% O. 25Μ Tris-Hcl，混勻，再按重量/體積計(jì)加2%瓊脂糖凝膠，于5V/cm下電泳30min,得到凝膠成像,觀察是否有梯形條帶出現(xiàn)； 2)將SYBRGreen I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中轉(zhuǎn)基因成分的分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及提供一種適用于轉(zhuǎn)人溶菌酶基因牛、豬的快速簡便檢測方法，本發(fā)明利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法原理，準(zhǔn)確快速檢測出轉(zhuǎn)基因牛、豬中的人溶菌酶基因。本發(fā)明不需要特殊設(shè)備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本發(fā)明的方法同時(shí)也為轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品安全評價(jià)和管理提供了實(shí)用的分子檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102864210SQ20111019746
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者劉榜, 翟珊莉, 劉楚新, 張慶德 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)