專利名稱：水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子及其應用。
背景技術：
植物生物技術的最新發(fā)展不僅實現(xiàn)了傳統(tǒng)農藝性狀的改良(如提高作物產量，增強抗病、抗蟲、抗除草劑特性，改良品質等)，而且使植物成為生物醫(yī)藥和工業(yè)產品的生物反應器。絕大多數(shù)禾本科作物具有產量高、生產成本低、耐儲藏、生產規(guī)模容易控制、可直接食用等特點，并且其具備體內翻譯后修飾的能力，因而成為第二代轉基因產物的理想載體。近年來利用水稻種子生產具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究發(fā)展很快，且已經取得了巨大成功。如維生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有預防和治療缺鐵性貧血和提高自身免疫功能的大豆鐵蛋白(Ferritin)、具有刺激胰島素分泌預防糖尿病發(fā)生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉過敏癥疫苗等均成功地在水稻中表達并高水平累積。然而，進一步實現(xiàn)外源基因的高效表達必須在轉錄和轉錄后水平同時提高基因表達。啟動子主要在轉錄水平調控基因表達，終止子則在轉錄和轉錄后水平同時起調控作用。盡管目前廣泛應用的終止子，如NOS、0cS，與異源啟動子組合后可啟動報告基因在植物中的高表達，能夠滿足生物化學、生理學以及細胞定位方面的研究需求。然而，對于其他能夠提高基因表達的終止子研究較少。由于一些重要農藝性狀以及植物次生代謝產物都是由多基因控制，提高單個基因的表達對于相關性狀改良作用不明顯。通過傳統(tǒng)轉化方法， 如重復轉化或雜交來實現(xiàn)多基因轉化卻費時費力。近年來發(fā)展起來的多基因轉化系統(tǒng)可以在一個表達載體中同時插入多個基因，為了避免轉基因同源性過高引起的轉基因沉默，這些基因需要由不同的啟動子驅動表達，不同的終止子終止轉錄。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一個終止子，名稱為tCluB-4，該終止子與nos終止子相比，可以提高外源基因的表達水平。本發(fā)明所提供的終止子，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。所述嚴格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，1 X SSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Νει3Ρ04 Π ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. SDS 中漂洗； 還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. IX SSC,0. 1% SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交， 在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中序列1由469個核苷酸組成。含有所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構建含有所述DNA分子的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。使用所述DNA分子構建重組植物表達載體時，在外源基因轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin))、組成型啟動子或組織特異表達啟動子(如種子特異表達的啟動子)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的DNA分子構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個外源基因序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工， 如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標記基因(如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因， 賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對 methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學試劑標記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。所述重組載體具體可為任一如下載體pGluB-3-tGluB-4、pGluC-tGluB-4及 pActin-tGluB-4。所述PGluB-3-tGluB-4是將pGluB-3-nos中的nos終止子替換為序列表序列1所示的tGluB-4終止子得到的重組載體，所述pGluC-tGluB-4是將pGluC_nos中的nos終止子替換為序列表序列1所示的tGluB-4終止子得到的重組載體，所述pActin-tGluB-4是將 pActin-nos中的nos終止子替換為序列表序列1所示的tGluB-4終止子得到的重組載體。所述表達盒是指由啟動子、由所述啟動子啟動轉錄的目的基因和位于所述目的基因下游的所述DNA分子組成的。其中，所述啟動子可為組成型啟動子或組織特異表達啟動子(如胚乳特異性啟動子)。所述目的基因可為蛋白編碼基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質改良基因；所述非蛋白編碼基因為正義RNA基因和/或反義RNA 基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉基因植物的方法，是將含有所述DNA分子的表達盒導入目的植物中，得到所述目的基因表達水平高于將如下表達盒導入所述目的植物的轉基因植物將所述的表達盒中的所述DNA分子替換為胭脂堿合成酶的nos終止子得到的表達盒。所述目的植物具體可為單子葉植物或雙子葉植物。
所述單子葉植物具體可為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥，所述雙子葉植物具體可為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。所述轉基因植物理解為不僅包含將所述含有所述DNA分子的表達盒轉化目的植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該含有所述DNA分子的表達盒，也可用常規(guī)育種技術將該含有所述DNA分子的表達盒轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述DNA分子在培育轉基因植物中的應用或作為終止子的應用也在本發(fā)明的保護范圍內。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達和累積水平，可改良種子品質、將具有生理活性的蛋白或短肽導入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應器生產有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農產品科技附加值等。本發(fā)明的終止子及其應用為利用生物技術改良種子品質、分子醫(yī)藥農場等研究奠定了基礎，具有極大的應用前景。


圖1為從水稻基因組DNA中PCR擴增谷蛋白GluB_4基因終止子(tGluB_4)的電泳圖譜。其中1為DNA分子量標準，2為tGluB-4的片段。其中，標準分子量大小由下至上依次為0. Ikb,0. 2kb，0. 3kb，0. 4kb，0. 5kb，0. 6kb，0. 7kb，0. 8kb，0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb, 1. 5kb, 2. Okb，3. Okb，4. Okb，5. Okb，6. Okb，8. Okb，10. Okb。圖2為載體pMD-tGluB-4經&ic I和EcoR I的雙酶切鑒定圖譜。其中1為DNA 分子量標準，2為pMD-tGluB-4的酶切片段。其中，標準分子量大小由下至上依次為100bp， 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp, 3000bp, 5000bp,酶切片段由下至上依次為tGluB_4， 469bp ；pMD-tGluB-4 載體框架片段，2700bp。圖3為含有tGluB-4的載體結構示意圖。其中，A圖為PGluB-3-tGluB_4結構示意圖，B圖為pGluC-tGluB-4結構示意圖，C圖為pActin-tGluB-4結構示意圖，GluB_4T為 tCluB-4。圖4為含有tGluB-4的重組載體的雙酶切鑒定圖譜。其中，A圖為 PGluB-3-tGluB-4經&ic I和EcoR I雙酶切圖，2代表酶切片段由下至上依次為tGluB_4， 469bp ；pGluB-3-tGluB-4 載體框架片段，16. 6kb ；B 圖為 pGluC_tGluB_4 經 Sac I 和 EcoR I雙酶切圖，2代表酶切片段由下至上依次為tGluB-4，469bp ；pGluC-tGluB-4載體框架片段，16. 6kb ;C圖為pActin-tGluB-4經Sma I和EcoR I雙酶切圖，2代表酶切片段由下至上依次為11Λ的Actin啟動子一部分、2. 4kb的⑶S與GluB_4終止子的片段、余下的載體大片段；A-C圖中的1代表標準分子量，其大小由下至上依次為100bp，250bp，500bp，750bp， IOOObp,2000bp,3000bp,5000bp。圖 5 為部分轉 pGluB-3-tGluB-4、pGluC_tGluB_4 和 pActin-tGluB-4 的 Ttl 代水稻植株嵌合引物PCR擴增電泳圖譜。1為DNA分子量標準，2為以PGluB-3-tGluB-4為模板的陽性對照，3為以未轉化株系為模板的陰性對照，4 20為部分轉pGluB-3-tGluB-4、 pGluC-tGluB-4及pActin-tGluB-4植物表達載體的再生植株。圖6為未轉基因的野生型水稻Kitaake植株⑶S染色結果。其中，1、2、3、4分別為未轉基因的野生型水稻Kitaake植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖7為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos植株GUS染色結果。其中，1、2、3、 4分別為轉pGluB-3-nos植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖8為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB_4植株⑶S染色結果。其中，1、 2、3、4分別為轉PGluB-3-tGluB-4植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖9為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pActin-nos植株⑶S染色結果。其中，1、2、3、4 分別為轉pActin-nos植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖10為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4植株⑶S染色結果。其中，1、 2、3、4分別為轉pActin-tGluB-4植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖11為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB-4所結種子的⑶S熒光活性測
定結果。圖12為T1代轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB-4所結種子的⑶S熒光活性測
定結果。圖13為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pGluC-tGluB-4所結種子的⑶S熒光活性測定結果。圖14為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4所結種子的⑶S熒光活性測
定結果。圖15為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4植株莖稈中的⑶S熒光活性測定結果。圖16為Ttl代轉基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4植株葉片中的⑶S熒光活性
測定結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB-4)的獲得根據(jù)水稻谷蛋白GluB-4基因的cDNA序列(GenBank號為X14393)，從GenBank中查找谷蛋白GluB-4基因的基因組DNA序列，終止密碼子后469bp的序列即為本發(fā)明的水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB-4)，設計引物擴增tGluB-4。為便于載體構建，在引物上分別添加酶切位點(下劃線所示)。tGluB-4的正向引物為tGluB-4SacF 5' GGAGCTC GAATTCAAGGGCTATCTTCC-3 ‘ (Sac I)，反向引物為 tGluB_4EcoR 5 ‘ -AGAATTCTGTACTAATGAA ATAGTAT-3‘ (EcoR I)。CTAB 法從野生型水稻 Kitaake (文獻 Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 :2417-2424) 葉片中小量提取基因組DNA,以其為模板，以tGluB-4 SacF和tGluB-4 EcoR為引物，PCR 擴增tGluB-4序列。PCR反應程序為94°C預變性5min，然后94°C 30sec，55°C 30sec, 72°C lmin，30個循環(huán)，最后72°C IOmin0 PCR擴增得到469bp的目的條帶，如圖1所示?；厥諗U增產物，直接連接到PMD18-T載體(購自TaKaRa公司)上，進行測序，結果表明，擴增得到的tGluB-4序列大小為469bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。將測序檢測表明含有tGluB-4片段的重組載體命名為pMD-tGluB-4。pMD_tGluB_4經&ic I和EcoR I的雙酶切鑒定圖譜如圖2所示。實施例2、水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB_4)的載體構建與轉化1、tGluB-4融合⑶S基因的植物表達載體構建用&ic I禾Π EcoR I雙酶切pMD-tGluB-4質粒，回收tGluB-4的469bp酶切片段， 將該片段分別插入到含有GluB-3啟動子的pGluB-3-nos、含有GluC啟動子的pGluC-nos和含有Actin啟動子的pActin-nos的McI和EcoR I雙酶切識別位點之間構建穩(wěn)定轉化載體PGluB-3-tGluB-4(其結構示意圖如圖3A所示)、pGluC-tGluB_4 (其結構示意圖如圖所示)和pActin-tGluB-4(其結構示意圖如圖3C所示)。以上3種重組質粒載體的雙酶切鑒定圖譜如圖4。pGluB-3-nos、pGluC—nos 禾口 pActin—nos 按照文獻 Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008， 59 =2417-2424所述的方法構建以水稻臺中65的基因組DNA為模板，以GluB_3正向引物 5，-CCCAAGCTTATTTTACTTGTACTGTTTAACC-3‘ (HindIII)和 GluB-3 反向引物 5，AAACCCG GGAGCTTTCTGTATATGCTAATG-3‘ (SmaI)為引物，PCR 擴增得到 GluB-3 啟動子，將 GluB-3 啟動子用 HindIII 和 SmaI 雙酶切，插入到 pGPTV_35S_HPT(Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 2417-2424)的GUS上游的HindIII和SmaI位點，得到的重組載體即為pGluB-3-nos。以水稻臺中65的基因組DNA為模板，以GluC正向引物5’GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG-3’ ( HindIII)和 GluC 反向引物 5，-ACGCGTCGACAGTTATTCACTTAGTTTCCC-3‘ (Sail)為引物，PCR 擴增得到GluC啟動子，將GluC啟動子用HindIII和MlI雙酶切，插入到pGPTV-35S_HPT的 GUS上游的HindIII和SalI位點，得到的重組載體即為pGluC-nos。以水稻臺中65的基因組 DNA 為模板，以 Actin 正向引物 5，-AAAAGCTTTAGCTAGCATACTCGA-3’ (HindIII)和 Actin 反向引物 5，-AATCTAGAGATATCCTCGGCGTCA-3’ (XbaI)為引物，PCR 擴增得到 Actin 啟動子， 將Actin啟動子用HindIII和)(bal雙酶切，插入到pGPTV_35S_HPT的GUS上游的HindIII 和XbaI位點，得到的重組載體即為pActin-nos。pGPTV-35S_HPT以⑶S為外源基因，nos為終止子。2、轉 pGluB-3-tGluB-4, pGluC_tGluB_4、pActin_tGluB_4、pGluB-3-nos、 pGluC-nos及pActin-nos水稻再生植株的獲得構建完成的pGluB-3-tGluB-4、pGluC_tGluB_4 及 pActin-tGluB-4 表達載體經過酶切與測序驗證其正確后，利用凍融法分別導入農桿菌EHA105中，具體方法如下吸取 7 μ 1表達載體質粒加入100 μ 1 ΕΗΑ105農桿菌感受態(tài)細胞中，輕彈混勻后置于液氮中冷凍 7min，之后轉入37°C水浴中靜置3min，然后加入SOOulYEB液體培養(yǎng)基于靜置恢復培養(yǎng)3 5小時，取400 μ 1菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平RiKOmg/ L)，于倒置培養(yǎng)2 3天。挑取少許農桿菌單菌落進行目標基因的菌落PCR檢測后將陽性菌落在YEB抗性平板上劃線擴繁培養(yǎng)，利用農桿菌侵染法轉化水稻品種kitaake的愈傷組織，用潮霉素篩選抗性愈傷，并進一步培養(yǎng)分化成幼苗后移栽溫室。利用潮霉素篩選方法(按照文獻Hiei et al.，Plant J. 1994，6 :271-282所述方法進行)，獲得7株Ttl代轉PGluB-3-tGluB-4水稻植株、10株Ttl代轉pGluC-tGluB_4水稻植株及2株pActin-tGluB-4水稻植株。利用PCR方法對上述篩選得到的轉PGluB-3-tGluB_4 水稻、轉pGluC-tGluB-4水稻及轉pActin-tGluB-4水稻進行PCR分子檢測，PCR引物為tGluB-4和GUS基因序列的嵌合引物，即:tGluB-4序列反向引物tGluB_4EcoR 5 ‘ -AGAATTC TGTACTAATGAAATAGTAT-3 ‘禾Π GUS 序列內部的正向弓丨物 GUSF185 5 ‘ -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3 ‘。PCR 反應程序為-MV 預變性 5min，然后 94 °C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，30個循環(huán)，最后72 °C IOmin0 PCR擴增得到0. 71Λ的目的條帶即為檢測陽性(如圖5所示)。結果表明7株轉PGluB-3-tGluB-4植株(表示為Kitaake/ pGluB-3-tGluB-4) PCR 檢測均呈陽性，10 株轉 pGluC-tGluB-4 植株(表示為 Kitaake/ pGluC-tGluB-4)及 2 株轉 pActin-tGluB-4 植株(表示為 Kitaake/pActin-tGluB-4) PCR 檢測均呈陽性。按照上述方法，將pGluB-3-nos、pGluC-nos及pActin-nos分別轉入野生型水稻 Kitaake,得到 9 株轉 pGluB-3-nos 的陽性植株(表示為 Kitaake/pGluB-3-nos)，10 株轉 pGluC-nos的陽性植株(表示為Kitaake/pGluC-nos)和7株轉pActin-nos的陽性植株(表示為 Kitaake/pActin-nos)。轉 pGluB_3_nos、pGluC_nos 禾口 pActin_nos 白勺^K禾白勺 PCR 檢測方法以tnos序列反向引物tnosR 5' -GATCTAGTAACATAGATGAC-3‘和GUS序列內部的正向引物GUSF185 5' -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3‘為引物，擴增tnos和GUS基因的嵌合序列，得到500bp的目的條帶即為陽性轉化株。T0代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T1代，依此類推，T2、T3分別表示轉基因植株第2代和第3代。實施例3、水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB_4)的功能驗證UT0代轉基因水稻的⑶S組織化學檢測對PCR檢測為陽性的轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/ pGluB-3-tGluB-4、Kitaake/pActin-nos 和 Kitaake/pActin-tGluB-4 的 Ttl 代植株進行組織化學染色，以未轉基因的野生型水稻Kitaake植株為對照。具體步驟為將轉基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 禾口 Kitaake/pGluB-3-tGluB_4、Kitaake/pActin-nos 禾口 Kitaake/ pActin-tGluB-4的Ttl代植株和未轉基因的野生型水稻Kitaake植株的部分葉片、根、莖桿組織切成小塊；將開花后17天的灌漿期種子用解剖刀從中部縱切開。將處理好的樣品浸泡于GUS染色反應液(0. IM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)，IOmM Na2-EDTA (pH7. 0)，5mM鐵氰化鉀， 5mM 亞鐵氰化鉀，1. OmM X-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，37°C反應 0. 5-4 小時。70% 乙醇中保存、觀察。體視鏡下觀察并拍照。結果如圖6-10所示未轉基因的野生型水稻Kitaake 植株的根、葉片、莖桿和開花后17天的種子的糊粉層和亞糊粉層均未觀察到GUS表達(圖 6) ；T0 代轉基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3-tGluB_4 植株的根、葉片、 莖桿均未觀察到⑶S表達(圖7，圖8)，Ttl代轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos開花后17 天的種子僅在糊粉層和亞糊粉層有所表達，而Ttl代轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB-4 的糊粉層、亞糊粉層及整個胚乳藍色均清晰可見表達。結果表明tGluB-4與nos終止子相比增強了葡萄糖苷酸酶(GUQ報告基因在水稻種子胚乳中的表達強度，但并未改變 ⑶S報告基因在胚乳中的特異性表達。Ttl代轉基因水稻Kitaake/pActin-nos和Kitaake/ pActin-tGluB-4植株的根莖葉片均能觀察到⑶S表達，但是強度基本相似，而種子中則 Kitaake/pActin-tGluB-4 的 GUS 表達強度強于 Kitaake/pActin-nos，說明 tGluB-4 與 nos 終止子相比能夠增強⑶S基因在水稻胚乳中的表達(圖9，圖10)。2、T0及T1代轉基因水稻的⑶S熒光活性測定對PCR檢測為陽性的轉基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/PGluB-3-tGluB-4的Ttl代及T1代植株開花后17天的灌漿期種子、Kitaake/pGluC-nos和 Kitaake/pGluC-tGluB-4的Ttl代植株開花后17天的灌漿期種子及Kitaake/pActin-nos 和Kitaake/pActin-tGluB-4的Ttl代植株根、莖、葉片及開花后17天的灌漿期種子進行 ⑶S定量分析。方法按照Jefferson等的熒光檢測方法(Jefferson，Plant Mol. Biol. Report, 1987, 5 :387-405)進行。具體為每株分別取種子或者根、莖、葉片，分別置于3 個1. 5ml印pendorf管中，用研棒將其碾碎，加入200 μ 1抽提液(50mM磷酸鈉緩沖溶液 (ρΗ7· 0)，IOmM β -巰基乙醇，IOmM Na2EDTA (ρΗ 8. 0) ,0. 1% SDS, 0. 1% TritonX-100)，振蕩混勻。4113，000卬111離心51^11，取上清于新管中。10 μ 1上清，加入90 μ 1反應液(ImM 4-MUG溶于⑶S抽提液)，37°C反應60分鐘，加入900 μ 1終止液(0. 2Μ Na2CO3)，室溫終止反應。以4-MU做標準曲線，用F-4500 (日立)型熒光分光光度計在360nm激發(fā)波長和460nm 吸收波長下檢測相對4-MU含量。以牛血清白蛋白為對照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit II (購自美國伯樂公司，編號GPR6611)測定蛋白質含量。對PCR檢測為陽性的7個Ttl代Kitaake/pGluB-3-tGluB-4所結種子進行GUS活性測定(結果如圖11所示)。⑶S活性最高值為36.71pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白，最低值為 16. 56pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 27. 8士7. 3pmol 4-MU mirr^g—蛋白。而 9 個對照 Kitaake/pGluB-3-nos 的 T0 株系中，GUS 活性最高值為 17. 38pmol 4-MUmirT1 μ 蛋白，最低值為 2. 39pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 11. 2士5. Opmol 4-MUmirT1 μ 蛋白。轉PGluB-3-tGluB-4載體的7個株系⑶S表達量均大于或者等于轉pGluB-3-nos植株最大值，前者最大值是后者最大值的2. 1倍，是其最小值的15. 33倍，平均值為對照平均值的2. 5倍。對PCR檢測為陽性的5個T1代Kitaake/pGluB-3-tGluB_4所結種子進行⑶S活性測定(結果如圖12所示)。⑶S活性最高值為54. 72pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白，最低值為 9. 69pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 39. 5士 17. 3pmol 4-MU mirT、蛋白。而 7 個對照 Kitaake/pGluB-3-nos 的 T1 株系中，則 GUS 活性最高值為 21. 52pmol 4-MUmirT1 μ
蛋白，最低值為 2. 82pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 9. 9 士 5. 8pmol 4-MUmirT1 μ 蛋白。前者平均值為后者的3. 98倍。對PCR檢測為陽性的10個Ttl代Kitaake/pGluC-tGluB-4所結種子進行⑶S活性測定(結果如圖13所示)。⑶S活性最高值為48. 82pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白，最低值為 22. 07pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白，平均值為 38. 8士8. 3pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白。而 10 個對照 Kitaake/pGluC-nos 的 Ttl 株系中，GUS 活性最高值為 51. 65pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白， 最低值為 5. 17pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白，平均值為 23. 36士 13. 77pmol 4-MUmirT1 μ 蛋白。前者平均值為后者平均值的1. 66倍。對PCR檢測為陽性的2個Ttl代Kitaake/pActin-tGluB-4所結種子、植株莖桿和葉片進行GUS活性測定(結果如圖14，15，16)，種子GUS活性平均值為3. 8 士 2. 4pmol4-MU mirT1 μ g—1蛋白；莖桿GUS活性平均值為5. 9 士 0. 8pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白；葉片GUS活性值分別為 3. 1,1. 27pmol 4-MU mirT1 μ g—1 蛋白。而 7 個對照 Kitaake/pActin-nos 的 T0 株系中，種子⑶S活性平均值為1.75士0.8pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白；植株莖桿⑶S活性平均值為 5. 1 士4. 7pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白；葉片 GUS 活性最高值為 2. 22pmol 4-MU mirT1 μ
蛋白，最低值為0.05pmol 4-MU mirr^g—1蛋白。前者種子平均值為后者的2. 18倍；前者莖桿平均值與后者沒有明顯差別；前者葉片與后者差異不明顯。 結果表明，tGluB-4與nos終止子相比增強了外源基因在水稻胚乳中的表達水平。
權利要求
1.DNA分子，其特征在于所述DNA分子為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。
2.含有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系、重組菌或重組病
3.根據(jù)權利要求2所述的表達盒，其特征在于所述表達盒由啟動子、由所述啟動子啟動轉錄的目的基因和位于所述目的基因下游的權利要求1所述的DNA分子組成。
4.根據(jù)權利要求3所述的表達盒，其特征在于所述啟動子為組成型表達啟動子或組織特異表達啟動子，所述組織特異表達啟動子為胚乳特異性表達啟動子。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的表達盒，其特征在于所述目的基因為蛋白編碼基因和/ 或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質改良基因；所述非蛋白編碼基因為正義 RNA基因和/或反義RNA基因。
6.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求3-5中任一所述的表達盒導入目的植物中，得到所述目的基因表達水平高于將如下表達盒導入所述目的植物的轉基因植物將權利要求3所述的表達盒中的權利要求1所述的DNA分子替換為nos終止子得到的表達盒。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥，所述雙子葉植物為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。
9.權利要求1所述的DNA分子在培育轉基因植物中的應用。
10.權利要求1所述的DNA分子作為終止子的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子及其應用。該終止子為一種DNA分子，為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達和累積水平，為利用生物技術改良種子品質、分子醫(yī)藥農場等研究奠定了基礎，具有極大的應用前景。
文檔編號C12N7/01GK102260674SQ20111019762
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權日2011年7月15日
發(fā)明者曲樂慶, 李文靜 申請人:中國科學院植物研究所