專利名稱：一種好氧菌高產菌株的高通量篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于微生物誘變育種、發(fā)酵工程領域以實現(xiàn)對菌種高通量篩選的方法，尤其是一種高耗氧絲狀真菌的高通量篩選方法。
背景技術：
頭孢菌素類抗生素是國外60年代發(fā)展起來的新型β -內酰胺類抗生素，具有抗菌譜更廣、耐β -內酰胺酶、很少發(fā)生過敏反應，目前已成為全世界最暢銷的的抗感染藥物。 目前在生產量上，我國已成為頭孢菌素生產的大國，但是國內由于頭孢菌素C生產技術水平低、成本高而使頭孢菌素類藥物發(fā)展緩慢，主要原因之一是其合成原料頭孢菌素C發(fā)酵生產水平低(國內實際水平30，000u/ml左右，國外40，000u/ml)、雜質組分高造成頭孢菌素 C成本高，且頭孢菌素C轉化成7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)時只能采用污染較大的化學法。 因此優(yōu)良的頭孢菌素C高產菌株是發(fā)酵生產頭孢菌素C的關鍵。從當前我國生物技術產業(yè)來看，目前我國高產的工業(yè)生產菌種的獲得主要還是采用隨機選育，包括自然選育、誘變育種和以原生質體融合為代表的雜交育種技術，篩選工作量大，費時費力。這是因為產量性狀受多基因決定，一次誘變和篩選很難有大幅度提高，需要多輪誘變篩選才能獲得穩(wěn)定、高產的單菌落培養(yǎng)物(菌株)，每輪都是一個大量篩選的過程，這一點不同于以發(fā)現(xiàn)化合物為目標的菌種篩選。因此，擴大篩選量可以有效減少隨機篩選的盲目性特點，是提高育種效率的一個重要方面，可以說篩選是菌種選育過程成敗的一個關鍵步驟，但無論是隨機篩選還是推理選育，都受到人力物力等諸多因素的限制，使得篩選效率很低，勢必造成漏篩。因此，需要建立新的篩選方法以提高篩選效率。近幾年用于微生物菌種高通量篩選裝置及其相關技術不斷發(fā)展和成熟。特別是歐美等發(fā)達國家開發(fā)出全自動高通量篩選工作站，應用最先進的計算機技術和機器人技術， 能夠實現(xiàn)高效高通量篩選，但是此類大型設備價格相當昂貴，即使在發(fā)達國家，也只有財力雄厚的大型實驗室具備購買能力，國內企業(yè)近期內根本無法承受。因此，使用現(xiàn)有的通用低成本儀器設備，自主開發(fā)簡便、快速、精準、高效的高通量篩選技術具有重要現(xiàn)實意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種高通量篩選好氧菌高產菌株的方法，包括I.提供目標菌混合體；II.將所述混合體等分成多份混合體子集，轉移至深孔板培養(yǎng)令其生產目標產物， 每孔一個混合體子集；III.采用比濁法檢測目標產物產量，鑒定高產混合體子集；IV.對混合體子集進行稀釋培養(yǎng)獲取單菌落；V.培養(yǎng)單菌落令其生產目標產物，并通過檢測目標產物產量來鑒定高產菌株。某些實施方式中，步驟II到III重復一次或多次。某些實施方式中，所述目標產物是頭孢菌素C。
某些實施方式中，所述菌種是好氧絲狀真菌，尤其是頭孢菌素C(CPC)生產菌株， 例如頂頭孢霉、產黃頭孢霉、頭孢霉。某些實施方式中，所述混合體子集含有10-50個菌株或孢子，優(yōu)選10-30個，例如 20個。某些實施方式中，所述深孔板為M孔、48孔或96孔深孔板。某些實施方式中，步驟III用酶標儀檢測深孔板上各孔的目標產物產量。本文所述不同實施方式中的特征可以任意組合而同樣達到本發(fā)明的目的，提供本發(fā)明的效果。


圖1-①本發(fā)明實施方式之一由出發(fā)菌株誘變獲得高產混合體子集的流程圖。圖1-②本發(fā)明之一有高產混合體子集獲得純種高產菌株的流程圖。圖2 本發(fā)明實施方式之一測繪的比濁法標準曲線。
具體實施例方式本發(fā)明的目的是提供一種將微孔板培養(yǎng)技術和酶標儀檢測結合于一體的簡便、快速、精準、高效的完整高通量篩選技術。本發(fā)明方法適用于各種好氧菌，尤其是好氧絲狀真菌，例如頭孢菌素C(CPC)生產菌株。舉例來說，所述頭孢菌素C生產菌株包括頂頭孢霉(例如可購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心的GIM3. 49(其它編號AS3. 2059)、產黃頭孢霉(例如可購自中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心(CICIM-OT)的CICIM F1008)、頭孢霉(例如可購自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)的ACCC30146)等。需要說明的是，雖然以下將以頭孢菌素C生產菌株為例來說明本發(fā)明實施方式、特點和優(yōu)點，但本領域技術人員將明顯看出，本發(fā)明方法普遍適用于各種好氧菌，尤其是好氧絲狀真菌。本發(fā)明可從目標菌的非均一菌群混合體中篩選出均一的高產子集，乃至穩(wěn)定的高產單株。作為本發(fā)明待篩選原料的混合體可以是分離自自然界的初篩產物，也可以是人工誘變的產物，例如紫外誘變。菌群混合體的形式可以是細胞懸液或孢子懸液。本發(fā)明是基于多孔板培養(yǎng)和檢測技術的高通量篩選方法。本發(fā)明選用深孔板，例如M孔、48孔、96孔或更多孔的深孔板，平衡了裝液量、混合效果、供氧強度和篩選通量等多項要求。本發(fā)明方法的步驟之一是將所述菌群混合體等分成多份混合體子集，轉移至深孔板培養(yǎng)，每孔一個混合體子集，令其生產目標產物。實施方式之一將所述混合體懸液根據(jù)深孔板的裝液量(單孔)等分成若干份，分別轉移至各板各孔，每一孔含一個混合體子集。各子集可以用板號、行號和列號的組合來標記。為了減輕后續(xù)稀釋分離和單菌落培養(yǎng)工作負荷，盡量細分孢子懸液。每份混合體子集的孢子數(shù)和菌株數(shù)可以為10-50個，優(yōu)選10-30個， 例如20個。這可以通過預實驗，例如對混合體懸液進行常規(guī)稀釋分離和平板記數(shù)來估算。以獲取目標產物為目的的孔板培養(yǎng)技術是本領域所熟知的。根據(jù)感興趣的目標菌種，相關的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間等均可參照現(xiàn)有技術中的相關教導，予以采納或加以調整和改進，這些調整和改進都屬于領域技術人員的常規(guī)技能。
本發(fā)明方法的步驟之一是檢測各孔中混合體子集培養(yǎng)物的目標產物產量以確定高產混合體子集。微生物代謝產物的各種檢測方法是本領域技術人員所熟知的，均可用于本發(fā)明。較常用的有高效液相色譜(HPLC)，管碟法和比濁法等。本發(fā)明實施方式之一優(yōu)選比濁法。比濁法是將一定量的抗生素加至接種有試驗微生物的液體培養(yǎng)基內，混勻后，經(jīng)短期培養(yǎng)小時)，測定培養(yǎng)基的濁度。本發(fā)明實施方式之一以48孔板為檢定菌培養(yǎng)容器，以酶標儀為檢測儀器，實現(xiàn)了高通量的檢測，不僅快速而且其成本低廉，與常規(guī)的管碟法(2005版中國藥典)相比，大大縮短了分析時間(從18小時縮短到4小時)，每個樣品只需要50ul分析量，450ul培養(yǎng)基。更重要的是一次檢測樣品數(shù)量可達到成百上千份，而且僅需1人操作。找出最高產量的混合體子集，找到其對應的種子培養(yǎng)板和培養(yǎng)孔。可以重復前文所述深孔板培養(yǎng)和檢測步驟，從而進一步細分子集。在檢定高產混合體子集后，可由種子板上對應的種子培養(yǎng)物進行常規(guī)的稀釋分離，獲取單菌落。然后，分別培養(yǎng)和檢測各單菌落的生產能力，從中篩得高產突變株。作為實施方式之一，可將各單菌落轉移至深孔板培養(yǎng)令其生產目標產物，每孔一個單菌落，然后通過孔板檢測技術例如酶標儀檢測各孔培養(yǎng)物的目標產物產量，鑒定高產突變株。作為另一實施方式，也可以對分離的單菌落采用常規(guī)的搖瓶培養(yǎng)和檢測，例如HLPC檢測等。可選的是，還可以對篩選出的高產突變菌株進行遺傳穩(wěn)定特性檢測。例如，可以通過傳代培養(yǎng)來檢測，例如連續(xù)傳5代，對每一代進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液，測定產物產量，由此可判斷遺傳穩(wěn)定特性。以下將通過實施例對本發(fā)明進行更為具體的說明。可以理解的是，其中所用具體試劑、條件、設備都僅為本發(fā)明實施方式的示例，不作為對本申請請求保護之范圍的限定。實施例1 采用比濁法高通量檢測頭孢菌素C產量的可行性比濁法向檢測培養(yǎng)基(g/100ml 蛋白胨1. 0g、牛肉浸膏0. 3g、氯化鈉0. 5g、pH7. 2 7. 4) 中添加 5% (ν/ν)糞產堿桿菌(Bacillus foecalis alkaligenes) (ATCC31555，美國典型培養(yǎng)物保藏中心)以無菌水配制的菌懸液(0D_= 1.5)，混勻后，分裝至48深孔板中，每孔裝450 μ 1。向每孔中加含有頭孢菌素C的待測樣品50 μ 1，不加待測樣品的作為空白對照。 370C，220rpm,培養(yǎng)4_5h，以空白對照的0D_達到0. 6為終點。酶標儀600nm波長測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算樣品中頭孢菌素C的濃度。標注曲線的繪制準確稱取頭孢菌素C標準品(sigma公司，C3270-5G)，用磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀0. 41g，磷酸氫二鉀5. 59g，1000ml水，pH7. 8)稀釋到1000u/ml，然后將其依次稀釋到10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100u/ml。如上所述，將各濃度的標準品稀釋液加入糞產堿桿菌培養(yǎng)物，培養(yǎng)，測定0D·。以劑量濃度(C)的對數(shù)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。如圖2所示，曲線的二元擬合方程為Y = -0. 1031Χ+0. 6912，R = O. 9931。對50份不同來源的頭孢菌素C樣品分別用比濁法和高效液相色譜(HPLC)測定了 CPC濃度，結果見表1表1 比濁法與HPLC分別測定CPC樣品的結果比較(U/ml)
權利要求
1. 一種高通量篩選好氧菌高產菌株的方法，包括1.提供目標菌混合體；II.將所述混合體等分成多份混合體子集，轉移至深孔板培養(yǎng)令其生產目標產物，每孔一個混合體子集；III.采用比濁法檢測目標產物產量，鑒定高產混合體子集；IV.對混合體子集進行稀釋培養(yǎng)獲取單菌落；V.培養(yǎng)單菌落令其生產目標產物，并通過檢測目標產物產量來鑒定高產菌株。
2.如權利要求1所述的方法，其中的步驟II到III重復一次或多次。
3.如權利要求1所述的方法，所述目標產物是頭孢菌素C。
4.如權利要求1所述的方法，所述菌種是好氧絲狀真菌，尤其是頭孢菌素C(CPC)生產菌株，例如頂頭孢霉、產黃頭孢霉、頭孢霉。
5.如權利要求1所述的方法，所述混合體子集含有10-50個菌株或孢子，優(yōu)選10-30 個，例如20個。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，所述深孔板為M孔、48孔或96孔深孔板。
7.如權利要求1所述的方法，步驟III用酶標儀檢測深孔板上各孔的目標產物產量。
全文摘要
一種用于微生物誘變育種、發(fā)酵工程領域以實現(xiàn)對菌種高通量篩選的方法，尤其是一種好氧菌高產株的高通量篩選方法，采用了深孔板培養(yǎng)和檢測技術。
文檔編號C12R1/745GK102268378SQ20111019766
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權日2011年7月14日
發(fā)明者儲炬, 莊英萍, 張嗣良, 譚俊, 郝玉有, 郭元昕 申請人:華東理工大學