專利名稱：Cyp2c19基因擴增用引物對、含有其的cyp2c19基因擴增用試劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴增CYP2C19基因的引物對、含有其的CYP2C19基因擴增用試劑及其用途。
背景技術(shù)：
細胞色素P450是被歸類為超家族的酶類，存在多個亞家族(例如CYP1A、CYPIB, CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A等)。已知，其中，作為人類CYP2C亞家族的同工酶的CYP2C19 為與藥物代謝相關(guān)的酶。而且，已經(jīng)通過對CYP2C19底物藥物(抗癲癇劑)即(S)-美芬妥英(S-M印)代謝極低的酶缺陷者(PMs)證明了編碼CYP2C19的基因(CYP2C19基因)的突變。作為與該PMs有關(guān)的重要的基因多態(tài)性，已知有CYP2C1腫2和CYP2C19*3。前者為外顯子5的鳥嘌呤(681位)變?yōu)橄汆堰实耐蛔?，成為剪接缺?splicing defect)的原因， 遺傳信息的翻譯起始位點改變。后者為外顯子4的鳥嘌呤(636位)成為腺嘌呤的突變，由于變成終止子，翻譯在突變位點被中斷。對包括日本人在內(nèi)的亞洲人解析這兩種多態(tài)性，幾乎100%可以判斷PMs，另夕卜，即便是白種人中也存在約85%，因此認為是與人種無關(guān)的主要的多態(tài)性。另外，對于這些CYP2C19基因多態(tài)性(CYP2C1腫2和CYP2C19*3)，已知除了上述 PMs之外，對例如催眠鎮(zhèn)靜劑安定代謝為N-脫甲基體(去甲安定)，奧美拉唑(0ΡΖ)、蘭索拉唑、雷貝拉唑等質(zhì)子泵阻礙劑(PPI)、抗癲癇劑苯妥英(PHT)、三環(huán)系抗抑郁劑丙咪嗪、催眠鎮(zhèn)靜劑海索比妥、瘧疾治療藥氯胍、肌肉松弛劑卡立普多等的代謝也有影響。特別是有報告指出；對于作為PPI的一種的0ΡΖ，這些CYP2C19基因多態(tài)性(CYP2C1腫2和CYP2C19*3)作為藥物應(yīng)答通過并用0ΡΖ、克拉霉素和阿莫西林三種藥物，提高了幽門螺桿菌的除菌率。因此研究CYP2C19基因的兩種多態(tài)性CYP2C1腫2和CYP2C19*3，對于預測藥物所產(chǎn)生的副作用、決定顯示更優(yōu)良效果的藥物給藥條件是極為重要的。另外，作為在基因水平解析所有疾病的原因、個體間的疾病易感性(易患疾病)、 個體間的藥效的不同等的方法，廣泛地進行點突變、所謂的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測。 點突變的通常檢測方法可以舉出；(1)利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴增試樣的目標DNA的相當于檢測對象序列的區(qū)域，再對其全基因序列進行解析的直接測序法；(2)利用PCR擴增試樣的目標DNA的相當于檢測對象序列的區(qū)域，通過隨上述檢測對象序列有無目標突變而切斷作用不同的限制酶，將該擴增產(chǎn)物切斷，進行電泳從而進行分型的RFLP解析；(3)使用目標突變位于3’末端區(qū)域的引物進行PCR，通過有無擴增來判斷突變的ASP-PCR法等。但是，這些方法例如必須進行由試樣提取的DNA的精制、電泳、限制酶處理等，因此需要功夫和成本。另外，進行PCR后，有必要暫時開啟反應(yīng)容器，因此有上述擴增產(chǎn)物混入到之后的反應(yīng)體系內(nèi)、解析精度降低的顧慮。而且，由于自動化困難，因此無法解析大量的樣品。另外，上述(3)的ASP-PCR法，還存在特異性低的問題。由該問題出發(fā)，近年來作為點突變的檢測方法，正在實施對由目標核酸和探針形成的雙鏈核酸的融解溫度(Tm)進行解析的方法。這種方法由于通過Tm解析或上述雙鏈的融解曲線的解析來進行，因此稱作融解曲線解析。其為如下的方法。即，首先使用與含有檢測目標的點突變的檢測對象序列互補的探針，形成檢測試樣的目標單鏈DNA與上述探針的雜交體(雙鏈DNA)。接著，對該雜交形成體實施加熱處理，通過吸光度等的信號的變動來檢測隨著溫度上升的雜交體的解離(融解)。然后，根據(jù)該檢測結(jié)果決定Tm值，從而判斷有無點突變。在雜交形成體的同源性越高時Tm值越高、同源性越低時Tm值越低。因此，對于含有點突變的檢測對象序列和與其互補的探針形成的雜交形成體，預先求得Tm值(評價標準值)，測定檢測試樣的目標單鏈DNA和上述探針的Tm值(測定值)。上述測定值與評價標準值相同時，則可以判斷為匹配、即目標DNA存在點突變，測定值低于評價標準值時，則可以判斷為錯配、即目標DNA上不存在點突變。而且，通過該方法還可以實現(xiàn)自動化。但是，對于利用這種Tm解析的檢測方法，存在PCR中必需特異且高效地擴增含有檢測目標位點的區(qū)域的問題。特別是，細胞色素P450如上所述是被歸類為超家族的酶類， 在屬于同一亞家族(CYP2C亞家族)的分子種類中，存在同源性非常高的同工酶，編碼它們的序列也極為類似。因此在PCR中，有CYP2C19以外的同工酶的編碼基因也被擴增的顧慮。另外，其它同工酶的編碼基因也被擴增的情況，也成為例如CYP2C19基因的特定多態(tài)性 (CYP2C19M或CYP2C19*； )解析(非專利文獻1和非專利文獻幻中解析結(jié)果可靠性降低的原因。而且，象這樣，由于解析1個樣品上也需要大量的勞力，因此還具有解析大量樣品并不實用的問題。非專利文獻1 =PMID :8195181 J Biol Chem. 1994 Jun 3 ；269 (22) :15419-22.非專利文獻2 =PMID :7969038 Mol Pharmacol. 1994 Oct ；46 (4) :594-8.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題因此，本發(fā)明的目的在于提供用于利用基因擴增法特異地擴增CYP2C19基因的目標區(qū)域的引物對。用于解決課題的方法為了達成上述目的，本發(fā)明的引物對，其特征在于，其為用于利用基因擴增法擴增 CYP2C19基因的引物對，含有下述引物對(1)和O)中的至少1個引物對。引物對(1)包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(Fl)與序列號1的堿基序列中的、以第1341位的腺嘌呤堿基㈧作為第1堿基、 朝向5’方向至第25 41個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基(A)為3’末端(Rl)與序列號1的堿基序列中的、以第1442位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基、
6朝向3’方向至第19 M個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第 1442位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端引物對O)包含含有下述(F》的寡核苷酸的正向引物和含有下述(似)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第143位的腺嘌呤堿基㈧作為第1堿基、 朝向5’方向至第23 37個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基(A)為3’末端(R2)與序列號1的堿基序列中的、以第231位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基、朝向3’方向至第18 30個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第231位的胸腺嘧啶堿基(T)互補的腺嘌呤堿基(A)作為3’末端另外，本發(fā)明的基因擴增用試劑，其特征在于，是用于利用基因擴增法擴增 CYP2C19基因的試劑，含有上述本發(fā)明的CYP2C19基因擴增用引物對。本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，其特征在于，其為利用基因擴增法制造CYP2C19 基因的擴增產(chǎn)物的方法，包含下述(I)工序。(I)以試樣中的核酸作為模板，使用本發(fā)明的CYP2C19基因擴增用引物對，在反應(yīng)液中擴增上述CYP2C19基因的工序本發(fā)明的多態(tài)性解析方法，其特征在于，其為解析CYP2C19基因的檢測對象位點的多態(tài)性的方法，包括下述(i) (iv)工序。(i)利用本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制造方法，在反應(yīng)液中擴增CYP2C19基因中含有檢測對象位點的區(qū)域的工序(ii)準備反應(yīng)液的工序，所述反應(yīng)液含有上述(i)工序的擴增產(chǎn)物和能夠與上述檢測對象位點雜交的探針(iii)改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴增產(chǎn)物與上述探針的雜交形成體顯示融解狀態(tài)的信號值的工序(iv)由伴隨溫度變化的上述信號值的變動，決定上述檢測對象位點的多態(tài)性的工序發(fā)明效果利用本發(fā)明的引物對，可以在反應(yīng)液中特異且高效地擴增CYP2C19基因中含有檢測目標的多態(tài)性(CYP2C1腫2或CYP2C19*3)發(fā)生位點的目標區(qū)域。因此，與上述的現(xiàn)有方法不同，可以減少功夫和成本。另外，由于如此特異地擴增CYP2C19基因中含有發(fā)生特定的多態(tài)性的檢測對象位點的區(qū)域，再通過例如使用與含有檢測對象位點的檢測對象序列互補的探針，可以使用上述反應(yīng)液直接進行Tm解析、將上述多態(tài)性分型。另外，由于可以在一個反應(yīng)液中進行上述目標區(qū)域的擴增、多態(tài)性的分型，因此還能夠?qū)崿F(xiàn)操作的自動化。而且， 當使用本發(fā)明的引物對時，例如即便是含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等)，也可以省略預處理、更為迅速且簡單地進行擴增反應(yīng)。另外，當使用本發(fā)明的引物對時，可以以優(yōu)于以往的擴增效率進行擴增反應(yīng)，因此還能夠縮短擴增反應(yīng)。因而，利用本發(fā)明的引物對、 含有其的試劑以及使用它們的擴增產(chǎn)物的制造方法，可以迅速且簡單地解析CYP2C19基因的多態(tài)性，因此在醫(yī)療領(lǐng)域中極為有效。


圖1為表示本發(fā)明實施例1的Tm解析結(jié)果的圖表。圖2為表示本發(fā)明實施例2的Tm解析結(jié)果的圖表。
具體實施例方式〈CYP2C19基因擴增用引物對〉本發(fā)明的CYP2C19基因擴增用引物對如上所述，其特征在于，含有上述引物對 ⑴和⑵中的至少1個引物對。通過含有至少任1個引物對，例如可以特異地擴增CYP2C19 基因中的特定目標區(qū)域。本發(fā)明的CYP2C19基因擴增用引物對例如可以僅含有上述引物對(1)和(2)中的任一種，還可以含有引物對(1)和( 兩者。在后敘述，利用引物對(1)能夠特異地擴增的目標區(qū)域為CYP2C19基因中含有多態(tài)性CYP2C1腫2發(fā)生位點的區(qū)域，利用引物對O)能夠特異地擴增的目標區(qū)域為CYP2C19基因中含有多態(tài)性CYP2C19*3發(fā)生位點的區(qū)域。如上所述，已知CYP2C19基因的這兩種多態(tài)性全部為對藥物代謝具有影響的多態(tài)性，因此重要的是不僅對任一種進行研究，還要對全部兩種進行研究。但是，以往方法具有在一個反應(yīng)體系內(nèi)無法解析多個序列的問題。認為這是由于如上所述，CYP2C存在多個同工酶，因此在PCR中，CYP2C19以外的同工酶的編碼基因也被擴增。因而，為了研究CYP2C19 基因的兩種多態(tài)性(CYP2C1腫2和CYP2C19*3)的全部兩種，有必要在各自的反應(yīng)體系中分別擴增含有各個多態(tài)性發(fā)生位點的區(qū)域，分別對所得擴增產(chǎn)物進行解析。如此，在以往的方法中，難以僅將CYP2C基因中的CYP2C19基因作為模板、且在CYP2C19基因中僅特異地擴增分別含有上述多態(tài)性發(fā)生位點的兩種目標區(qū)域。而且，由于解析1個樣品也需要大量勞力， 因此具有解析大量樣品并不實用的問題。與此相反，通過本發(fā)明的CYP2C19基因擴增用引物對，即便是含有上述引物對(1)和( 全部兩種時，也可以在同一反應(yīng)液中同時且特異地擴增各個目標區(qū)域。因此，與上述以往方法不同，可以減少功夫和成本。另外，由于可以在同一反應(yīng)液中特異地擴增2個目標區(qū)域，通過使用例如與各個目標區(qū)域的檢測對象序列互補的探針，可以使用上述反應(yīng)液直接進行Tm解析，分別對上述兩種多態(tài)性進行分型。如此， 由于可以在同一反應(yīng)液中解析CYP2C19基因的兩種多態(tài)性，本發(fā)明的CYP2C19基因擴增用引物對例如在含有引物對(1)和O)的任一種時當然優(yōu)選，在含有兩種時也優(yōu)選。使用這種CYP2C19基因引物對，當然可以擴增1個目標區(qū)域，當同時擴增2個目標區(qū)域時，則可以較以往更為高效地進行CYP2C19基因的多態(tài)性解析。予以說明，以下有時將正向引物稱作F引物、將反向引物稱作R引物。上述引物對(1)如上所述，為包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對。(Fl)與序列號1的堿基序列中的、以第1341位的腺嘌呤堿基㈧作為第1堿基、 朝向5’方向至第25 41個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基(A)為3’末端(Rl)與序列號1的堿基序列中的、以第1442位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基、 朝向3’方向至第19 M個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1442位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端序列號1所示的堿基序列是含有人10號染色體的CYP2C19基因的外顯子4和外顯子5的基因組DNA序列，序列號1中，1 161的區(qū)域表示外顯子4、1323 1449的區(qū)域表示外顯子5，二者之間為內(nèi)含子。上述引物對(1)為用于擴增含有序列號1的第1342位 第1441位的區(qū)域的DNA 鏈及其互補鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)的第1361位的堿基(序列號1的第1361位堿基)存在對CYP2C19的功能具有影響的點突變(1361G、1361A)，該多態(tài)性為上述的CYP2C19*2。本發(fā)明中，該位點的多態(tài)性在為純合子時用1361G/G、1361A/A表示，在為雜合子時用1361G/A 表示。予以說明，序列號1的第1361位的堿基相當于CYP2C19基因的mRNA中外顯子5的第681位堿基，因此CYP2C1腫2多態(tài)性例如還可以表示為681G/G、681A/A、681G/A。以下，將該引物對(1)也稱作“CYP2C1腫2用引物對”。予以說明，在僅解析CYP2C1腫2的多態(tài)性時， 可以僅使用CYP2C1腫2用引物對。本發(fā)明中，引物對(1)的Fl引物和Rl弓丨物，只要決定DNA聚合酶的擴增起始點的 3'末端堿基滿足上述條件即可。如此，通過固定各引物的3’末端的堿基，可以充分地防止引物對(1)結(jié)合在例如類似的其它同工酶的基因(例如CYP2C8、CYP2C9、CYP2C17、CYP2C18
基因等)上。這樣，F(xiàn)l引物和Rl引物只要其3'末端的堿基被固定即可，因此各引物的長度本身并無特別限定，可以適當調(diào)整至普通的長度。作為引物長度的一例，例如為13 50mer 的范圍、優(yōu)選為14 45mer、更優(yōu)選為15 40mer。作為具體例，上述Fl引物優(yōu)選為如下的寡核苷酸與序列號1的堿基序列中的、以第1341位的腺嘌呤堿基(A)作為第1堿基、朝向5，方向至第25 41個堿基(優(yōu)選第27 38個堿基、更優(yōu)選第四 34個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸。另外，上述Rl引物優(yōu)選是如下的寡核苷酸與序列號1 的堿基序列中的、以第1442位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基、朝向3’方向至第19 M 個堿基(優(yōu)選第20 23個堿基、更優(yōu)選第20 22個堿基)的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸。予以說明，由于Fl引物和Rl引物的3'末端被固定，因此由引物延伸的區(qū)域如上所述例如為序列號1的第1342 第1441區(qū)域，所得擴增產(chǎn)物的整個長度隨所用引物的長度而改變。另外，Rl引物可以是與序列號1所示的堿基序列并非完全互補的寡核苷酸、Fl引物可以是與上述堿基序列的互補鏈并非完全互補的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端的堿基以外的部分中，可以與完全互補的寡核苷酸有1個 5個堿基不同。以下舉出Fl引物和Rl引物的具體例子，本發(fā)明并非限于此。另外，對這些Fl引物和Rl引物的組合并無任何限定，這些中，特別優(yōu)選包含含有序列號3或序列號12的寡核苷酸的F1’引物和含有序列號20或序列號22的寡核苷酸的R1’引物的引物對(1’)。 予以說明，下表中的“Tm(°C )”是下表的序列和與其完全互補的序列雜交時的Tm(°C )， 通過MELTCALC軟件(http://www.meltcalc. com)，使參數(shù)為寡核苷酸濃度0. 2 μ M、鈉當量(Naeq.)50mM而計算的數(shù)值(以下相同)。上述Tm值例如通過目前已知的MELTCALC 軟件(http://www.meltcalc.com)等計算，另外，還可以通過鄰接法(Nearest Neighbor Method)決定(以下相同)。表 1
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測CYP2C19基因的多態(tài)性的探針，其特征在于，其是含有下述寡核苷酸(1)的探針和含有下述寡核苷酸O)的探針的組合， 寡核苷酸(1)與序列號1中的、以第1373位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基、朝向5’ 方向至第16 觀個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基作為3’末端；寡核苷酸O)與序列號1中的、以第146位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基、朝向3’ 方向至第18 25個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基作為5’末端， 和與序列號1中的、以第150位的胞嘧啶堿基(C)作為第1堿基、朝向3’方向至第14 19個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基作為5’末端中的至少一種寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中，所述寡核苷酸(1)為序列號53 65的任一寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其中，所述寡核苷酸(1)為序列號61和64的任一寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中，所述寡核苷酸( 為序列號66 79的任一寡核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的探針，其中，所述寡核苷酸( 為序列號69和76的任一寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中，所述寡核苷酸(1)為序列號61的寡核苷酸，所述寡核苷酸( 為序列號69的寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中，所述寡核苷酸(1)為序列號64的寡核苷酸，所述寡核苷酸( 為序列號76的寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中，所述探針為熒光標記探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針，其中，所述探針為末端的胞嘧啶殘基被標記的熒光標記探針。
10.一種用于檢測CYP2C19基因的多態(tài)性的試劑，其特征在于，其包含權(quán)利要求1所述的含有所述寡核苷酸(1)的探針和含有所述寡核苷酸( 的探針。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑，其進一步含有用于擴增CYP2C19基因的引物對(1) 和(2)，引物對⑴包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(Fl)與序列號1的堿基序列中的、以第1341位的腺嘌呤堿基㈧作為第1堿基、朝向 5’方向至第25 41個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基㈧為3’末端(Rl)與序列號1的堿基序列中的、以第1442位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基、朝向3’方向至第19 M個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1442 位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端引物對⑵包含含有下述(^)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(似)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第143位的腺嘌呤堿基㈧作為第1堿基、朝向 5’方向至第23 37個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基㈧為3’末端(R2)與序列號1的堿基序列中的、以第231位的胸腺嘧啶堿基⑴作為第1堿基、朝向3’方向至第18 30個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第 231位的胸腺嘧啶堿基(T)互補的腺嘌呤堿基(A)作為3’末端。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑，其中，所述引物對(1)和( 分別為下述引物對(1’) 和⑵)，引物對(1，)包含含有下述(Fl’ )的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl’ )的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(F1’)含有序列號3的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號12的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸(Rl’ )含有序列號20的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號22的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸引物對(2’ )包含含有下述(F2’ )的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2’ )的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(F2’ )含有序列號27的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號32的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸(R2’ )含有序列號40的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號48的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑，其中，所述引物對(1)包含含有序列號12和3的至少一個寡核苷酸的正向引物；和，含有序列號22和20的至少一個寡核苷酸的反向引物，所述引物對( 包含含有序列號32和27的至少一個寡核苷酸的正向引物；和，含有序列號48和40的至少一個寡核苷酸的反向引物。
14.一種多態(tài)性解析方法，其特征在于，其為解析CYP2C19基因中的檢測對象位點的多態(tài)性的方法，包括下述(i) (iv)工序，(i)以試樣中的核酸作為模板，在反應(yīng)液中擴增CYP2C19基因中含有檢測對象位點的區(qū)域的工序，( )準備反應(yīng)液的工序，其中所述反應(yīng)液含有上述(i)工序的擴增產(chǎn)物和、權(quán)利要求1 所述的含有所述寡核苷酸(1)的探針和含有所述寡核苷酸O)的探針，(iii)改變所述反應(yīng)液的溫度，測定所述擴增產(chǎn)物與所述各探針的雜交形成體顯示融解狀態(tài)的信號值的工序，(iv)由伴隨溫度變化的所述信號值的變動，決定所述檢測對象位點的多態(tài)性的工序。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多態(tài)性解析方法，其中，在所述(i)工序中，在擴增反應(yīng)之前，向所述反應(yīng)液中添加權(quán)利要求1所述的含有所述寡核苷酸(1)的探針和含有所述寡核苷酸⑵的探針。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多態(tài)性解析方法，其中，在所述(i)工序中，使用下述引物對(1)和(2)在反應(yīng)液中進行所述CYP2C19基因的擴增，引物對⑴包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(Fl)與序列號1的堿基序列中的、以第1341位的腺嘌呤堿基㈧作為第1堿基、朝向 5’方向至第25 41個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基㈧為3’末端(Rl)與序列號1的堿基序列中的、以第1442位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1堿基、朝向 3’方向至第19 M個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第1442 位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端引物對⑵包含含有下述(^)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(似)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(F2)與序列號1的堿基序列中的、以第143位的腺嘌呤堿基㈧作為第1堿基、朝向 5’方向至第23 37個堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基㈧為3’末端(R2)與序列號1的堿基序列中的、以第231位的胸腺嘧啶堿基⑴作為第1堿基、朝向3’方向至第18 30個堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第 231位的胸腺嘧啶堿基(T)互補的腺嘌呤堿基(A)作為3’末端。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多態(tài)性解析方法，其中，所述試樣為生物試樣。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多態(tài)性解析方法，其中，所述生物試樣為全血。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多態(tài)性解析方法，其中，所述反應(yīng)液中全血試樣的添加比例為0.1 0.5體積％。
全文摘要
本發(fā)明提供一種引物對，其為用于利用基因擴增法擴增CYP2C19基因中的含有檢測目標位點的目標區(qū)域的引物對，其能夠特異地擴增上述區(qū)域。使用分別包含含有序列號12和序列號32的堿基序列的正向引物和含有序列號22和序列號48的堿基序列的反向引物的2對引物對。通過使用該引物對，可以在同一反應(yīng)液中同時擴增CYP2C19基因的分別含有兩種多態(tài)性(CYP2C19基因*2、CYP2C19*3)發(fā)生位點的2個區(qū)域。
文檔編號C12N15/11GK102277424SQ20111020000
公開日2011年12月14日 申請日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者吉永由紀, 間島智史 申請人:愛科來株式會社