專利名稱：利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種貝類染色體數(shù)目確定方法。尤其涉及一種快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法。
背景技術(shù)：
染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的核心內(nèi)容。對(duì)貝類染色體的深入認(rèn)識(shí)，不僅可以進(jìn)行近緣種鑒定、系統(tǒng)演化研究、群落結(jié)構(gòu)分析等諸多問題的探討，而且對(duì)闡明物種的遺傳變異、發(fā)育規(guī)律以及資源的開發(fā)利用和遺傳育種均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。雙殼貝類(即瓣鰓綱)是軟體動(dòng)物門中僅次于腹足類的第二大綱，約有15000種， 分屬于6個(gè)亞綱、12個(gè)目。由于雙殼貝類染色體較小、較難獲得清晰的分裂相等原因，染色體組型研究相對(duì)魚類等動(dòng)物滯后很多。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已查明染色體數(shù)目的貝類尚不足200種，僅占此綱15000種動(dòng)物的1. 3%左右，因此從染色體角度進(jìn)行系統(tǒng)分類研究，還有很長的路要走。貝類染色體制片的常用方法有組織切片法、壓片法和滴片法。組織切片法最早使用，由于操作復(fù)雜、制片時(shí)間長、染色體易丟失或重疊等不足而被逐漸淘汰；壓片法僅適用于對(duì)4-8細(xì)胞期的早期胚胎進(jìn)行染色體觀察，且存在染色體模糊、極易發(fā)生重疊的缺點(diǎn)，故應(yīng)用范圍受到很大限制，而且準(zhǔn)確性有待提高；滴片法或空氣干燥法目前使用最為廣泛，它以擔(dān)輪幼蟲或成貝鰓絲為試材，經(jīng)過滴片和染色能得到清晰的染色體分裂相，若處理適當(dāng)制備的染色體形態(tài)較好，可進(jìn)一步進(jìn)行核型分析，但其也存在操作過程相對(duì)繁瑣、染色體易丟失、耗時(shí)費(fèi)力等諸多問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種操作簡易利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)又一個(gè)問題是提供一種結(jié)果準(zhǔn)確的利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法，其特征在于包括如下步驟①卵子固定，吸取濃縮后的卵子懸液加入離心管中，向離心管中加入4%多聚甲醛固定液進(jìn)行固定，離心后除去上清液，再加入4%多聚甲醛液固定液，繼續(xù)固定，冷藏保存， (其中第一次多聚甲醛固定液加入量與卵子懸液體積比為2 3 1 1，第二次盡量除去卵子中的水分，幾乎是純的多聚甲醛溶液)；②熒光染色，取上述卵液于離心管中，用0. lmol/L磷酸緩沖液沖洗，離心后卵子沉降下來，棄去多余的磷酸緩沖液，滴加H0ECHST 33258熒光染色液，在黑暗環(huán)境下染色 6 8min ；
③沖洗與制片，染色后用0. lmol/L磷酸緩沖液沖洗卵子，吸取卵子于載玻片上， 吸干多余水分后滴抗熒光淬滅劑，用蓋玻片封片，得到卵子染色體；④觀察與計(jì)數(shù)，在熒光顯微鏡的紫外光下觀察卵子染色體，挑選30個(gè)分裂相清晰的卵子進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，將眾數(shù)的染色體數(shù)確定為卵子染色體的數(shù)目；⑤確定貝類染色體數(shù)目，卵子染色體數(shù)目的兩倍即為該種貝類的染色體數(shù)目。進(jìn)一步，所述的4%多聚甲醛固定液采用如下方法配制將40g多聚甲醛溶于IOOOmL 0. lmol/L的磷酸緩沖液中，加熱至60 70°C，持續(xù)攪拌使之完全溶解，然后滴加NaOH液使溶液清亮，再用0. lmol/L的磷酸緩沖液定容至 IOOOmL,充分混勻即可。進(jìn)一步，所述的卵子懸液通過如下步驟制得取待產(chǎn)卵的雌貝于盛有過濾海水的容器中，雌貝就能將卵子排放入海水中，即可得到卵子懸液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于首先，取材簡單方便，僅需固定剛產(chǎn)出卵子即可，多數(shù)雙殼貝類卵子停留在第一次減數(shù)分裂中期分裂相，染色體形態(tài)清晰，便于區(qū)分， 克服了傳統(tǒng)染色體制備方法需要準(zhǔn)確把握胚胎或幼蟲發(fā)育時(shí)期的限制；其次，操作簡易，不需經(jīng)過壓片或滴片的繁瑣處理程序，直接觀察染色后的卵子，且能維持卵子中染色體的空間位置；最后，采用H0ECHST熒光染色方法，處理時(shí)間進(jìn)一步縮短，卵子染色體的染色效果更好，易于觀察和染色體計(jì)數(shù)。本方法通過對(duì)現(xiàn)有熒光染色試劑盒的固定液、固定方法、染色方法等進(jìn)行改進(jìn)，在 40 50min就可準(zhǔn)確獲得卵子的染色體數(shù)目，并據(jù)卵子染色體數(shù)目可以馬上推算出貝類二倍體染色體數(shù)。


圖1為實(shí)施例中卵子熒光染色體顯微照片。圖2為滴片法獲得的文蛤幼蟲的染色體顯微照片。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中的試劑，如無特別說明，均為普通生化試劑公司出售的常規(guī)試劑。首先配制4%多聚甲醛固定液4%多聚甲醛固定液將40g多聚甲醛溶于IOOOmL 0. lmol/L的磷酸緩沖液(pH 7. 4)中，用電爐加熱至60-70°C，持續(xù)攪拌使之完全溶解，然后滴加少許NaOH液使溶液清亮，再用0. lmol/L的磷酸緩沖液(pH 7. 4)定容至IOOOmL,充分混勻即可。實(shí)施例的操作方法如下1、卵子的采集與固定取性腺發(fā)育成熟的文蛤親貝，在浙江省寧波甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司進(jìn)行人工催產(chǎn)，催產(chǎn)方法為陰干結(jié)合流水刺激。取3 5顆剛產(chǎn)卵的雌貝于IL盛有過濾海水的燒杯中，取剛產(chǎn)出的文蛤未受精卵子，通過鏡檢選取外形規(guī)則、卵質(zhì)均勻、發(fā)育成熟的卵液，低速離心濃縮卵子，用吸管吸取2mL濃縮后的卵液于5mL離心管中，立即向離心管中加入3mL冷的4%多聚甲醛液固定lOmin，然后用吸管棄去上清液，加入5mL4%多聚甲醛液再固定lOmin，置；TC 5°C冰箱中保存2個(gè)月內(nèi)；
2、熒光染色吸取200 300顆固定好的卵子于1.5mL離心管中，用0. lmol/L磷酸緩沖液(PH 7. 4)沖洗2遍，低速離心使卵子沉降下來，棄去多余的磷酸緩沖液，約留0. ImL, 滴加2滴H0ECHST 33258熒光染色液(購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，在柜子里的黑暗環(huán)境下染色6 8min ；3、沖洗與制片加入0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 7. 4)，吸管吹打沖洗卵子2遍以除去卵外的染料浮色，低速離心30S后棄去多余緩沖液，吸取濃的卵液于載玻片上，用吸水紙吸干多余水分，滴一滴抗熒光淬滅劑(購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，然后用蓋玻片封片；4、熒光觀察與計(jì)數(shù)=Nikon 80 熒光顯微鏡的紫外光(波長為365nm)下，觀察卵子染色體(放大倍數(shù)400倍)，挑選30個(gè)分裂相清晰的卵子進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，并用冷CCD拍攝系統(tǒng)拍照。結(jié)果在30個(gè)卵子中，19條染色體的有25個(gè)(占83. 3% )，18條染色體的有 3個(gè)(占10. 0% )，17條染色體的有2個(gè)(占0. 67% )，因此將文蛤卵子染色體數(shù)目確定為 19條；5、文蛤二倍體染色體數(shù)目確定根據(jù)文蛤卵子染色體數(shù)目19條，可以推知文蛤二倍體的染色體數(shù)目為38條；6、卵子熒光觀察法與傳統(tǒng)滴片法的方法步驟和結(jié)果比較如圖1和圖2所示，分別用卵子熒光觀察法與傳統(tǒng)滴片法分析了文蛤的染色體數(shù)目，結(jié)果卵子熒光觀察法獲得文蛤卵子染色體數(shù)目19條，推知文蛤二倍體的染色體數(shù)目為 38條；而用傳統(tǒng)滴片法得到的文蛤二倍體的染色體數(shù)目也是38條。由此可見，利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法是準(zhǔn)確、可靠的。表1比較了卵子熒光觀察法與傳統(tǒng)滴片法的方法步驟和結(jié)果準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示卵子熒光觀察法具有技術(shù)難度小、操作步驟簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，尤其在實(shí)驗(yàn)總耗時(shí)上有明顯的優(yōu)勢(shì)。表1、卵子熒光觀察法與傳統(tǒng)滴片法的方法步驟和結(jié)果準(zhǔn)確性比較
權(quán)利要求
1.一種利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法，其特征在于包括如下步驟①卵子固定，吸取濃縮后的卵子懸液加入離心管中，向離心管中加入4%多聚甲醛固定液進(jìn)行固定，離心后除去上清液，再加入4%多聚甲醛液固定液，繼續(xù)固定，冷藏保存；②熒光染色，取上述卵液于離心管中，用0.lmol/L磷酸緩沖液沖洗，離心后卵子沉降下來，棄去多余的磷酸緩沖液，滴加H0ECHST 33258熒光染色液，在黑暗環(huán)境下染色6 8min ；③沖洗與制片，染色后用0.lmol/L磷酸緩沖液沖洗卵子，吸取卵子于載玻片上，吸干多余水分后滴抗熒光淬滅劑，用蓋玻片封片，得到卵子染色體；④觀察與計(jì)數(shù)，在熒光顯微鏡的紫外光下觀察卵子染色體，挑選30個(gè)分裂相清晰的卵子進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，將眾數(shù)的染色體數(shù)確定為卵子染色體的數(shù)目；⑤確定貝類染色體數(shù)目，卵子染色體數(shù)目的兩倍即為該種貝類的染色體數(shù)目。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法，其特征在于所述的4%多聚甲醛固定液采用如下方法配制將40g多聚甲醛溶于IOOOmL 0. lmol/L的磷酸緩沖液中，加熱至60 70°C，持續(xù)攪拌使之完全溶解，然后滴加NaOH液使溶液清亮，再用0. lmol/L的磷酸緩沖液定容至IOOOmL, 充分混勻即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法，其特征在于所述的卵子懸液通過如下步驟制得取待產(chǎn)卵的雌貝于盛有過濾海水的容器中，雌貝就能將卵子排放入海水中，即可得到卵子懸液。
全文摘要
一種利用卵子熒光顯微觀察快速確定雙殼貝類染色體數(shù)目的方法，其特征在于包括如下步驟①卵子固定；②熒光染色，用HOECHST 33258熒光染色液，在黑暗環(huán)境下染色6～8min；③沖洗與制片；④觀察與計(jì)數(shù)，在熒光顯微鏡的紫外光下觀察卵子染色體，挑選30個(gè)分裂相清晰的卵子進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，將眾數(shù)的染色體數(shù)確定為卵子染色體的數(shù)目；⑤確定貝類染色體數(shù)目，卵子染色體數(shù)目的兩倍即為該種貝類的染色體數(shù)目。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于取材方便，操作簡易，結(jié)果準(zhǔn)確，省時(shí)省力。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102277423SQ201110197790
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者姚韓韓, 林志華, 董迎輝, 陸榮茂 申請(qǐng)人:浙江萬里學(xué)院